本专利申请要求2015年9月30日提交的美国临时专利申请号62/235,144的权益，将其通过引用以其全文结合在此。
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背景技术：
尽管在对抗某些癌症(如儿童期白血病、霍奇金氏病和睾丸癌)方面正在实现一些有效的治疗方法，并且一些常见癌症(例如乳腺癌、前列腺癌)的死亡率随着对患者进行的关于早期检测和预防的教育的进展而下降，数十年来，患有许多晚期癌症的患者的存活率没有显著地变化。因此，癌症仍然是美国第二大常见死因。
正如其名称所暗示的，癌症干细胞(csc)是具有干细胞样多能性和不受限的自我更新特征的癌细胞亚群。因此，认为此细胞亚群对肿瘤形成和对其环境的适应负责。现在有几条证据表明，csc可能对癌症抗药性、转移和复发负责，特别是在微小残留病的情况下。实际上，最近的临床证据显示，在标准护理疗法后存活的乳腺癌细胞部分在具有csc标志的细胞中富集(creighton等人，2009)。在类似的研究中，尽管已经进入了临床和细胞遗传学缓解，但具有5q缺失mds的患者的骨髓中还发现有残留的恶性干细胞群(tehranchi等人，2010)。在许多临床适应症中，现在认为尽管最初有治疗反应，抗性癌细胞的不同亚群的保留可导致复发和潜在的转移。
自从最初鉴定以来，已经在许多肿瘤类型中发现和验证了癌症干细胞。在aml的模型中最初鉴定csc(lapidot等人，1994)后，在许多血液学和实体瘤恶性肿瘤中发现和验证了csc。实体瘤中csc的第一个证据来自乳腺癌，其中发现csc具有cd44+/cd24-表面标记表型(al-hajj等人，2003)。在胰腺癌中的csc也已被很好地表征。虽然各种报道将胰腺csc鉴定为epcam+/cd44+/cd24+(li等人，2007)或cd133+(hermann等人，2007)，但是其他报道则报道，三重阳性epcam+/cd44+/cd24+标志追踪csc的致瘤表型最好(vanvlerken等人，2013)。报道鉴定了结直肠癌中的csc，并且研究已经鉴定了小鼠中肠道和结直肠肿瘤的干细胞来源(barker等人，2009)。然而，本领域的当今技术水平尚未就人类csc的表面标记表型达成共识。尽管已报道了很多表面标记，如cd66(gemei等人，2013)、lgr5(hirsch等人，2014)以及cd44和cd133(wang等人，2012)，但该领域缺乏对以下的任何稳固的证实，即这些表面标记表型中的任何一种都可以代表人类csc的共有表型，其允许其他技术如非粘附球体生长(例如，肿瘤球体(tumorsphere))以在鉴定csc的存在上找到共同用途。
虽然对传统和新开发的抗癌症治疗(例如化学治疗、放射治疗、手术治疗)基于它们缩小肿瘤的能力进行了评估，但这些治疗可能无法有效抑制或杀死癌症干细胞，这可能导致癌症复发和耐药性。此外，因为癌症干细胞与转移相关，所以不会抑制或杀死癌症干细胞的治疗在长期疾病治疗或患者存活中可能是无效的。因此，鉴定和开发能够靶向和消除csc群体的新颖药物至关重要，因为此类药物正在成为对癌症的任何成功的治疗的关键组成部分。当前的研究显示，即使在最初的成功治疗干预后，csc也对癌症的化学抗性、转移和最终复发负责。尽管csc是由驱动胚胎干细胞多能性的相同主要自我更新通路驱动的，但是对驱动csc活性的其他细胞通路的了解仍然有限。
因此，用于治疗癌症的另外的组合物和方法(包括用于减少癌症的致瘤性和抑制或杀死癌细胞尤其是癌症干细胞(例如，诱导细胞凋亡或分化)的方法)的可获得性将允许更多的治疗选择并且保持更好的临床结果(如疾病缓解和/或患者生活质量的改善)的潜力。
技术实现要素：
在一个方面，本披露涉及一种用于抑制癌症干细胞(csc)增殖的方法，该方法包括使csc与lox1的抑制剂以有效抑制csc增殖和/或减少csc存活的量接触。
在一个方面，本披露涉及一种用于在先前已经接受疗法并且需要治疗的受试者中对耐治疗性癌症进行治疗的方法，该方法包括以有效抑制或杀死存在于该耐治疗性癌症中癌症干细胞(csc)的量向该受试者给予lox1的抑制剂。在一些实施例中，该方法可包括以有效诱导存在于该耐治疗性癌症中的癌症干细胞(csc)的分化的量向受试者给予lox1的抑制剂。
在一个方面，本披露涉及一种用于在先前已经接受疗法并且需要治疗的受试者中对耐治疗性癌症进行治疗的方法，该方法包括以有效治疗该耐治疗性癌症的量向该受试者给予lox1的抑制剂。
在一个方面，本披露涉及一种用于治疗包含癌症干细胞(csc)的癌症的方法，该方法包括以有效靶向并抑制或杀死该癌症中的csc的量向需要治疗的受试者给予lox1的抑制剂。在一些实施例中，该方法可包括以有效诱导存在于该癌症中的癌症干细胞(csc)的分化的量向受试者给予lox1的抑制剂。
在一个方面，本披露涉及一种用于治疗包含癌症干细胞(csc)的癌症的方法，该方法包括以有效治疗该癌症的量向需要治疗的受试者给予lox1的抑制剂。
在一个方面，本披露涉及一种用于在患有重现或复发的癌症的受试者中治疗癌症的方法，该方法包括以有效抑制或杀死该癌症中的csc的量向受试者给予lox1的抑制剂。在一些实施例中，该方法可包括以有效诱导存在于该再发或复发性的癌症中的癌症干细胞(csc)的分化的量向该受试者给予lox1的抑制剂。
在一个方面，本披露涉及一种用于在患有重现或复发的癌症的受试者中治疗癌症的方法，该方法包括以有效治疗该癌症的量向受试者给予lox1的抑制剂。
在一个方面，本披露涉及一种用于预防癌症重现或复发的方法，该方法包括以有效预防癌症重现或复发的量向需要预防癌症重现或复发的受试者给予lox1的抑制剂。
在另一个方面，本披露涉及一种用于降低患有癌症的受试者的癌症复发风险的方法，该方法包括以有效抑制或杀死该癌症中的csc的量向该受试者给予lox1的抑制剂，从而降低该受试者中癌症复发的风险。在一些实施例中，该方法可包括以有效诱导存在于该癌症中的癌症干细胞(csc)的分化并降低该癌症的复发或重现的风险的量向受试者给予lox1的抑制剂。
在另一个方面，本披露涉及一种消除癌症干细胞(csc)的方法，该方法包括使该csc与有效消除该csc的量的lox1的抑制剂接触。
在一个方面，本披露涉及一种选择性地减少癌细胞群中的癌症干细胞(csc)的数目的方法，该方法包括使该癌细胞群与有效抑制或杀死该癌细胞群中的csc的量的lox1的抑制剂接触。在一些实施例中，该方法可以包括以有效诱导该癌细胞群中癌症干细胞(csc)的分化并减少csc的数目的量向受试者给予lox1的抑制剂。
在另一个方面，本披露提供了一种用于减少或抑制肿瘤生长的方法，该方法包括使该肿瘤与有效减少或抑制肿瘤生长的量的lox1的抑制剂接触。在相关方面，本披露提供了一种用于减少或抑制患者中的肿瘤生长的方法，该方法包括以有效减少或抑制肿瘤生长的量向该患者给予lox1的抑制剂。
在另一个方面，本披露提供了一种用于减小肿瘤大小的方法，该方法包括使该肿瘤与有效减小肿瘤大小的量的lox1的抑制剂接触。在相关方面，本披露涉及一种用于减少患者肿瘤大小的方法，该方法包括以有效减小肿瘤大小的量向患者给予lox1的抑制剂。
在另一个方面，本披露提供了一种用于抑制、减少或预防肿瘤侵袭或转移的方法，该方法包括使该肿瘤与有效抑制、降低或预防肿瘤侵袭或转移的量的lox1的抑制剂接触。在相关方面，本披露涉及一种用于抑制、减少或预防患者中的肿瘤侵袭或转移的方法，该方法包括以有效抑制、减少或预防肿瘤侵袭或转移的量向该患者给予lox1的抑制剂。
在另一方面，本披露提供了用于在需要化学治疗的患者中抑制、减少或预防化学治疗相关的心脏毒性的方法，该方法包括以有效抑制、减少或预防化学治疗相关心脏毒性的量向该患者给予lox1的抑制剂。在一个实施例中，化学治疗是蒽环类，例如阿霉素。在一个实施例中，lox1抑制剂是lox1抗体。
本披露还涉及lox1的抑制剂或其组合在组合物(包括治疗和药物组合物)中的一种或多种用途。在实施例中，这些用途和组合物包括有效提供在此披露的各种方法的量的一种或多种抑制剂。在实施例中，该一种或多种用途涉及用以制造用于治疗(例如，杀死、消除、抑制、减少细胞增殖的进展和/或细胞增殖的进展速率，减少疾病状态的进展和/或疾病状态的进展速率，减少自我更新和扩增(例如诱导分化)的能力)在此所述的肿瘤、癌症干细胞和/或癌症中的一种或多种的药物的用途。
在另一个方面，本披露提供了用于包含癌细胞的样品中癌症干细胞(csc)的存在的诊断、预后、量化、鉴定、和/或检测的方法，其中该方法包括：
使该样品与结合至lox1核酸序列或lox1氨基酸序列的药剂接触；
检测在该药剂和该lox1核酸序列或该lox1氨基酸序列之间是否存在结合；和
当检测在该药剂和该lox1核酸序列或该lox1氨基酸序列之间的结合时，鉴定该样品中该csc的存在。
在此方面的实施例中，该方法可进一步包括以下项中的一个或多个：
量化该样品中的lox1核酸序列或lox1氨基酸序列的量；
将该lox1核酸序列或该lox1氨基酸序列的量与lox1核酸或lox1氨基酸的参比水平进行比较；和/或
当检测到的量大于该参比水平时，鉴定该样品中该csc的存在。
在又另外的实施例中，该方法可以包括含可检测部分的药剂。在一些实施例中，该药剂可以包含在严格杂交条件下与lox1核酸序列的至少一部分(例如，mrna、cdna等)杂交的核酸序列。在一些实施例中，该药剂可以包括特异性结合lox1氨基酸序列的至少一部分的抗体。
在以上方面的各个实施例中，这些方法涉及表达lox1的肿瘤和/或csc或csc细胞群。在另外的实施例中，该肿瘤和/或csc或csc细胞群可以包括形成球体的csc。
在以上方面的各个实施例中，这些方法涉及选自结直肠癌、胰腺癌、肺癌、头颈癌、胃癌、肝细胞癌、肾上腺癌、白血病、黑色素瘤、骨髓瘤、前列腺癌、甲状腺癌和乳腺癌的肿瘤和/或癌症。
在此所述的方面和实施例涉及包括lox1的抑制剂、lox1的抑制剂的组合和/或其他的癌症治疗剂的方法。在一些实施例中，该抑制剂包含结合lox1的抗体、lox1的小分子抑制剂、与编码lox1的核酸杂交的sirna或其任何组合。
以上方面和实施例还涉及如下方法、用途和组合物，其进一步包括用于治疗或管理与血管生成、肿瘤发生和癌症相关的疾病的另外疗法，并且可以包括治疗方案，如例如化学治疗、放射治疗、免疫疗法或本领域已知的任何其他活性剂或疗法。
通过阅读下面的说明和示例的描述，其他方面对于本领域技术人员将是显而易见的。
附图说明
出于说明本披露的目的，在附图中描绘了本披露的某些方面。然而，本披露不限于附图中所描绘的方面的精确安排和手段。
图1a-1c显示了csc从胰腺pdx模型的富集。(a)源自晚期和转移性胰腺癌的三种胰腺pdx模型的h&e染色。(b)由a中示出的pdx模型产生的肿瘤球体。(c)在第4天分析肿瘤球体表达指示胰腺csc(cd24和cd44)的表面标记以及鉴定为维持csc状态的基因(ezh2、bmi1、sox2和nanog)两者。
图2示出了用于鉴定能够抑制csc的darpin的广义筛选级联策略。首先使用阴性选择除去非目的蛋白，并且然后对从胰腺pdx模型产生的csc肿瘤球体进行阳性选择。证实了darpin与csc而不是正常细胞结合的特异性，并且在测定中测试了这些darpin抑制csc和鉴定的一个或多个darpin靶标的能力。
图3a-3b示出了darpin(stem0268)与胰腺csc而非正常细胞的结合。(a)stem0268与facs分离的(通过cd24+、cd44+、epcam+分选)胰腺csc(右图)结合，但不与正常胰腺上皮细胞结合(左图)。插图显示了由fmat分析结合的细胞的更明亮的视野图像。(b)泳道1是抗epcam；泳道2是抗mhc1-af488；泳道3是细胞+活性染料；泳道4是e-3-5；泳道5是darpinstem0268；泳道6是未染色的细胞。stem0268不与正常支气管上皮或结肠上皮细胞结合，并示出了与肾上皮细胞的最小结合。
图4a-4c示出了stem0268与胰腺癌细胞结合并在csc上富集。与两个对照darpin-fc相比，stem0268与pdx模型pa-0165(a)和pa-0143(b)结合。然而，虽然stem0268表现出对总肿瘤细胞的一定结合，但其示出高度增加的与csc的结合(c)。
图5a-5c示出stem0268抑制胰腺csc。stem0268示出在pa-0143(a)和pa-0165(b)中对球体形成的抑制。通过ezh2高细胞的数量(对照＝不相关的darpin对照)测量，stem0268还抑制hpac细胞系中的csc。在5a和5c中示出的实验也使用盐霉素(1μm)作为阳性对照。
图6a-6c描述了将lox1鉴定为stem0268的靶标的实验。(a)hek293过表达不同蛋白的facs分析。中间的图显示stem0268与表达lox1的细胞的结合。对照不包括过表达fcγr2b(“fcgr2b”)的质粒和细胞。示出了与表达非靶标蛋白(s1pr2和bmpr1a)的hek293细胞结合的stem0268的实例。(b)带有flag-标记的重组人类lox1的elisa示出stem0268的结合。对照包括不与人类蛋白结合的两种darpin-fc(对照1和2)以及单独的抗flag抗体和二级抗体。(c)stem0268与重组人类lox1的octet结合。
图7a-7c证明了在多个模型中通过lox1抑制剂对csc的抑制。(a)与图5a和图5b中使用的胰腺pdx模型中的darpinstem0268相比，lox1单克隆抗体lx5140110对csc的相似水平的抑制。lx5140110在额外的胰腺细胞系(b)以及结直肠细胞系(c)中抑制csc。
图8a-8b描绘了通过lx5140110在胰腺癌中体内抑制csc。(a)如预期的那样，lx5140110导致pa0143生长的适度下降，尤其当靶向肿瘤模型中的小百分比csc时。p<0.0001tukey的多重比较测试，lx5140110与载体和igg1处理的臂相比较。(b)用lx5140110处理后，pa0143中的csc减少。
图9a-9b证明了lx5140110和吉西他滨的组合能够抑制csc。(a)pan02.13胰腺细胞系生长受吉西他滨(gem)抑制。(b)用pan02.13与吉西他滨治疗导致pan02.13中的csc增加，其可以被lx5140110而不是非特异性对照igg1逆转。
图10a-10b示出阿霉素可以增加lox1的表达。(a)用阿霉素处理的人类主动脉内皮细胞示出lox1的表达增加。使用氧化的ldl(oxldl)作为对照。(b)用阿霉素处理的心肌细胞也示出了lox1表达的增加。
图11a-11b描述了阿霉素诱导的心肌细胞损伤和lx5140110逆转损伤的能力。(a)用阿霉素(dox)处理的心肌细胞具有增加的钙水平，其示出了心肌细胞功能障碍。这些水平由lx5140110逆转。(b)用dox处理的心肌细胞示出了降低的活力，而用lx5140110预处理的心肌细胞示出了增加的细胞活力。
具体实施方式
在此描述的本发明首次证明，凝集素样氧化低密度脂蛋白受体-1(lox1)由csc过表达，并且是csc中功能相关的治疗靶标。虽然有报道指出了在一些癌症中潜在的lox1表达，但是所有报道均未鉴定针对任何csc表型的lox1表达和功能，这提供了用于治疗癌症、癌症转移以及尤其是抑制csc的新的且意想不到的方法。如在此披露的某些方面和非限制性实施例中所示，靶向和抑制lox1活性的新方法对于包括和展现具有csc表型的细胞的癌症是有用和有效的。在一些说明性的实施例中，在此披露的方法和药剂可用于靶向包含表达lox1的csc细胞的癌症，包括例如胰腺癌、结直肠癌、肝细胞癌、胃癌、肺癌、头颈癌和乳腺癌。因此，本披露提供了新颖的靶向策略，其包括抑制csc的方法和药剂，并且可用于抑制和/或治疗患有癌症的患者中的各种癌症并改善生活质量。
lox1是一种二硫键连接的ii型跨膜蛋白。它首先被鉴定为氧化低密度脂蛋白(oxldl)的主要受体(kume等人，1997)。该受体由短n端细胞质结构域、跨膜结构域、颈结构域和c-型凝集素结构域(ctld)组成，ctld的结构已经被解开(ohki等人，(2005))。此外，lox1的颈结构域可被蛋白水解裂解，释放出可溶性lox1(slox1)。lox1是一种e类清道夫受体，并结合多个配体，这些配体包括oxldl、c-反应蛋白(crp)、磷脂酰丝氨酸、晚期糖基化终产物(age)、小密度脂蛋白(sdldl)、氧化hdl、n4-氧代壬酰基赖氨酸(onl)、热休克蛋白(hsp)、肺炎衣原体、血小板、白细胞和凋亡细胞。这些配体中有许多，特别是oxldl，与动脉粥样硬化相关。多个信号转导途径与lox1活化有关，包括rhoa/rac1、一氧化氮、p38mapk、蛋白激酶b和c、erk1/2和nfκb。参见例如，taye等人，eurjclininvest.[欧洲临床研究杂志]43(7):740-5(2013)。
临床前证据暗示lox1促进血管功能障碍、斑块进展、破裂和血栓形成、动脉粥样硬化以及炎性病状。参见，例如，ulrich-merzenich等人，(2013)。例如，既然lox1敲除小鼠具有减少的主动脉粥样硬化和降低的血管壁胶原沉积(mehta等人，(2007))，lox1过度表达增加动脉粥样硬化斑块形成(inoue等人，(2005)；和white等人，(2011))，在易损斑块肩部观察到lox1表达，且与巨噬细胞聚集、细胞凋亡和mmp-9表达有关(li等人，(2010))。在大鼠中，中和lox1抗体修复乙酰胆碱诱导的冠状动脉扩张(xu等人，(2007))并减少球囊损伤后的内膜增厚(hinagata等人，(2006))。人类中的lox1表达并非组成型，但可通过促炎性刺激动态诱导。在动脉粥样硬化斑块中，lox1表达在内皮细胞、平滑肌细胞和巨噬细胞上。有趣的是，已经提出用血清slox1来诊断急性冠脉综合征(acs)患者中的斑块不稳定性和破裂(nakamura等人，(2010))；预测acs复发或死亡(kume等人，(1997))；且与复杂病灶数量增加有关(zhao等人，(2011))。
除上述之外，已经示出lox1在几种癌症类型中表达增加，例如前列腺癌(fangningwan等人(2015))。据报道，高蛋白表达水平与高体重指数相结合可以预测鳞状非小细胞肺癌的不良预后(long等人，(2015))。据报道lox1参与通过激活nf-kb将正常乳腺上皮细胞系(mcf10a)转化成致瘤细胞系并推测有关细胞增殖和迁移的任何参与(khaidakovm等人，(2011)和hirshha等人(2010))。尽管这些报道讨论了lox1在几种癌症中可能发挥的潜在作用，但此处提供的披露被认为是lox1在csc生物学中发挥作用的第一个证据。
本披露包括作为csc的新颖靶标的lox1的鉴定的描述和综述。如此处所提及的，通过与从胰腺癌获得的衍生自患者的异种移植物(pdx)模型的表型选择和分析结合的说明性实例来讨论lox1作为相关csc靶标的确定。通过产生肿瘤球体，并通过实例中讨论的筛选过程丰富了该pdx模型，可以利用lox1的抑制剂抑制csc(例如，抑制增殖、诱导分化、诱导csc细胞凋亡或以其他方式杀死或减缓csc增殖的进展)。
因此，lox1在csc生长和活性中发挥作用，这对于csc生物学来说是完全新颖的。本披露提供了说明性实施例，其证实csc(例如衍生自胰腺癌模型的csc)表达lox1，并且进而lox1可影响csc自我更新和增殖。包括用lox1抑制剂(例如像单克隆抗体)中和lox1活性的策略可以对csc抑制提供显著的作用，从而支持了靶向lox1以减少肿瘤中csc的巨大治疗潜力。
在继续进一步详细描述本披露之前，应当理解的是，本披露并不局限于特定的组合物或方法步骤，因为这些组合物或方法步骤可以改变。必须注意的是，除非上下文中另外清楚地指出，如在本说明书及所附权利要求中所使用，单数形式“一种/一个(a/an)”和“该”包括复数指示物。此外，这些术语连同术语“一个或多个/一种或多种”和“至少一个/至少一种”在此可以互换地使用。
此外，“和/或”被理解为这两个指定的特征或组分每一者与或不与另一者的特定披露。因此，术语“和/或”如在词组如“a和/或b”中使用时，旨在包括“a和b”、“a或b”、“a”(单独)、以及“b”(单独)。同样，如在短语诸如“a、b和/或c”中使用的术语“和/或”旨在包括以下方面：a、b以及c；a、b或c；a或c；a或b；b或c；a和c；a和b；b和c；a(单独)；b(单独)；和c(单独)。
除非另外定义，在此所使用的所有技术和科学术语具有与本披露涉及的领域所属的技术人员通常所理解的相同的意义。例如，concisedictionaryofbiomedicineandmolecularbiology[生物医学与分子生物学简明词典]，juo、pei-show，第2版，2002，crc出版社；thedictionaryofcellandmolecularbiology[细胞与分子生物学词典]第3版，1999，学术出版社(academicpress)；以及oxforddictionaryofbiochemistryandmolecularbiology[生物化学和分子生物学牛津词典]，修订版，2000，牛津大学出版社(oxforduniversitypress)为技术人员提供在本披露中使用的许多术语的通用词典注释。
单位、前缀和符号均以它们的国际单位系统(si)接受形式表示。数值范围包括定义该范围的数字。除非另外指明，否则氨基酸序列以氨基到羧基的方向从左到右书写。在此提供的小标题不是本披露的不同方面的限制，可以通过作为一个整体参考本说明书来获得这些方面。因此，通过以其全文参考说明书，更完全地定义了就在以下定义的术语。
当用语言“包含”来说明方面时，还提供了关于“由……组成”和/或“主要由……组成”描述的其他类似方面。
在本发明的上下文中术语“约”和“大约”表示本领域技术人员将理解的准确性区间，以仍然确保所讨论特征的技术效果。该术语典型地涵盖与指示的数值约+/-10％或约+/-5％的偏差。
两个序列之间的一致性百分比的确定优选使用karlin和altschul(1993)proc.natl.acad.sciusa[美国国家科学院院刊]90:5873-5877完成。这种算法被例如并入在ncbi网站可得的altschul等人(1990)j.mol.biol.[分子生物学杂志]215:403-410的blastn和blastp程序中。一致性百分比的确定优选用blastn和blastp程序的标准参数进行。
氨基酸可以在此通过它们的通常己知的三字母符号或通过由iupac-iub生物化学命名委员会(iupac-iubbiochemicalnomenclaturecommission)推荐的单字母符号来提及。同样地，核苷酸可以通过它们的普遍公认的单字母代码而被提及。
术语“lox1”和“凝集素样氧化低密度脂蛋白受体-1”在本文中可互换使用，且是指lox1和/或lox1的生物活性片段。cdna和三种hlox1同种型的氨基酸序列以genbank登录号提供：np_002534.1、np_001166103.1和np_001166104.1，各自通过引用以其全部内容并入本文。
术语“抑制(inhibit)”、“阻断(block)”“减少(reduce)”和“压制(suppress)”在本文中可互换地使用，并且是指任何统计学显著的生物活性的降低，包括活性的完全阻断。例如，“抑制”可以指lox1生物活性大约10％、20％、30％、40％、50％、60％、70％、80％、90％、或100％的降低。相应地，当术语“抑制”或“压制”用于描述例如对表达细胞表面lox1的细胞(例如，csc)中且在lox1配体(例如，oxldl、crp和age)存在下的lox1-介导的信号转导途径的影响时，这些术语是指lox1-结合蛋白(例如抗-lox1抗体)使细胞中的lox1-介导的诱导性信号转导降低统计学上显著的水平(例如，p值小于或等于0.05)的能力。在其他方面，被抑制或阻断的lox1-介导的生物活性提供了程序性细胞死亡(即细胞凋亡)。在进一步的实施例中，被抑制的或阻断的lox1介导的生物学活性提供了细胞(例如csc)的分化。
如在此可互换使用的术语“抗体”或“免疫球蛋白”包括完整抗体及其任何抗原结合片段或单链。典型抗体包含由二硫键互连的至少两个重(h)链和两个轻(l)链。每个重链由一个重链可变区(在此缩写成vh)和一个重链恒定区组成。重链恒定区由三个结构域ch1，ch2和ch3构成。每个轻链由轻链可变区(本文缩写为vl)和轻链恒定区构成。轻链恒定区由一个结构域cl构成。vh和vl区可以进一步细分为称为互补决定区(cdr)的高变区，其间插入更保守的称为框架区(fw)的区域。每个vh和vl由三个cdr和四个fw构成，从氨基末端到羧基末端按照以下顺序排列：fw1、cdr1、fw2、cdr2、fw3、cdr3、fw4。重链和轻链的可变区含有与抗原相互作用的结合结构域。抗体的恒定区可以介导免疫球蛋白与宿主组织或宿主因素(包括免疫系统的不同细胞(例如，效应细胞)和经典补体系统的第一组分(c1q))的结合。本披露的示例性抗体包括典型的抗体，scfv及其组合，其中例如scfv与典型抗体的重链和/或轻链或聚合物的n-末端共价连接(例如，经由肽键或经由化学连接子)，或插入典型抗体的重链和/或轻链中。
术语“抗体”可以指通过免疫球蛋白分子的可变区中的至少一个抗原识别位点识别并特异性地结合靶标(例如蛋白质，多肽，肽，碳水化合物，多核苷酸，脂质或前述的组合)的免疫球蛋白分子。术语“抗体”包括单克隆抗体、重组抗体、人抗体、人源化抗体、嵌合抗体、双特异性抗体、多特异性抗体或其抗体片段。
术语“抗体”包括完整多克隆抗体，完整单克隆抗体，抗体片段(诸如fab、fab'、f(ab')2、以及fv片段)，单链式fv(scfv)突变体，产生自至少两个完整抗体、嵌合抗体、人源化抗体、人抗体、包含抗体的抗原决定部分的融合蛋白以及包含抗原酶识别位点的任何其他修饰的免疫球蛋白分子的多特异性抗体(例如双特异性抗体)，只要这些抗体展现希望的生物活性。抗体可以是基于其分别称为α、δ、ε、γ和μ的重链恒定结构域的一致性的以下免疫球蛋白的五个主要类别中的任何一个：iga、igd、ige、igg和igm，或其亚类(同种型)(例如igg1、igg2、igg3、igg4、iga1和iga2)。不同类别的免疫球蛋白具有不同的和熟知的亚基结构和三维构型。抗体可以是裸的或轭合至其他分子如毒素、放射性同位素等等。
术语“种系化(germlining)”意指抗体中特定位置处的氨基酸往回突变为在种系中发现的相同位置处的那些氨基酸。
术语“抗原-结合抗体片段”或“lox1-结合抗体片段”是指完整抗体的一部分并且是指完整抗体的互补决定可变区。抗体片段的实例包括但不限于：fab、fab'、f(ab')2、以及fv片段、线性抗体、单链抗体(例如，scfv)以及由抗体片段形成的多特异性抗体。本披露另外提供了lox1-结合抗体片段，其中该抗体片段是fab片段、fab'片段、f(ab')2片段、fv片段、双体抗体或单链抗体分子。
“单克隆抗体”是指涉及单一抗原决定簇或表位的高度特异性识别和结合的同源抗体群体。这与典型地包括针对不同抗原决定簇的不同抗体的多克隆抗体相反。术语“单克隆抗体”包括完整和全长单克隆抗体以及抗体片段(例如fab、fab'、f(ab')2、fv)、单链(scfv)突变体、包含抗体部分的融合蛋白和包含抗原识别位点的任何其他修饰的免疫球蛋白分子。此外，“单克隆抗体”是指以任何数目的方式制备的此类抗体，包括但不限于杂交瘤、噬菌体选择、重组表达和转基因动物。
术语“人源化抗体”是指衍生自非人(例如鼠)免疫球蛋白的抗体，其被工程化成包含最小的非人(例如鼠)序列。典型地，人源化抗体是人免疫球蛋白，其中来自互补决定区(cdr)的残基被来自非人物种(例如，小鼠、大鼠、兔子或仓鼠)的cdr的具有所希望特异性、亲和性和能力的残基替代(琼斯(jones)等人，自然(nature)，321:522-525(1986)；里希曼(riechmann)等人，自然，332:323-327(1988)；费尔海恩(verhoeyen)等人，科学(science)，239:1534-1536(1988))。在一些情况下，人免疫球蛋白的fv构架区(fw)残基被来自具有期望的特异性、亲和力和能力的非人物种的抗体中的相应残基替换。
人源化抗体可以通过在fv构架区和/或置换的非人残基内替代的另外的残基的替代来进一步修饰，以改进和优化抗体特异性、亲和力和/或能力。通常，人源化抗体将包含基本上所有至少一个(并且典型地两个或三个)可变结构域，该可变结构域包含对应于非人免疫球蛋白的所有或基本上所有cdr区，而所有或基本上所有fr区是人免疫球蛋白共有序列的那些。人源化抗体还可以包含免疫球蛋白恒定区或结构域(fc)的至少一部分，典型地是人免疫球蛋白的恒定区或结构域。用于产生人源化抗体的方法的实例描述于美国专利号5,225,539或5,639,641中。
抗体的“可变区”指单独的抗体轻链的可变区或抗体重链的可变区或它们的组合。重链和轻链的这些可变区各自由通过三个互补决定区(cdr)(又称为高变区)连接的四个构架区(fw)组成。每条链中的cdr由fw区紧密靠近地保持在一起，并且与来自另一条链的cdr促成了抗体的抗原结合位点的形成。有至少两种技术用于确定cdr：(1)一种基于跨物种序列变异性的方法(即，卡巴特等人，具有免疫学意义的蛋白质序列，(第5版，1991，马里兰州贝塞斯达的美国国家卫生研究院))；和(2)一种基于抗原抗体复合物的晶体学研究的方法(al-lazikani等人，j.molec.biol.[分子生物学杂志]273:927-948(1997))。此外，本领域有时使用这两种方法的组合来确定cdr。
当提及可变结构域中的残基(大约轻链的残基1-107和重链的残基1-113)时，通常使用卡巴特(kabat)编号系统(例如，卡巴特等人，免疫学目的的序列(sequencesofimmunologicalinterest)，第5版，公共卫生服务(publichealthservice)，国立卫生研究院(nationalinstitutesofhealth)，贝塞斯达，马里兰州(1991)，将其通过引用并入本文)。在卡巴特中的氨基酸位置编号是指在卡巴特等人，免疫学目的的蛋白质的序列(sequencesofproteinsofimmunologicalinterest)，第5版，公共卫生服务，国立卫生研究院，贝塞斯达，马里兰州(1991)中用于抗体的重链可变结构域或轻链可变结构域的编号系统。使用这个编号系统，实际的线性氨基酸序列可以含有更少或另外的氨基酸，其对应于可变结构域的fw或cdr的截短或插入。例如，重链可变结构域可以包括在h2的残基52之后的单个氨基酸插入(根据卡巴特的残基52a)和在重链fw残基82之后的插入残基(例如，根据卡巴特的残基82a、82b和82c等)。
可以通过在抗体序列与“标准”卡巴特编号序列的同源性区域进行比对来确定给定抗体的残基的卡巴特编号。相反，乔西亚(chothia)是指结构环的位置(乔西亚和莱斯克(lesk)，分子生物学杂志(j.mol.biol.)196:901-917(1987))。乔西亚cdr-h1环的末端在利用卡巴特编号惯例编号时在h32与h34之间变化，这取决于环的长度(这是因为卡巴特编号方案将插入放在h35a和h35b；如果35a和35b都不存在，那么环端点在32；如果只存在35a，那么环端点在33；如果35a和35b都存在，那么环端点在34)。abm高变区代表卡巴特cdr和乔西亚结构环之间的折衷，并且被牛津分子(oxfordmolecular)abm抗体建模软件使用。
imgt(免疫遗传学)也提供一种用于免疫球蛋白可变区(包括cdr)的编号系统。参见例如，勒夫兰克(lefranc)、m.p.等人，发展与比较免疫学(dev.comp.immunol.)27:55-77(2003)，将该文献以引用的方式并入本文。imgt编号系统是基于高变环的多于5,000个序列的比对、结构数据和表征，并且允许容易地比较所有物种的可变区和cdr区。根据imgt编号方案，vh-cdr1是在位置26至35处，vh-cdr2是在位置51至57处，vh-cdr3是在位置93至102处，vl-cdr1是在位置27至32处，vl-cdr2是在位置50至52处，并且vl-cdr3是在位置89至97处。
如贯穿本说明书使用的，所述的vhcdr序列对应于经典的卡巴特编号位置，即卡巴特vh-cdr1是在位置31-35，vh-cdr2是在位置50-65，并且vh-cdr3是在位置95-102。vl-cdr1、vl-cdr2和vl-cdr3也对应于经典的卡巴特编号位置，分别即位置24-34、50-56和89-97。
术语“人抗体”是指由人产生的抗体或具有与使用本领域已知的任何技术制备的由人产生的抗体相对应的氨基酸序列的抗体。人抗体的这种定义包括完整或全长抗体，其片段和/或包含至少一个人重链和/或轻链多肽的抗体，例如包含鼠轻链和人重链多肽的抗体。
术语“嵌合抗体”是指其中免疫球蛋白分子的氨基酸序列来自两种或更多种物种的抗体。典型地，轻链和重链的可变区对应于源自具有所需特异性、亲和力和能力的一种哺乳动物(例如小鼠、大鼠等)的抗体的可变区，而恒定区同源于衍生自另一种(通常为人)的抗体中的序列，以避免在该物种中引起免疫应答。
术语“tm”或“tm突变体”是指igg1恒定区中的突变，该突变导致具有该突变的抗体的效应子功能(例如，adcc)下降。tm突变体包含引入igg1的重链的三个突变l234f/l235e/p331s的组合，这导致效应子无效人类igg1(eu编号，卡巴特等人(1991)免疫学感兴趣的蛋白序列，美国公共卫生服务，国立卫生研究院，华盛顿d.c.)。
术语“yte”或“yte突变体”是指igg1fc中的突变，这导致结合至人类fcrn增加，且提高具有突变的抗体的血清半衰期。yte突变体包含引入igg1的重链的三个突变m252y/s254t/t256e的组合(eu编号，卡巴特等人(1991)免疫学感兴趣的蛋白序列，美国公共卫生服务，国立卫生研究院，华盛顿d.c.)。参见美国专利号7,658,921，通过引用将其并入本文。与相同抗体的野生型相比，yte突变体显示出增加了抗体的血清半衰期大约四倍(达尔阿夸(dall'acqua)等人，生物化学杂志(j.biol.chem.)281:23514-24(2006))。还参见美国专利号7,083,784，通过引用将其全文并入本文。
术语“lox1-结合蛋白”、“抗-lox1抗体”或“特异性地结合lox1的抗体”是指能够以足够亲和力结合lox1，使得抗体可用作靶向lox1的治疗剂或诊断试剂的lox1-结合蛋白，诸如抗-lox1抗体。抗-lox1抗体结合至无关非lox1蛋白的程度小于该抗体结合至lox1的约10％，这是通过例如放射免疫测定(ria)、
“拮抗剂”或“阻断性”lox1-结合蛋白抑制或降低lox1的生物活性。在一些方面，拮抗剂lox1-结合蛋白抑制lox1结合oxldl、age和/或crp的能力。在一些方面，lox1-结合蛋白抑制lox1结合oxhdl、hsp60、白细胞和/或活化血小板的能力。在某些方面，lox1-结合蛋白基本上或完全抑制lox1的生物活性。令人希望的是，lox1生物活性降低了10％、20％、30％、50％、70％、80％、90％、95％或甚至100％。在特定方面，lox1-结合蛋白是抗-lox1抗体，诸如全长抗体或lox1-结合抗体片段。在其他方面，抗-lox1抗体抑制或降低lox1的生物活性达10％、20％、30％、50％、70％、80％、90％、95％或甚至100％。
“结合亲和力”通常是指分子(例如抗体)的单个结合位点与其结合配偶体(例如抗原)之间的非共价相互作用的总和的强度。除非另有说明，如本文所用，“结合亲和力”是指反映结合对(例如抗体和抗原)的成员之间的1:1相互作用的固有结合亲和力。分子x对其配偶体y的亲和力通常可以由解离常数(kd)表示。亲和力可以通过本领域已知的常规方法测量，包括本文所述的那些。低亲和力抗体通常缓慢地结合抗原并且倾向于容易解离，而高亲和力抗体通常更快地结合抗原并且倾向于更长地保持结合。测量结合亲和力的多种方法是本领域已知的，其中任何一种都可用于本公开的目的。
除非另有说明，“效力”通常表示为ic50值，以nm或pm计。ic50是抗体分子的半数抑制浓度。在功能测定中，ic50是将生物应答降低其最大值的50％的浓度。在配体结合研究中，ic50是减少受体结合达最大特异性结合水平的50％的浓度。ic50可以通过本领域已知的手段来计算。
本文披露的lox1-结合蛋白(例如，抗体，诸如，全长lox1-抗体和lox1-结合抗体片段，以及其变体和衍生物)与参考抗体相比的效力倍数提升可以是至少约2-倍、至少约4-倍、至少约6-倍、至少约8-倍、至少约10-倍、至少约20-倍、至少约30-倍、至少约40-倍、至少约50-倍、至少约60-倍、至少约70-倍、至少约80-倍、至少约90-倍、至少约100-倍、至少约110-倍、至少约120-倍、至少约130-倍、至少约140-倍、至少约150-倍、至少约160-倍、至少约170-倍或至少约180-倍或更多。
“抗体依赖性细胞介导的细胞毒性”或“adcc”是指一种细胞毒性形式，其中结合至存在于某些细胞毒性细胞(例如，天然杀伤(nk)细胞、嗜中性粒细胞、以及巨噬细胞)上的fc受体(fcr)上的分泌的ig使得这些细胞毒性效应细胞能够特异性地结合至带有抗原的靶细胞并且随后用细胞毒素杀伤该靶细胞。针对靶细胞表面的特异性高亲和力igg抗体“武装”细胞毒性细胞并且绝对是这种杀伤所需要的。靶细胞的裂解是细胞外的，要求直接的细胞与细胞接触，并且不涉及补体。可以预期的是，除抗体之外，包含fc区(确切地是fc融合蛋白)的、具有特异性地结合带有抗原的靶细胞能力的其他蛋白质将能够影响细胞介导的细胞毒性。为了简单起见，由fc融合蛋白的活性产生的细胞介导的细胞毒性在此也称为adcc活性。
“分离的”lox1-结合蛋白(例如，lox1抗体，包括抗原结合片段、变体和其衍生物)、多核苷酸、载体、细胞或组合物是处于未在自然界中发现形式的多肽、抗体、多核苷酸、载体、细胞或组合物。分离的多肽(例如，抗-lox1抗体，包括全长抗体和lox1-结合抗体片段)、多核苷酸、载体、细胞或组合物包括已经被纯化至它们不再呈自然界中发现形式的程度的那些。在一些方面中，分离的抗体、多核苷酸、载体、细胞或组合物是基本上纯的。
“受试者”或“个体”或“动物”或“患者”或“哺乳动物”意指希望诊断、预后或治疗的任何受试者，尤其是哺乳动物受试者。哺乳动物受试者包括人、家畜、农畜、体育动物、和动物园动物，包括例如人、非人类灵长类、狗、猫、豚鼠、兔、大鼠、小鼠、马、牛、熊等。
a.方法
本披露提供了涉及结合lox1的抑制剂的方法的多个方面和实施例。如在此所讨论的，这些方面和实施例涵盖涉及疾病的各种方法，包括治疗方法、预防方法、抑制和/或减缓进展的方法、降低疾病复发和/或重现风险的方法；靶向和/或杀死特定细胞群的方法；诱导csc分化和/或降低csc自我更新和扩增能力的方法；检测、诊断和/或定量特定细胞群和/或疾病(包括确定疾病阶段)的方法以及疾病监测和/或预后的方法。
在实施例中，本披露提供了一种用于抑制癌症干细胞(csc)增殖的方法，该方法包括使csc与lox1的抑制剂以有效抑制csc增殖和/或减少csc存活的量接触。在实施例中，该方法包括给予有效量的对lox1为选择性的lox1抑制剂。在一些实施例中，该抑制剂选择性抑制lox1生物化学级联。当关于术语“抑制剂”或“抑制”使用时，术语“选择性”涉及相对于对其他生物分子的抑制活性而言对靶标(例如lox1)具有增加的抑制活性的化合物(例如，如在此所述的小分子或生物分子)。在一个实施例中，该方法包括与另外的抗癌剂组合，给予治疗有效量的lox1的抑制剂。
在实施例中，本披露涉及一种用于在先前已经接受疗法并且需要治疗的受试者中对耐治疗性癌症进行治疗的方法，该方法包括以有效抑制或杀死存在于该耐治疗性癌症中的癌症干细胞(csc)和/或诱导csc的分化的量向该受试者给予lox1的抑制剂。在一个实施例中，先前疗法是放射治疗、手术治疗、免疫治疗、化学治疗和/或酪氨酸激酶抑制剂。
在另外的实施例中，本披露涉及一种用于在先前已经接受疗法并且需要治疗的受试者中对耐治疗性癌症进行治疗的方法，该方法包括以有效治疗该耐治疗性癌症的量向该受试者给予lox1的抑制剂。在一个实施例中，先前疗法是放射治疗、手术治疗、免疫治疗、化学治疗和/或酪氨酸激酶抑制剂。
在其他实施例中，本披露涉及一种用于治疗包含癌症干细胞(csc)的癌症的方法，该方法包括以有效靶向并抑制或杀死该癌症中的csc和/或诱导csc的分化的量向需要治疗的受试者给予lox1的抑制剂。在一个实施例中，该方法包括与另外的抗癌剂组合，给予治疗有效量的lox1的抑制剂。
在其他的实施例中，本披露涉及一种用于治疗包含癌症干细胞(csc)的癌症的方法，该方法包括以有效治疗该癌症的量向需要治疗的受试者给予lox1的抑制剂。在一个实施例中，该方法包括与另外的抗癌剂组合，给予治疗有效量的lox1的抑制剂。
在进一步的实施例中，本披露涉及一种用于在患有重现或复发的癌症的受试者中治疗癌症的方法，该方法包括以有效抑制或杀死该癌症中的csc和/或诱导csc的分化的量向受试者给予lox1的抑制剂。在一个实施例中，该方法包括与另外的抗癌剂组合，给予治疗有效量的lox1的抑制剂。
在进一步的实施例中，本披露涉及一种用于在患有重现或复发的癌症的受试者中治疗癌症的方法，该方法包括以有效治疗该癌症的量向受试者给予lox1的抑制剂。在一个实施例中，该方法包括与另外的抗癌剂组合，给予治疗有效量的lox1的抑制剂。
本披露的其他实施例涉及一种用于预防癌症重现或复发的方法，该方法包括以有效预防癌症重现或复发的量向需要预防癌症重现或复发的受试者给予lox1的抑制剂。在一个实施例中，该方法包括与另外的抗癌剂组合，给予治疗有效量的lox1的抑制剂。
在另外的实施例中，本披露涉及一种用于降低患有癌症的受试者的癌症复发风险的方法，该方法包括以有效抑制或杀死该癌症中的csc和/或诱导csc的分化的量向该受试者给予lox1的抑制剂，从而降低该受试者中癌症复发的风险。在一个实施例中，该方法包括与另外的抗癌剂组合，给予治疗有效量的lox1的抑制剂。
在其他的实施例中，本披露涉及一种消除癌症干细胞(csc)的方法，该方法包括使该csc与有效消除该csc的量的lox1的抑制剂接触。在一个实施例中，该方法包括与另外的抗癌剂组合，给予治疗有效量的lox1的抑制剂。
在一些实施例中，本披露涉及一种选择性地减少癌细胞群中的癌症干细胞(csc)的数目的方法，该方法包括使该癌细胞群与有效抑制或杀死该癌细胞群中的csc和/或诱导csc的分化的量的lox1的抑制剂接触。因此，可将这些抑制剂给予需要治疗的受试者和/或与许多csc接触，以足以阻止该csc的进一步增殖的量。在一些实施例中，这些抑制剂可以通过在csc细胞群中诱导细胞死亡(凋亡)而有效减少csc数目的量给予。在又其他实施例中，这些抑制剂可以通过在csc细胞群中诱导细胞分化而有效减少csc数目的量给予。相应地，在一些实施例中，提供一种或多种抑制剂，以可能未必诱导csc中细胞凋亡的量，但以通过诱导csc分化而有效减少或解除控制csc在受试者或致瘤组织中自我更新和扩增csc细胞群的能力的量。这些抑制剂还能以有效干扰csc“小环境”的量提供，使得csc小环境不能再维持csc和/或肿瘤组织再生。在一个实施例中，该方法包括与另外的抗癌剂组合，给予治疗有效量的lox1的抑制剂。
在一些实施例中，本披露提供了一种用于减少或抑制肿瘤生长的方法，该方法包括使该肿瘤与有效减少或抑制肿瘤生长的量的lox1的抑制剂接触。在相关方面，本披露提供了一种用于减少或抑制患者中的肿瘤生长的方法，该方法包括以有效减少或抑制肿瘤生长的量向该患者给予lox1的抑制剂。在一个实施例中，该方法包括与另外的抗癌剂组合，给予治疗有效量的lox1的抑制剂。
在进一步的实施例中，本披露提供了一种用于减小肿瘤大小的方法，该方法包括使该肿瘤与有效减小肿瘤大小的量的lox1的抑制剂接触。在相关方面，本披露涉及一种用于减少患者肿瘤大小的方法，该方法包括以有效减小肿瘤大小的量向患者给予lox1的抑制剂。在一个实施例中，该方法包括与另外的抗癌剂组合，给予治疗有效量的lox1的抑制剂。
在一些实施例中，本披露提供了一种用于抑制、减少或预防肿瘤侵袭或转移的方法，该方法包括使该肿瘤与有效预防、减少或抑制肿瘤侵袭或转移的量的lox1的抑制剂接触。在相关方面，本披露提供了一种用于抑制、减少或预防患者中的肿瘤侵袭或转移的方法，该方法包括以有效预防、减少或抑制肿瘤侵袭或转移的量向该患者给予lox1的抑制剂。在一个实施例中，该方法包括与另外的抗癌剂组合，给予治疗有效量的lox1的抑制剂。
在本披露提供的实施例中，这些方法涉及表达lox1的肿瘤和/或csc或csc细胞群。在另外的实施例中，该肿瘤和/或csc或csc细胞群可以包括形成球体的csc。
在以上方面的不同实施例中，这些方法涉及治疗受试者的肿瘤疾病和/或癌症疾病。在一些实施例中，该癌症选自消化道或胃肠癌(例如，肛门癌；胆管癌；肝外胆道癌；阑尾癌；类癌瘤，胃肠癌；结肠癌；结直肠癌，包括儿童结直肠癌；食道癌，包括儿童食道癌；胆囊癌；胃癌，包括儿童胃癌；肝细胞癌(hepatocellularcancer)(例如，肝细胞癌(hepatocellularcarcinoma))，包括成人(原发性)肝细胞癌和儿童肝细胞癌；胰腺癌，包括儿童胰腺癌；肉瘤，横纹肌肉瘤；胰岛细胞胰腺癌；直肠癌；和小肠癌)；肺癌(例如，非小细胞肺癌(nsclc)和小细胞肺癌(sclc))；头颈癌(例如，唇及口腔癌；口腔癌，包括儿童口腔癌；下咽癌；喉癌，包括儿童喉癌；具隐匿性原发灶的转移性鳞状颈癌；口癌；鼻腔和鼻窦癌；鼻咽癌，包括儿童鼻咽癌；口咽癌；甲状旁腺癌；鼻咽癌；唾液腺癌，包括儿童唾液腺癌；咽喉癌；和甲状腺癌)；和乳腺癌。
如以上所讨论的，通常术语“受试者”包括人类和非人类动物，尤其是哺乳动物。在涉及治疗受试者的方法的方面的某些实施例中，受试者的非限制性实例包括人类受试者，例如具有障碍(例如，在此描述的障碍，如癌症)的人类患者或者正常受试者。在一些实施例中，“非人类”动物或受试者包括所有脊椎动物，例如非哺乳动物(如鸡、两栖动物、爬行动物)和哺乳动物(如非人类灵长动物)，驯化的和/或农业上有用的动物(如绵羊、狗、猫、母牛、猪等)，以及啮齿动物(如小鼠、大鼠、仓鼠、豚鼠等)。在此处披露的方法的某些实施例中，该受试者是人类患者。
“治疗(treatment或treat)”是指治疗性治疗和预防性(prophylactic或preventative)措施两者。对治疗有需要的那些受试者包括已经患有障碍的那些连同易于患有障碍的那些或者其中障碍有待预防的那些。对治疗有需要的那些受试者包括已经患有障碍的那些连同易于患有障碍的那些或者其中障碍有待预防的那些。当关于疾病或需要治疗的受试者使用时，术语相应地包括但不限于与未治疗的受试者相比，疾病进展的停止或减缓、疾病的缓解、症状的预防、疾病和/或症状严重程度的减轻、或疾病长度的减少。在实施例中，治疗方法可以减轻正在治疗的特定疾病的一个或多个临床指征。涉及治疗与表达lox1的csc以及具有活化的lox1级联的csc相关联的疾病或病症的方法的某些实施例包括给予治疗有效量的抑制lox1的化合物，连同其药物组合物。在实施例中，治疗方法可以涉及防止疾病和/或症状进一步进展，消除疾病，减缓或减少疾病和/或症状的进一步进展，或逆转与csc相关联的疾病和/或临床症状和与表达lox1的csc相关联的癌症。
在一些实施例中，这些方法可以包括治疗有效量的足以停止或减缓癌症进展的药剂。在另外的实施例中，治疗有效量是足以减少受试者中癌细胞(包括csc)数目(即，杀死癌细胞和/或抑制癌细胞增殖和/或诱导csc分化)的量。在此讨论了用于监测受试者中癌细胞增殖和癌症进展(例如，肿瘤大小、细胞计数、生化标记、次要适应症等)的方法，并且还可以包括本领域中通常已知的技术。
如在此所讨论的，一些实施例提供了一种治疗方法，该方法包括与放射治疗、手术、免疫疗法或其他化学治疗剂联合给予lox1抑制剂。在一些实施例中，该方法包括与另外的抗癌剂组合给予治疗有效量的lox1的抑制剂。本领域已知各种各样的抗癌剂(即抗肿瘤剂)，包括例如烷化剂、抗代谢剂、天然抗肿瘤剂、激素抗肿瘤剂、血管生成抑制剂、分化剂、化疗药物、酪氨酸激酶抑制剂、rna抑制剂、抗体或免疫治疗剂、基因治疗剂、小分子酶抑制剂、生物反应修饰剂和抗转移剂。此类活性化合物的一些非限制性实例包括本领域通常已知的化学治疗剂，例如吉西他滨
化疗药物有许多副作用，其中之一是心肌毒性(也称为心脏毒性)。特别地，化疗药物已被证明会导致心脏损害，心脏损害导致心肌细胞死亡和心力衰竭。在一个实施例中，本披露提供了用于在需要化学治疗的患者中抑制、减少或预防化学治疗相关的心脏毒性的方法，该方法包括以有效抑制、减少或预防化学治疗相关心脏毒性的量向患者给予lox1抑制剂。在另一个实施例中，本披露提供了在需要化学治疗的患者中逆转心脏毒性的方法，该方法包括以有效逆转化学治疗相关的心脏毒性的量向患者给予lox1的抑制剂。在一个实施例中，化学治疗是蒽环类，例如阿霉素。
如在此所用，“给予(administration或administering)”是指通过任何适当的途径提供、接触和/或递送一种或多种化合物以实现所希望的效果。给予可以包括但不限于口服、舌下、肠胃外(例如，静脉、皮下、皮内、肌内、关节内、动脉内、滑膜内、胸骨内、鞘内、病灶内或颅内注射)、透皮、局部、颊、直肠、阴道、鼻、眼、通过吸入、以及植入物。
如在此所用，“共同给予”是指同时或顺序给予多种化合物或药剂。第一化合物或药剂可以在给予第二化合物或药剂之前、同时或之后给予。
如在此如在“接触细胞”中所使用的“接触”是指在体外、离体或体内(即在受试者如哺乳动物中，包括人、小鼠、大鼠、兔、猫和狗中)直接或间接接触细胞。接触细胞(也可以包括使细胞与抑制剂化合物“反应”或将细胞“暴露”于抑制剂化合物)可以作为通常将化合物或药剂给予受试者的结果或者将该抑制剂加入或施加于含有细胞或组织或含细胞或组织的液体的器皿的结果而发生。因此，使细胞与抑制剂接触可以指将抑制剂给予受试者、受试者的组织或区域或包括细胞(例如受试者局部区域或系统(例如淋巴、循环等)中的csc细胞)的组织，并且可能不会物理接触靶细胞。接触涵盖向细胞、组织、哺乳动物、受试者、患者或人给予。此外，接触细胞包括向细胞培养物中加入药剂。其他适合的方法可以包括使用在此讨论的或本领域中已知的另外的适当程序和给药途径向细胞、组织、哺乳动物、受试者或患者引入或给予药剂。
本披露还涉及lox1的抑制剂或多于一种lox1的抑制剂的组合在组合物(包括治疗和药物组合物)中的一种或多种用途。在实施例中，这些用途和组合物包括有效提供在此披露的各种方法的量的一种或多种抑制剂。在实施例中，该一个或多个用途涉及用以制造用于治疗(例如，杀死、消除、抑制、减少细胞增殖的进展和/或细胞增殖的进展速率，减少细胞自我更新和/或扩增能力(csc)，减少疾病状态的进展和/或疾病状态的进展速率)在此所述的肿瘤类型、癌症干细胞和/或癌症中的一种或多种的药物的用途。检测方法
在一些方面和实施例中，在此披露的方法提供和/或包括用于检测、鉴定和/或定量癌症干细胞(csc)的一种或多种方法。在一些实施例中，该方法包括检测、鉴定和/或定量包括csc的生物样品中的lox1的量。在一些实施例中，该方法提供了在包含癌细胞的样品中对癌症干细胞(csc)的存在的诊断、预后、定量、鉴定和/或检测，该方法可以包括以下中的一项或多项：
使该样品与结合至lox1核酸序列或lox1氨基酸序列的药剂接触；
检测在该药剂和该lox1核酸序列或该lox1氨基酸序列之间是否存在结合；和/或
当检测在该药剂和该lox1核酸序列或该lox1氨基酸序列之间的结合时，鉴定该样品中该csc的存在。
在这些方法中，这些步骤可以单独或以与彼此或本领域通常已知的其他技术的任何系列组合使用。在此方面的一些实施例中，该方法可进一步包括以下项中的一个或多个：
量化该样品中的lox1核酸序列或lox1氨基酸序列的量；
将该lox1核酸序列或该lox1氨基酸序列的量与lox1核酸或lox1氨基酸的参比水平进行比较；和/或
当检测到的量大于该参比水平时，鉴定该样品中该csc的存在。
在一些方面和实施例中，在此披露的方法提供和/或包括用于检测、鉴定和/或定量lox1阳性癌症干细胞(csc)的一种或多种方法。在一些实施例中，该方法包括检测、鉴定和/或定量包含csc的生物样品中的lox1阳性csc的量。在一些实施例中，该方法提供了在包含癌细胞的样品中对lox1阳性癌症干细胞(csc)的存在的诊断、预后、定量、鉴定和/或检测，该方法可以包括以下中的一项或多项：
使该样品与结合至lox1核酸序列或lox1氨基酸序列的药剂接触；
检测在该药剂和该lox1核酸序列或该lox1氨基酸序列之间是否存在结合；和/或
当检测在该药剂和该lox1核酸序列或该lox1氨基酸序列之间的结合时，鉴定该样品中该lox1阳性csc的存在。
在又另外的实施例中，该方法可以包括含可检测部分的药剂。在一些实施例中，该药剂可以包括在严格杂交条件下与lox1核酸序列的至少一部分杂交的核酸序列。在一些实施例中，该药剂可以包括特异性结合lox1氨基酸序列的至少一部分的抗体。
在以上方面的各个实施例中，这些方法涉及表达lox1的肿瘤和/或csc或csc细胞群。在另外的实施例中，该肿瘤和/或csc或csc细胞群可以包括形成球体的csc。
除了在此描述的可用于检测、鉴定和/或量化样品中csc的方法之外，这些方面和实施例还可以包括本领域普通技术人员可用的任何方法和技术。作为非限制性实例，可以使用包括流式细胞术在内的基于细胞表面标记的技术来鉴定、检测和分离csc，这些细胞表面标记在特定的csc中表达或者对于特定的csc是特异的；通过染料排除(例如，hoechst33342，如moserle,l.等人，cancerres.[癌症研究](2008)68；5658-5668中披露的)检测侧群(sp)表型；作为漂浮球体在无血清培养基中生长/增殖的能力(例如，在此以及ryback,a.p.等人，biochim.biophys.acta[生物化学和生物物理学报](2011)1813；683-694中披露的)；和确定特定的酶活性(如例如醛脱氢酶活性)以及包括多梳异染色质标记的多梳标记的水平、h3k27me3水平和zeste2(ezh2)的多梳组蛋白增强子的水平。
在一些实施例中，例如，在不同谱系(例如造血、乳房、内皮、间质、神经)的癌症前体细胞中已经报道了升高的醛脱氢酶(aldh)表达和活性，并且可以结合在此的各个方面和实施例使用技术和商业上可获得的试剂盒(例如，aldefluortm，干细胞技术公司(stemcelltechnologies))。类似地，尽管目前还没有用于鉴定csc的通用表达细胞表面标记，但是许多表面标记与csc和相关的肿瘤类型相关，包括例如aldh、cd13、cd15、cd24、cd44、cd90、cd117、cd133、cd166、cd326(参见例如，xia,p.,currstemcellresther.(2014)mar[当前干细胞研究与治疗，2014年3月]；9(2):102-11；shimamura,m.等人，endocr.j.[内分泌杂志]，(2014)61(5):481-90；tirino,v.等人，fasebj.,(2013)jan[faseb杂志，2013年1月]；27(1):13-24)。
在一些实施例中，由于缺乏用于检测或鉴定样品中csc的一种或多种通用表面标记，所以检测、鉴定和/或定量的方法包括细胞培养技术，包括球体培养和生长测定，如在此披露的或另外本领域中已知的。
b.抑制剂
在此所述的方法、用途和组合物包括涉及能够抑制、下调或消除lox1的活性和/或表达，或者一种或多种这样的抑制剂药剂的任何组合的实施例。只要该药剂具有抑制功能(例如，抑制lox1的表达和/或活性)，该抑制剂可以选自任何类别的化合物。例如，该抑制剂可选自下组，该组由以下组成：抑制lox1的多肽、抑制lox1的小分子、抑制lox1的多核苷酸、抑制lox1的适配体、抑制lox1的抗体或抑制lox1的反义分子或sirna分子。因此，在此使用的抑制剂是指减少、抑制、下调或消除lox1的表达和/或功能的任何化合物，或适于中和、减少或抑制lox1的表达或功能的药剂。在此所述的抑制剂可通过任何机制发挥作用，包括例如与lox1结合。结合后，抑制剂可以例如抑制lox1与受体或配体的相互作用，使得lox1不能活化受体，或不能被配体活化。在其他实施例中，能够抑制lox1的活性的一种或多种药剂可以抑制趋化活性，可以螯合蛋白质并降低生物利用度，或其任何组合。
在一些实施例中，抑制剂可以是能够结合lox1的多肽或小分子，并且可以通过本领域任何技术常规(例如筛选小的化合物或多肽文库)来鉴定。如在此所用，“小分子”通常是指具有低分子量的小的有机化合物。小分子可以是在自然界未知是否发生的合成化合物或从自然来源分离或已知在天然来源中发生的天然存在的化合物，如例如细胞、植物、真菌、动物等。在一些实施例中，小分子可具有小于5000道尔顿、小于4000道尔顿、小于3000道尔顿、小于2000道尔顿、小于1000道尔顿或小于约800道尔顿的分子量。在这样的实施例中，小分子典型地具有大于约100道尔顿的分子量。
小分子或多肽是否能够结合lox1可以通过任何常规技术或测定以及在此描述的技术和测定来确定。例如，技术可以包括酵母双杂交测定法或生物化学测定，例如，拉下测定(pull-downassay)、共免疫沉淀测定、酶联免疫吸附测定(elisa)、定量放射性配体结合测定、等离子体共振测定或本领域常规使用的任何其他方法。典型地，当使用拉下测定或等离子体共振测定时，将这些蛋白中至少一种与亲和标签如his标签、gst标签或本领域常用的其他可检测部分融合是有用的。可以通过测量膜结合多肽的活性来确定待测试的多肽或任何其他化合物是否能够抑制lox1的活性。适合地，多肽能够抑制lox1的活性。
在实施例中，该抑制剂可以是“适配体”，其是指对lox1具有特异性的dna、rna或肽适配体。多核苷酸适配体包括长度为从约10个至约300个核苷酸的任何处。典型地，适配体的长度范围是从约30至约100个核苷酸，并且在一些实施例中，范围可以是从约10至60个核苷酸。适配体可以通过任何已知的方法制备，包括合成、重组和纯化方法，并且可以单独使用或与对lox1具有特异性的其他适配体组合使用。
在本文提及的方法的一些具体实施例中，抑制剂可以是特异性结合lox1的抗体。在一些实施例中，该抗体可以是单克隆或多克隆抗体或多特异性抗血清。在此类的实施例中，该抗体还可以包括抗体变体或片段，其如上所讨论的并且包括例如单链抗体、双抗体、迷你抗体、单链fv片段(sc(fv))、sc(fv)2抗体、fab片段或f(ab')2片段，只要该变体或片段保留与lox1的特异性结合特性即可。
示例性lox1结合蛋白在下表1中提供，并且描述于国际专利申请号pct/ep2015/072644中，其通过引用以全文结合至本文。
表1：示例性lox1结合蛋白
在一些方面，分离的lox1-结合蛋白包含与seqidno:4的参比vh序列相比具有总共一个、两个、三个、四个、五个、六个、七个、八个或更少氨基酸取代、缺失和/或插入的vh序列。本披露还提供了编码lox1-结合蛋白的核酸，含有这些核酸的载体和用这些核酸和载体转化的宿主细胞，以及制备和使用lox1-结合蛋白的方法。
在其他方面，分离的lox1-结合蛋白包含seqidno:4的vh。本披露还提供了编码lox1-结合蛋白的核酸，含有这些核酸的载体和用这些核酸和载体转化的宿主细胞，以及制备和使用lox1-结合蛋白的方法。
在一些方面，分离的lox1-结合蛋白包含与seqidno:33的参比vl序列相比具有总共一个、两个、三个、四个、五个、六个、七个、八个或更少氨基酸取代、缺失和/或插入的vl序列。本披露还提供了编码lox1-结合蛋白的核酸，含有这些核酸的载体和用这些核酸和载体转化的宿主细胞，以及制备和使用lox1-结合蛋白的方法。
在其他方面，分离的lox1-结合蛋白包含seqidno:33的vl。本披露还提供了编码lox1-结合蛋白的核酸，含有这些核酸的载体和用这些核酸和载体转化的宿主细胞，以及制备和使用lox1-结合蛋白的方法。
在一些方面，lox1-结合蛋白包含vh，该vh选自含有具有seqidno:1的氨基酸序列的vh-cdr1、具有seqidno:2、5-12或13的氨基酸序列的vh-cdr2和具有seqidno:3、14-17或18的氨基酸序列的vh-cdr3的vh；和轻链vl，该轻链vl选自含有具有seqidno:30的氨基酸序列的vl-cdr1、具有seqidno:31的氨基酸序列的vl-cdr2和具有seqidno:32、34或35的氨基酸序列的vl-cdr3的vl。本披露还提供了编码lox1-结合蛋白的核酸，含有这些核酸的载体和用这些核酸和载体转化的宿主细胞，以及制备和使用lox1-结合蛋白的方法。
该方法还涉及包含vh和vl序列的分离的lox1-结合蛋白，vh和vl序列与本文披露的参比vh和vllox1-结合蛋白相比各自具有总共一个、两个、三个、四个、五个、六个、七个、八个或更少氨基酸取代、缺失和/或插入。本披露还提供了编码lox1-结合蛋白的核酸，含有这些核酸的载体和用这些核酸和载体转化的宿主细胞，以及制备和使用lox1-结合蛋白的方法。
在一些方面，分离的lox1-结合蛋白具有包含seqidno:4、19-28或29的vh以及包含seqidno:33、36或37的vl。本披露还提供了编码lox1-结合蛋白的核酸，含有这些核酸的载体和用这些核酸和载体转化的宿主细胞，以及制备和使用lox1-结合蛋白的方法。
在一些方面，分离的lox1-结合蛋白包含一组互补决定区(cdr)：重链可变区(vh)-cdr1、vh-cdr2、vh-cdr3和轻链可变区(vl)-cdr1、vl-cdr2和vl-cdr3，其中该cdr组与cdr参考组相同，或与该cdr参考组相比总共具有18个或更少(例如，1、2、3、4、5、6、7、8、9、10、11、12、13、14、15、16、17或18个)氨基酸取代、缺失和/或插入，其中(a)vh-cdr1具有seqidno:1的氨基酸序列；(b)vh-cdr2具有seqidno:5的氨基酸序列；(c)vh-cdr3具有seqidno:14的氨基酸序列；(d)vl-cdr1具有seqidno:30的氨基酸序列；(e)vl-cdr2具有seqidno:31的氨基酸序列；且(f)vl-cdr3具有seqidno:32的氨基酸序列。本披露还提供了编码lox1-结合蛋白的核酸，含有这些核酸的载体和用这些核酸和载体转化的宿主细胞，以及制备和使用lox1-结合蛋白的方法。
在其他方面，lox1-结合蛋白包含一组cdr：vh-cdr1、vh-cdr2、vh-cdr3、vl-cdr1、vl-cdr2和vl-cdr3，其中：(a)vh-cdr1具有seqidno:1的氨基酸序列；(b)vh-cdr2具有seqidno:2的氨基酸序列；(c)vh-cdr3具有seqidno:3的氨基酸序列；(d)vl-cdr1具有seqidno:30的氨基酸序列；(e)vl-cdr2具有seqidno:31的氨基酸序列；且(f)vl-cdr3具有seqidno:32的氨基酸序列。本披露还提供了编码lox1-结合蛋白的核酸，含有这些核酸的载体和用这些核酸和载体转化的宿主细胞，以及制备和使用lox1-结合蛋白的方法。
该方法还涉及分离的lox1-结合蛋白，其包含与本文披露的参比vh序列具有至少90％、95％、97％、98％或99％序列一致性的重链可变区(vh)和/或与本文披露的参比vl序列具有至少90％、95％、97％、98％或99％序列一致性的轻链可变区(vl)(例如，表1中披露的vh和vl序列)。在其他方面，该分离的lox1-结合蛋白包含与seqidno:4具有至少90％、95％、97％、98％或99％序列一致性的vh和/或与seqidno:33具有至少90％、95％、97％、98％或99％序列一致性的vl。本披露还提供了编码lox1-结合蛋白的核酸，含有这些核酸的载体和用这些核酸和载体转化的宿主细胞，以及制备和使用lox1-结合蛋白的方法。
在一些方面，lox1-结合蛋白包含与选自下组的vh具有至少90％、95％、97％、98％或99％序列一致性的重链可变区(vh)和与选自下组的vl具有至少90％、95％、97％、98％或99％序列一致性的轻链可变区(vl)，该组由以下组成：(a)具有seqidno:4的氨基酸序列的vh和具有seqidno:33的氨基酸序列的vl；(b)具有seqidno:29的氨基酸序列的vh和具有seqidno:33的氨基酸序列的vl；(c)具有seqidno:41的氨基酸序列的vh和具有seqidno:58的氨基酸序列的vl；和(d)具有seqidno:54的氨基酸序列的vh和具有seqidno:70的氨基酸序列的vl。本披露还提供了编码lox1-结合蛋白的核酸，含有这些核酸的载体和用这些核酸和载体转化的宿主细胞，以及制备和使用lox1-结合蛋白的方法。
在一些方面，lox1-结合蛋白包含与选自下组的vh具有至少90％、95％、97％、98％或99％序列一致性的vh和与选自下组的vl具有至少90％、95％、97％、98％或99％序列一致性的vl，该组由以下组成：(a)具有seqidno:19的氨基酸序列的vh和具有seqidno:33的氨基酸序列的vl；(b)具有seqidno:20的氨基酸序列的vh和具有seqidno:33的氨基酸序列的vl；(c)具有seqidno:21的氨基酸序列的vh和具有seqidno:33的氨基酸序列的vl；(d)具有seqidno:22的氨基酸序列的vh和具有seqidno:33的氨基酸序列的vl；(e)具有seqidno:23的氨基酸序列的vh和具有seqidno:33的氨基酸序列的vl；(f)具有seqidno:24的氨基酸序列的vh和具有seqidno:33的氨基酸序列的vl；(g)具有seqidno:25的氨基酸序列的vh和具有seqidno:33的氨基酸序列的vl；(h)具有seqidno:26的氨基酸序列的vh和具有seqidno:33的氨基酸序列的vl；(i)具有seqidno:27的氨基酸序列的vh和具有seqidno:37的氨基酸序列的vl；(j)具有seqidno:28的氨基酸序列的vh和具有seqidno:37的氨基酸序列的vl；(k)具有seqidno:48的氨基酸序列的vh和具有seqidno:65的氨基酸序列的vl；(l)具有seqidno:49的氨基酸序列的vh和具有seqidno:66的氨基酸序列的vl；(m)具有seqidno:50的氨基酸序列的vh和具有seqidno:67的氨基酸序列的vl；(n)具有seqidno:51的氨基酸序列的vh和具有seqidno:65的氨基酸序列的vl；(o)具有seqidno:54的氨基酸序列的vh和具有seqidno:68的氨基酸序列的vl；(p)具有seqidno:52的氨基酸序列的vh和具有seqidno:67的氨基酸序列的vl；(q)具有seqidno:54的氨基酸序列的vh和具有seqidno:69的氨基酸序列的vl；(r)具有seqidno:53的氨基酸序列的vh和具有seqidno:58的氨基酸序列的vl；和(s)具有seqidno:41的氨基酸序列的vh和具有seqidno:58的氨基酸序列的vl。本披露还提供了编码lox1-结合蛋白的核酸，含有这些核酸的载体和用这些核酸和载体转化的宿主细胞，以及制备和使用lox1-结合蛋白的方法。
在其他方面，此处的方法可包含分离的lox1-结合蛋白，该结合蛋白包含具有seqidno:3的氨基酸序列的vh-cdr3。在其他方面，lox1-结合蛋白包含具有seqidno:3的氨基酸序列的vh-cdr3以及具有seqidno:2的氨基酸序列的vh-cdr2。在其他方面，lox1-结合蛋白包含具有seqidno:3的氨基酸序列的vh-cdr3以及具有seqidno:5-12或13的氨基酸序列的vh-cdr2。在其他方面，lox1-结合蛋白包含具有seqidno:3、14-17或18的氨基酸序列的vh-cdr3以及具有seqidno:2的氨基酸序列的vh-cdr2。在其他方面，lox1-结合蛋白包含具有seqidno:3、14-17或18的氨基酸序列的vh-cdr3以及具有seqidno:2、5-12或13的氨基酸序列的vh-cdr2。在其他方面，lox1-结合蛋白包含具有seqidno:3、14-17或18的氨基酸序列的vh-cdr3以及具有seqidno:2、5-12或13的氨基酸序列的vh-cdr2以及具有seqidno:1的氨基酸序列的vh-cdr1。本披露还提供了编码lox1-结合蛋白的核酸，含有这些核酸的载体和用这些核酸和载体转化的宿主细胞，以及制备和使用lox1-结合蛋白的方法。
在其他方面，该分离的lox1-结合蛋白包含具有seqidno:32的氨基酸序列的vlh-cdr3。在其他方面，lox1-结合蛋白包含具有seqidno:32的氨基酸序列的vl-cdr3以及具有seqidno:31的氨基酸序列的vl-cdr2。在其他方面，lox1-结合蛋白包含具有seqidno:32的氨基酸序列的vl-cdr3、具有seqidno:31的氨基酸序列的vl-cdr2以及具有seqidno:30的氨基酸序列的vl-cdr1。在其他方面，lox1-结合蛋白包含具有seqidno:32、34或35的氨基酸序列的vl-cdr3以及具有seqidno:31的氨基酸序列的vl-cdr2。在其他方面，lox1-结合蛋白包含具有seqidno:32、34或35的氨基酸序列的vl-cdr3、具有seqidno:31的氨基酸序列的vl-cdr2以及具有seqidno:30的氨基酸序列的vl-cdr1。本披露还提供了编码lox1-结合蛋白的核酸，含有这些核酸的载体和用这些核酸和载体转化的宿主细胞，以及制备和使用lox1-结合蛋白的方法。
在其他方面，lox1-结合蛋白包含一个、两个或三个vh-cdr，诸如与seqidno:1相同或具有总共一个、两个或三个或更少氨基酸取代、缺失或插入的vh-cdr1，与seqidno:2、5-12或13相同或具有总共一个、两个或更少氨基酸取代、缺失或插入的vh-cdr2，或者与seqidno:3、14-17或18相同或具有总共一个、两个、三个、四个或更少氨基酸取代、缺失或插入的vh-cdr3。
在其他方面，lox1-结合蛋白包含一个、两个或三个vl-cdr，诸如与seqidno:30相同或具有总共一个、两个或三个或更少氨基酸取代、缺失或插入的vl-cdr1，与seqidno:31相同或具有总共一个、两个或更少氨基酸取代、缺失或插入的vl-cdr2，或者与seqidno:32、34或35相同或具有总共一个、两个、三个、四个或更少氨基酸取代、缺失或插入的vh-cdr3。
在一些方面，分离的lox1-结合蛋白包含与seqidno:41的参比vh序列相比具有总共一个、两个、三个、四个、五个、六个、七个、八个或更少氨基酸取代、缺失和/或插入的vh序列。本披露还提供了编码lox1-结合蛋白的核酸，含有这些核酸的载体和用这些核酸和载体转化的宿主细胞，以及制备和使用lox1-结合蛋白的方法。
在其他方面，分离的lox1-结合蛋白包含seqidno:41的vh。本披露还提供了编码lox1-结合蛋白的核酸，含有这些核酸的载体和用这些核酸和载体转化的宿主细胞，以及制备和使用lox1-结合蛋白的方法。
在一些方面，分离的lox1-结合蛋白包含与seqidno:58的参比vl序列相比具有总共一个、两个、三个、四个、五个、六个、七个、八个或更少氨基酸取代、缺失和/或插入的vl序列。本披露还提供了编码lox1-结合蛋白的核酸，含有这些核酸的载体和用这些核酸和载体转化的宿主细胞，以及制备和使用lox1-结合蛋白的方法。
在其他方面，分离的lox1-结合蛋白包含seqidno:58的vl。本披露还提供了编码lox1-结合蛋白的核酸，含有这些核酸的载体和用这些核酸和载体转化的宿主细胞，以及制备和使用lox1-结合蛋白的方法。
在一些方面，lox1-结合蛋白包含vh，该vh选自含有具有seqidno:38的氨基酸序列的vh-cdr1、具有seqidno:39、42或43的氨基酸序列的vh-cdr2和具有seqidno:40、44-46或47的氨基酸序列的vh-cdr3的vh；和轻链vl，该轻链可变区选自含有具有seqidno:55或59的氨基酸序列的vl-cdr1、具有seqidno:56或60的氨基酸序列的vl-cdr2和具有seqidno:57、61-63或64的氨基酸序列的vl-cdr3。
在一些方面，分离的lox1-结合蛋白具有包含seqidno:41、48-53或54的序列的vh以及包含seqidno:58、65-69或70的序列的vl。本披露还提供了编码lox1-结合蛋白的核酸，含有这些核酸的载体和用这些核酸和载体转化的宿主细胞，以及制备和使用lox1-结合蛋白的方法。
在一些方面，分离的lox1-结合蛋白包含一组互补决定区(cdr)：重链可变区(vh)-cdr1、vh-cdr2、vh-cdr3和轻链可变区(vl)-cdr1、vl-cdr2、vl-cdr3，其中该cdr组与cdr参考组相同，或与该cdr参考组相比总共具有一个、两个、三个、四个、五个、六个、七个、八个或更少氨基酸取代、缺失和/或插入，其中(a)vh-cdr1具有seqidno:38的氨基酸序列；(b)vh-cdr2具有seqidno:39的氨基酸序列；(c)vh-cdr3具有seqidno:44的氨基酸序列；(d)vl-cdr1具有seqidno:55的氨基酸序列；(e)vl-cdr2具有seqidno:60的氨基酸序列；且(f)vl-cdr3具有seqidno:61的氨基酸序列。本披露还提供了编码lox1-结合蛋白的核酸，含有这些核酸的载体和用这些核酸和载体转化的宿主细胞，以及制备和使用lox1-结合蛋白的方法。
在一些方面，分离的lox1-结合蛋白包含一组互补决定区(cdr)：重链可变区(vh)-cdr1、vh-cdr2、vh-cdr3和轻链可变区(vl)-cdr1、vl-cdr2、vl-cdr3，其中该cdr组与cdr参考组相同，或与该cdr参考组相比总共具有一个、两个、三个、四个、五个、六个、七个、八个或更少氨基酸取代、缺失和/或插入，其中(a)vh-cdr1具有seqidno:38的氨基酸序列；(b)vh-cdr2具有seqidno:39的氨基酸序列；(c)vh-cdr3具有seqidno:40的氨基酸序列；(d)vl-cdr1具有seqidno:55的氨基酸序列；(e)vl-cdr2具有seqidno:56的氨基酸序列；且(f)vl-cdr3具有seqidno:57的氨基酸序列。本披露还提供了编码lox1-结合蛋白的核酸，含有这些核酸的载体和用这些核酸和载体转化的宿主细胞，以及制备和使用lox1-结合蛋白的方法。
在其他方面，lox1-结合蛋白包含一组cdr：vh-cdr1、vh-cdr2、vh-cdr3、vl-cdr1、vl-cdr2和vl-cdr3，其中：(a)vh-cdr1具有seqidno:38的氨基酸序列；(b)vh-cdr2具有seqidno:39的氨基酸序列；(c)vh-cdr3具有seqidno:40的氨基酸序列；(d)vl-cdr1具有seqidno:55的氨基酸序列；(e)vl-cdr2具有seqidno:56的氨基酸序列；且(f)vl-cdr3具有seqidno:57的氨基酸序列。本披露还提供了编码lox1-结合蛋白的核酸，含有这些核酸的载体和用这些核酸和载体转化的宿主细胞，以及制备和使用lox1-结合蛋白的方法。
在其他方面，该分离的lox1-结合蛋白包含具有seqidno:40的氨基酸序列的vh-cdr3。在其他方面，lox1-结合蛋白包含具有seqidno:40的氨基酸序列的vh-cdr3以及具有seqidno:39的氨基酸序列的vh-cdr2。在其他方面，lox1-结合蛋白包含具有seqidno:40的氨基酸序列的vh-cdr3以及具有seqidno:42或43的氨基酸序列的vh-cdr2。在其他方面，lox1-结合蛋白包含具有seqidno:40、44-46或47的氨基酸序列的vh-cdr3以及具有seqidno:39的氨基酸序列的vh-cdr2。在其他方面，lox1-结合蛋白包含具有seqidno:40、44-46或47的氨基酸序列的vh-cdr3以及具有seqidno:39、42或43的氨基酸序列的vh-cdr2。在其他方面，lox1-结合蛋白包含具有seqidno:40、44-46或47的氨基酸序列的vh-cdr3以及具有seqidno:39、42或43的氨基酸序列的vh-cdr2以及具有seqidno:38的氨基酸序列的vh-cdr1。本披露还提供了编码lox1-结合蛋白的核酸，含有这些核酸的载体和用这些核酸和载体转化的宿主细胞，以及制备和使用lox1-结合蛋白的方法。
在其他方面，该分离的lox1-结合蛋白包含具有seqidno:57的氨基酸序列的vlh-cdr3。在其他方面，lox1-结合蛋白包含具有seqidno:57的氨基酸序列的vl-cdr3以及具有seqidno:56的氨基酸序列的vl-cdr2。在其他方面，lox1-结合蛋白包含具有seqidno:57的氨基酸序列的vl-cdr3、具有seqidno:56的氨基酸序列的vl-cdr2以及具有seqidno:55的氨基酸序列的vl-cdr3。在其他方面，lox1-结合蛋白包含具有seqidno:57的氨基酸序列的vl-cdr3、具有seqidno:56或60的氨基酸序列的vl-cdr2以及具有seqidno:55或59的氨基酸序列的vl-cdr1。本披露还提供了编码lox1-结合蛋白的核酸，含有这些核酸的载体和用这些核酸和载体转化的宿主细胞，以及制备和使用lox1-结合蛋白的方法。
在其他方面，lox1-结合蛋白包含一个、两个或三个vh-cdr，诸如与seqidno:38相同或具有总共一个、两个或三个或更少氨基酸取代、缺失或插入的vh-cdr1，与seqidno:39，42或43相同或具有总共一个、两个或更少氨基酸取代、缺失或插入的vh-cdr2，或者与seqidno:40、44-46或47相同或具有总共一个、两个、三个、四个或更少氨基酸取代、缺失或插入的vh-cdr3。本披露还提供了编码lox1-结合蛋白的核酸，含有这些核酸的载体和用这些核酸和载体转化的宿主细胞，以及制备和使用lox1-结合蛋白的方法。
在其他方面，lox1-结合蛋白包含一个、两个或三个vl-cdr，诸如与seqidno:55或59相同或具有总共一个、两个或三个或更少氨基酸取代、缺失或插入的vl-cdr1，与seqidno:56或60相同或具有总共一个、两个或更少氨基酸取代、缺失或插入的vl-cdr2，或者与seqidno:57、61-63或64相同或具有总共一个、两个、三个、四个或更少氨基酸取代、缺失或插入的vh-cdr3。本披露还提供了编码lox1-结合蛋白的核酸，含有这些核酸的载体和用这些核酸和载体转化的宿主细胞，以及制备和使用lox1-结合蛋白的方法。
在一些方面，lox1-结合蛋白包含一组cdr：如表1所述的vh-cdr1、vh-cdr2、vh-cdr3、vl-cdr1、vl-cdr3和vl-cdr3。本披露还提供了编码lox1-结合蛋白的核酸，含有这些核酸的载体和用这些核酸和载体转化的宿主细胞，以及制备和使用lox1-结合蛋白的方法。
在一些其他方面，lox1-结合蛋白包含如表1中所述的重链可变区(vh)和轻链可变区(vl)。本披露还提供了编码lox1-结合蛋白的核酸，含有这些核酸的载体和用这些核酸和载体转化的宿主细胞，以及制备和使用lox1-结合蛋白的方法。
在一些方面，分离的lox1-结合蛋白包含具有氨基酸序列gfdpedhx1hx2hx3hx4hx5hx6qkfqg(glypheaspprogluasphx1hx2hx3hx4hx5hx6glnlyspheglngly)的vh-cdr2，其中hx1是gly、trp、tyr或phe；hx2是glu、thr、gln、ser、lys或ala；hx3是thr、tyr、ile或asn；hx4是ile、ala、arg或his；hx5是tyr、val、thr、leu或gln，且hx6是ala、asp、gly、ser或his(seqidno:71)。
在其他方面，分离的lox1-结合蛋白包含具有氨基酸序列hx7hx8ghx9hx10hx11hx12gvrgwdyyygmdv(hx7hx8glyhx9hx10hx11hx12glyvalargglytrpasptyrtyrtyrglymetaspvaltrp)的vh-cdr3，其中hx7是pro、ser或val；hx8是asn、thr、trp或asp；hx9是gln、arg或thr；hx10是gln或his；hx11是gly或gln；hx12是lys或gly(seqidno:72)。
在其他方面，分离的lox1-结合蛋白包含具有氨基酸序列qsydslx1lx2lx3lx4lx5lx6(glnsertyraspserlx1lx2lx3lx4lx5lx6)的vl-cdr3，其中lx1是ser或met；lx2是leu、tyr或his；lx3是ser或arg；lx4是gly、ala或无氨基酸；lx5是trp或phe；且lx6是val、gly或ala(seqidno:73)。
在一些方面，分离的lox1-结合蛋白包含一组互补决定区(cdr)：重链可变区(vh)-cdr1、vh-cdr2、vh-cdr3和轻链可变区(vl)-cdr1、vl-cdr2和vl-cdr3，其中：(a)vh-cdr1包含氨基酸序列：elsmh(seqidno:1)；(b)vh-cdr2包含氨基酸序列：gfdpedhx1hx2hx3hx4hx5hx6qkfqg，其中hx1选自下组，该组由以下组成：g、w、y和f，hx2选自下组，该组由以下组成：e、t、q、k、a和s，hx3选自下组，该组由以下组成：t、y、i和n，hx4选自下组，该组由以下组成：i、a、r和h，hx5选自下组，该组由以下组成：y、v、t、l和q，且hx6选自下组，该组由以下组成：a、d、g、s和h(seqidno:71)；(c)vh-cdr3包含氨基酸序列：hx7hx8ghx9hx10hx11hx12gvrgwdyyygmdv，其中hx7选自下组，该组由以下组成：p、s和v，hx8选自下组，该组由以下组成：n、w、d和t，hx9选自下组，该组由以下组成：q、r和t，hx10选自下组，该组由以下组成：q和h，hx11选自下组，该组由以下组成：g和q，且hx12选自下组，该组由以下组成：k和g(seqidno:72)；(d)vl-cdr1包含氨基酸序列：tgsssnigagydvh(seqidno:30)；(e)vl-cdr2包含氨基酸序列：gnsnrps(seqidno:31)；且(f)vl-cdr3包含氨基酸序列：qsydslx1lx2lx3lx4lx5lx6，其中lx1选自下组，该组由以下组成：m和s，lx2选自下组，该组由以下组成：l、y和h，lx3选自下组，该组由以下组成：s和r，lx4选自下组，该组由以下组成：a和g或被省略(无氨基酸)，lx5选自下组，该组由以下组成：w和f，且lx6选自下组，该组由以下组成：v、g和a(seqidno:73)。
在其他方面，分离的lox1-结合蛋白包含具有氨基酸序列ghx1shx2hx3hx4hx5hx6hx7hx8hx9hx10dsvkg(glyhx1serhx2hx3hx4hx5hx6hx7hx8hx9hx10aspservallysgly)的vh-cdr2，其中hx1是ile或val；hx2是trp或leu；hx3是asn或gln；hx4是ser或glu；hx5是gly、leu或pro；hx6是ser、tyr或asp；hx7是ile、thr或arg；hx8是gly或tyr；hx9是tyr或met；且hx10是ala或asp(seqidno:74)。
在其他方面，分离的lox1-结合蛋白包含具有氨基酸序列eghx11wnydahx12dhx13(gluglyhx11trpasntyraspalahx12asphx13)的vh-cdr3，其中hx11是asn或ser；hx12是phe或leu；且hx13是ile或val(seqidno:75)。
在其他方面，分离的lox1-结合蛋白包含具有氨基酸序列tgtslx1dvggynyvs(thrglythrserlx1aspvalglyglytyrasntyrvalser)的vl-cdr1，其中lx1是ser或asn(seqidno:76)。
在其他方面分离的lox1-结合蛋白包含具有氨基酸序列dvslx2rps(aspvalserx4argproser)的vl-cdr2，其中lx2是asn或lys(seqidno:77)。
在其他方面，分离的lox1-结合蛋白包含据具有氨基酸序列lx3lx4lx5lx6lx7lx8stnwv(lx3lx4lx5lx6lx7lx8serthrasntrpval)的vl-cdr3，其中lx3是ser、leu、met或ala；lx4是ser、gly或gln；lx5是tyr、arg、ser或gly；lx6是thr或met；lx7是ser、trp、gly或val；且lx8是ser或arg(seqidno:78)。
在一些方面，分离的lox1-结合蛋白包含一组互补决定区(cdr)：重链可变区(vh)-cdr1、vh-cdr2、vh-cdr3和轻链可变区(vl)-cdr1、vl-cdr2和vl-cdr3，其中：(a)vh-cdr1包含氨基酸序列：dyamh(seqidno:38)；(b)vh-cdr2包含氨基酸序列：ghx1shx2hx3hx4hx5hx6hx7hx8hx9hx10dsvkg，其中hx1选自下组，该组由以下组成：i和v，hx2选自下组，该组由以下组成：w和l，hx3选自下组，该组由以下组成：n和q，hx4选自下组，该组由以下组成：s和e，hx5选自下组，该组由以下组成：g、l和p，hx6选自下组，该组由以下组成：s、y和d，hx7选自下组，该组由以下组成：i、t和r，hx8选自下组，该组由以下组成：g和y，hx9选自下组，该组由以下组成：m和y，且hx10选自下组，该组由以下组成：a和d(seqidno:74)；(c)vh-cdr3包含氨基酸序列：eghx11wnydahx12dhx13，其中hx11选自下组，该组由以下组成：n和s，hx12选自下组，该组由以下组成：f和l，且hx13选自下组，该组由以下组成：i和v(seqidno:75)；(d)vl-cdr1包含氨基酸序列：tgtslx1dvggynyvs，其中lx1选自下组，该组由以下组成：n和s(seqidno:76)；(e)vl-cdr2包含氨基酸序列：dvslx2rps，其中lx2选自下组，该组由以下组成：n和k(seqidno:77)；且(f)vl-cdr3包含氨基酸序列：lx3lx4lx5lx6lx7lx8stnwv，其中lx3选自下组，该组由以下组成：l、m、a和s，lx4选自下组，该组由以下组成：s、q和g，lx5选自下组，该组由以下组成：y、s、g和r，lx6选自下组，该组由以下组成：t和m，lx7选自下组，该组由以下组成：s、w、g和v，且lx8选自下组，该组由以下组成：s和r(seqidno:78)。
在一些方面，将本文披露的lox1-结合蛋白的cdr组提供在抗体框架区域或本领域中已知的其他蛋白骨架。示例性抗体框架区域包括：种系框架区域，诸如重链的抗体框架区域的vh1-24(dp-5)、jh6、vh3-09(dp-31)和jh3以及轻链的抗体框架区域的vλ1e(dpl-8)、vλ2a2(dpl-11)和jl3和/或本领域的技术人员熟知的任何合适框架区域。
在一些方面，lox1-结合蛋白含有一个或多个来自重链可变区(vh)和/或轻链可变区(vl)的框架区域，其是种系框架。重链结构域的框架区域可选自vh1-24(dp-5)、jh6、vh3-09(dp-31)、jh3框架和/或本领域中熟知的任何合适的框架区域或蛋白骨架。轻链的框架区域可选自vλ1e(dpl-8)、vλ2a2(dpl-11)和jl3框架和/或本领域中熟知的任何合适的框架区域或蛋白骨架。一个或多个cdr可取自本文披露的lox1-结合蛋白(例如表1中所述的lox1-结合蛋白)并掺入合适框架和/或蛋白骨架。
在其他方面，本披露提供了结合与分别包含seqidno:4和seqidno:33的vh和vl的抗体所结合表位相同的lox1表位的分离的lox1-结合蛋白。
在其他方面，此处披露的方法包含lox1-结合蛋白(例如，抗体，诸如全长lox1-抗体、lox1-结合抗体片段、及其变体和衍生物)，其与包含seqidno:4的vh序列和seqidno:33的vl序列的抗体竞争或交叉竞争结合至lox1。在一个特定方面，lox1-结合蛋白能够竞争性地抑制包含seqidno:4的vh和seqidno:33的vl的抗体结合lox1。
还提供了以下方法，该方法包括能以与包含seqidno:29的vh和seqidno:33的vl的lox1-结合蛋白(例如lox1抗体或其片段)相比更大的亲和力结合lox1的lox1-结合蛋白，诸如lox1抗体(例如，全长抗-lox1抗体、lox1-结合抗体片段、及其变体和衍生物)。本披露还提供了编码lox1-结合蛋白的核酸，含有这些核酸的载体和用这些核酸和载体转化的宿主细胞，以及制备和使用lox1-结合蛋白的方法。
在另外的方面，该方法包括结合与分别包含seqidno:41和seqidno:58的vh和vl的抗体所结合表位相同的lox1表位的分离的lox1-结合蛋白。
在其他方面，该方法包括lox1-结合蛋白(例如，抗体，诸如全长lox1-抗体和lox1-结合抗体片段，以及其变体和衍生物)，其与包含seqidno:41的vh序列和seqidno:58的vl序列的抗体竞争或交叉竞争结合至lox1。在一个特定方面，lox1-结合蛋白能够竞争性地抑制包含seqidno:41的vh和seqidno:58的vl的抗体结合lox1。
还提供了以下方法，该方法包括能以与包含seqidno:54的vh和seqidno:70的vl的全长抗体相比更大的亲和力结合lox1的lox1-结合蛋白，诸如lox1抗体(例如，全长抗-lox1抗体和lox1-结合抗体片段以及其变体和衍生物)。本披露还提供了编码lox1-结合蛋白的核酸，含有这些核酸的载体和用这些核酸和载体转化的宿主细胞，以及制备和使用lox1-结合蛋白的方法。
在一些方面，此处讨论的结合至该方法中的抗-lox1抗体是鼠抗体、人抗体、人源化抗体、嵌合抗体、单克隆抗体、多克隆抗体、重组抗体、双特异性抗体、多特异性抗体或它们的任何组合。在一些方面，抗-lox1抗体是fv片段、fab片段、f(ab')2片段、fab'片段、dsfv片段、scfv片段或sc(fv)2片段。
本披露包括以下方法，该方法包含可跨物种地结合至lox1分子的lox1-结合蛋白(例如，分离的抗-lox1抗体，诸如全长lox1-抗体、lox1-结合抗体片段、以及其变体和衍生物)。在一些方面，lox1-结合蛋白结合至人类lox1(hlox1)和食蟹猴lox1(cynolox1)。在其他方面，lox1-结合蛋白结合至人类lox1(hlox1)和兔lox1。在其他方面，lox1-结合蛋白结合至hlox1、cynolox1和兔lox1。在本文提供的某些方面，lox1-结合蛋白(例如，抗-lox1抗体)特异性地结合至lox1(例如，hlox1、cynolox1和/或兔lox1)，且不结合至以下中的一种或多种：clec-7a、clec-1a、clec-4l、clec-1b、sr-a1和/或sr-b3。参见，例如，国际专利申请号pct/ep2015/072644。
在一些方面，lox1-结合蛋白(例如，分离的抗-lox1抗体或其)还包含人类igg1tm突变体重链，其中重链可变区(vh)包含与参考氨基酸序列seqidno:4、19-28或29具有至少70％、75％、80％、85％、90％、95％、96％、97％、98％、99％或100％序列一致性的氨基酸序列。
在一些方面，lox1-结合蛋白(例如，分离的抗-lox1抗体或其)还包含人类igg1tm突变体重链，其中重链可变区(vh)包含与参考氨基酸序列seqidno:41、48-53或54具有至少70％、75％、80％、85％、90％、95％、96％、97％、98％、99％或100％序列一致性的氨基酸序列。
在一些方面，lox1-结合蛋白(例如，全长lox1-抗体、lox1-结合抗体片段、以及其变体和衍生物)包括除了除重链可变区(vh)和轻链可变区(vl)之外还任选地包括重链恒定区或其片段、轻链恒定区或其片段。在某些方面，轻链恒定区是κλ轻链恒定区，例如，人类κ恒定区或人类λ恒定区。在一个具体方面，轻链恒定区是人类κ恒定区。
在其他方面，lox1-结合蛋白(例如，全长lox1-抗体、lox1-结合抗体片段、以及其变体和衍生物)具有含有人类κ恒定区的轻链可变区(vl)，例如，vl包含与参考氨基酸序列seqidno:33、36或37具有至少70％、75％、80％、85％、90％、95％或100％序列一致性的vl氨基酸序列。在某些方面，本披露提供了还包含人类igg1tm突变体重链和人类κ轻链的lox1-结合蛋白(例如，抗-lox1抗体或其片段)，其中重链可变区(vh)和轻链可变区(vl)分别包含：seqidno:4和seqidno:33；seqidno:29和seqidno:33；seqidno:41和seqidno:58；或seqidno:54和seqidno:70。
在其他方面，lox1-结合蛋白(例如，全长lox1-抗体、lox1-结合抗体片段、以及其变体和衍生物)具有还包含人类κ恒定区的轻链可变区(vl)，例如，轻链可包含与参考氨基酸序列seqidno:58、65-69或70具有至少70％、75％、80％、85％、90％、95％或100％序列一致性的轻链氨基酸序列。在某些方面，本披露提供了还包含人类igg1tm突变体重链和人类κ轻链的lox1-结合蛋白(例如，抗-lox1抗体或其片段)，其中重链可变区(vh)和轻链可变区(vl)分别包含：seqidno:41和seqidno:58、seqidno:48和seqidno:65、seqidno:49和seqidno:66、seqidno:50和seqidno:67或者seqidno:53和seqidno:58。
在一些方面，本披露涉及以下方法，该方法包含分离的lox1-结合蛋白，诸如抗-lox1抗体(例如，全长lox1-抗体、lox1-结合抗体片段、以及其变体和衍生物)，其中lox1-结合蛋白具有至少一个选自下组的性质，该组由以下组成：(a)减少或抑制oxldl、c-反应蛋白(crp)和/或晚期糖基化终产物(age)结合至lox1，如通过任何合适测定测量的；(b)减少或抑制表达细胞表面lox1的内皮细胞中的rhoa/rac1、一氧化氮(no)、p38mapk、蛋白激酶b和c、erk1/2和/或nfκb信号传导，如通过任何合适测定测量的；(c)减少或抑制表达细胞表面lox1的内皮细胞中的半胱天冬酶-8、半胱天冬酶-9和/或bax活性，如通过任何合适测定测量的，包括本文披露的测定；(d)结合至具有单核苷酸多态性k167n的lox1，如通过任何合适测定测量的；(e)减少或抑制oxldl内化，如通过任何合适测定测量的；(f)减少或抑制oxldl诱导的lox1信号传导，如通过任何合适测定测量的；(g)以约150pm至约600pm(例如约400pm)的解离常数(kd)结合至lox1，如通过biacore或kinexa测量的；(h)以约1x105m-1s-1至约6x106m-1s-1(例如约5x105m-1s-1)的kon率结合至lox1，如通过由biacore测量的；和(i)以约1x10-4s-1至约3x10-4s-1(例如约2.3x10-4s-1)的koff率结合至lox1，如通过biacore测量的。
在某些实施例中，除上述鉴定的特性之外或作为上述鉴定的特性的替代，lox1结合蛋白具有选自下组的至少一种性质，该组由以下组成：(a)杀死csc；(b)消除csc；(c)抑制csc；(d)降低csc增殖进展和/或进展速率；(e)降低与csc相关的疾病状态的进展和/或进展速率；(f)降低csc自我更新和扩增的能力；和/或(g)诱导csc分化。
在某些方面，lox1-结合蛋白，诸如抗-lox1抗体(例如，全长lox1-抗体、lox1-结合抗体片段、以及其变体和衍生物)可以按小于10-6m、或小于10-7m、或小于10-8m、或小于10-9m、或小于10-10m、或小于10-11m、小于10-12m、小于10-13m,of小于10-14m、或小于10-15m的解离常数或kd特异性地结合至lox1，例如，人类lox1(hlox1)和/或食蟹猴lox1(cynolox1)以及它们的抗原片段，这是通过例如
在另一个方面，lox1-结合蛋白，诸如抗-lox1抗体(例如，全长lox1-抗体、lox1-结合抗体片段、以及其变体和衍生物)可以按小于1×10-3s-1或小于2×10-3s-1的koff结合至lox1。在其他方面，lox1-结合蛋白以小于10-3s-1、小于5×10-3s-1、小于10-4s-1、小于5×10-4s-1、小于10-5s-1、小于5×10-5s-1、小于10-6s-1、小于5×10-6s-1、小于小于5×10-7s-1、小于10-8s-1、小于5×10-8s-1、小于10-9s-1、小于5×10-9s-1或小于10-10s-1的koff结合至lox1，这是通过例如
在另一个方面，lox1-结合蛋白，诸如抗-lox1抗体(例如，全长lox1-抗体、lox1-结合抗体片段、以及其变体和衍生物)可以按至少105m-1s-1、至少5×105m-1s-1、至少106m-1s-1、至少5×106m-1s-1、至少107m-1s-1、至少5×107m-1s-1或至少108m-1s-1或至少109m-1s-1的结合速率常数或kon率结合至lox1，例如，人类lox1(hlox1)和/或食蟹猴lox1，这是通过例如
如上所述，含有vh和/或vl氨基酸序列且结合lox1的lox1-结合蛋白(例如，全长lox1-抗体、lox1-结合抗体片段、以及其变体和衍生物)可与本文所列序列具有至少85％、90％、95％、96％、97％、98％或99％序列一致性(参见例如，表1)。在一些方面，结合lox1的vh和/或vl氨基酸序列相对于本文所列序列包含15或更少(例如，1、2、3、4、5、6、7、8、9、10、11、12、13、14或15个)氨基酸添加、取代(例如，保守取代)或缺失。在一些方面，结合lox1的vh和/或vl氨基酸序列相对于本文所列序列包含8或更少(例如，1、2、3、4、5、6、7或8个)氨基酸添加、取代(例如，保守取代)或缺失。在其他方面，结合lox1的vh和/或vl氨基酸序列相对于本文所列序列包含5或更少(例如，1、2、3、4或5个)氨基酸添加、取代(例如，保守取代)或缺失。含有与vh区域或vl区域具有一定百分比相似性或具有一个或多个取代、缺失和/或插入(例如，保守取代)的vh和vl区域的lox1-结合蛋白(例如抗-lox1抗体或其片段)可通过编码本文所述的vh和/或vl区域的核酸分子的诱变(例如，定点诱变或pcr介导的诱变)获得，随后测试编码的改变的抗体对lox1的结合，并任选地利用本文所述功能测定或本领域中已知可常规地修改以测试保留的功能的测定测试保留的功能。
lox1-结合蛋白，诸如抗-lox1抗体(例如，全长lox1-抗体、lox1-结合抗体片段、以及其变体和衍生物)对lox1的亲和力或亲合力可利用本领域中已知的任何合适方法实验测定，例如，流式细胞术、酶联免疫吸附测定(elisa)或放射免疫测定(ria)或动力学(例如，
本披露还提供了如本文所述的lox1-结合蛋白，诸如抗-lox1抗体(例如，全长lox1-抗体、lox1-结合抗体片段、以及其变体和衍生物)(参见例如，表1)，其中抗体与异源试剂轭合。在某些方面，该试剂是抗微生物剂、治疗剂、前药、肽、蛋白质、酶、脂质、生物反应调节剂、药物制剂、淋巴因子、异源抗体或抗体片段、可检测标记或聚乙二醇(peg)。可以如国际专利申请号pct/ep2015/072644中更详细讨论的那样制备异源轭合物lox1-结合蛋白，该文献通过引用以全文结合至本文。
在某些方面，lox1-结合蛋白不是抗-lox1抗体。本领域中已知各种鉴定和产生以高亲和力结合至蛋白质标靶的非-抗体多肽的方法。参见例如，skerra,curr.opin.biotech.[生物技术的最新观点]18:295-304(2007)，hosse等人，proteinscience[蛋白质科学]15:14-27(2006)，gill等人，curr.opin.biotechnol.[生物技术的最新观点]17:653-658(2006)，nygren，febsj.[欧洲生化联盟杂志]275:2668-76(2008)，和skerra,febsj.[欧洲生化联盟杂志]275:2677-83(2008)，其中每一个通过引用以其全文结合在此。在某些方面，可使用噬菌体展示技术来鉴定/产生lox1-结合蛋白。在某些方面，多肽包含一类选自下组的蛋白骨架，该组由以下组成：锚蛋白、蛋白a、脂质运载蛋白、纤连蛋白结构域、锚蛋白共有重复结构域和硫氧还蛋白。
在某些方面，该方法可包括结合至与一种或多种本文披露的lox1-结合蛋白所结合表位相同的表位的lox1抑制剂(例如，lox1结合蛋白，其包括抗体，例如全长抗-lox1抗体、lox1-结合抗体片段、以及其变体和衍生物)(参见例如，表1)。本文所用的术语“表位”是指能够结合本披露抗体的靶蛋白决定子。表位通常由分子的化学活性表面基团如氨基酸或糖侧链组成，并且通常具有特定的三维结构特征以及特定的电荷特征。构象表位和非构象表位的区别在于：在变性溶剂存在下，与前者的结合丧失但与后者的结合不丧失。此类抗体可基于它们在标准抗原结合或活性测定中与包含seqidno:4的vh序列和seqidno:33的vl序列的抗体和/或seqidno:41的vh序列和seqidno:58的vl序列的抗体交叉竞争(例如，以统计显著方式竞争性地抑制结合这些抗体)的能力被鉴定。
结合lox1抑制剂的该方法还包括结合与本文披露的分离的lox1-结合蛋白所结合表位相同的表位的lox1-结合蛋白，诸如抗-lox1抗体(例如，全长lox1-抗体、lox1-结合抗体片段、以及其变体和衍生物)(参见例如，表1)。
测试lox1-结合蛋白抑制结合例如包含seqidno:4的vh序列和seqidno:33的vl序列的抗体和/或包含seqidno:41的vh序列和seqidno:58的vl序列的抗体的能力证明该测试lox1-结合蛋白可与该抗体竞争结合至lox1；此种lox1-结合蛋白可根据非限制性理论结合至与和之竞争的lox1-结合蛋白(例如，抗-lox1抗体，诸如全长抗-lox1抗体、lox1-结合抗体片段、以及其变体和衍生物)所结合表位相同或相关的lox1上的(例如，结构上相似或空间上邻近的)表位。在一个方面，lox1-结合蛋白结合至与包含seqidno:4的vh序列和seqidno:33的vl序列的抗体所结合表位相同的lox1上的表位。在另一个方面，lox1-结合蛋白结合至与包含seqidno:41的vh序列和seqidno:58的vl序列的抗体所结合表位相同的lox1上的表位。
在一个方面，本披露提供lox1-结合蛋白(例如，抗体，诸如全长lox1-抗体、lox1-结合抗体片段、以及其变体和衍生物)，其与包含seqidno:4的vh序列和seqidno:33的vl序列的抗体竞争结合至lox1。在另一个方面，本披露提供lox1-结合蛋白(例如，抗体，诸如全长lox1-抗体、lox1-结合抗体片段、以及其变体和衍生物)，其与包含seqidno:41的vh序列和seqidno:58的vl序列的抗体竞争结合至lox1。
在其他实施例中，抑制剂可以是包含与lox1mrna的至少一部分互补的多核苷酸的反义分子。在一些实施例中，该反义分子适合用于抑制细胞中mrna翻译的方法中。该反义分子可以包括dna、rna或者dna和rna两者，以及经化学修饰的核酸。此外，在一些实施例中，该反义分子可以是单链或双链的。该反义分子可以包括约10至约500个核苷酸，并且在一些实施例中可以具有任何数量的长度，例如范围是从约11至约200个核苷酸、约12至约100个核苷酸、约13至约75个核苷酸、约14至约50个核苷酸、约15至约40个核苷酸、约16至约30个核苷酸或约17至约25个核苷酸。本领域普通技术人员将会理解，这些范围表示说明性实施例。
在一些实施例中，该抑制剂可以包含减少或抑制lox1表达的sirna分子。在一些实施例中，该sirna分子可以是单链或双链sirna分子，其包含能够与lox1mrna杂交的序列并诱导rna干扰或减少或抑制蛋白质表达的另一个反义机制。sirna分子可以具有允许该sirna分子诱导rna干扰从而减少或抑制lox1蛋白表达的任何序列。在一些实施例中，该sirna分子的长度可以在10和100之间、在12和80之间、在14和60之间、在16和50之间、在17和40之间。适合地，该sirna的长度范围是从18至30个核苷酸，并且在某些实施例中，在约18和约26个核苷酸之间。
在包括抑制性核酸分子的实施例中，这样的抑制剂可以在严格结合条件下与靶lox1核酸序列结合。术语“严格条件”、“严格结合条件”或“严格杂交条件”是指多核苷酸与靶序列杂交的程度将比它与其他序列杂交的程度可检测地更高(例如，超过背景至少2倍)的条件。严格条件的一个非限制性实例包括其中在37℃下在50％甲酰胺、1mnacl、1％sds中进行杂交和在60℃至65℃下在0.1xssc中进行洗涤的那些。
考虑到lox1的多核苷酸序列，抑制性核酸分子可以使用基序来设计，并可使用本领域的标准技术靶向预测为对抑制性活性有效的区域。
可替代地或另外地，可以使用适合于确定lox1的活性且本领域技术人员可用的任何其他方法。如上所讨论的，当与对照相比时，可用于在此所述的各个方面和实施例中的抑制剂可以将lox1的活性抑制至少10％、至少20％、至少30％、至少40％、至少50％、至少60％、至少70％，更优选地至少80％、至少90％、至少91％、至少92％、至少93％、至少94％、至少95％、至少96％、至少97％、至少98％或至少99％。在特定实施例中，抑制剂将lox1的活性有效抑制至少50％、至少60％或至少70％。在其他实施例中，所述抑制剂可以将lox1的活性抑制至少85％至约100％、至少90％至约100％、至少95％至约100％、或约100％。
在实施例中，抑制剂可以组合在包括一种或多种适合于治疗或预防肿瘤疾病和/或癌症的其他活性剂的组合物中。此类活性化合物的一些非限制性实例包括本领域通常已知的化学治疗剂，例如像吉西他滨
c.药物组合物和配制品
在一些方面，本披露提供药物组合物。此类药物组合物可以是包含lox1的抑制剂或多于一种lox1抑制剂的任何组合的组合物。此类药物组合物还可以是包含药学上可接受的赋形剂的组合物。在某些方面，本披露的药物组合物用作药剂。
在某些方面，在此披露的抑制剂可以与药学上可接受的载剂、赋形剂或稳定剂一起配制成药物组合物。在某些方面，这类药物组合物适于使用本领域中已知的方法经由任何一个或多个给予途径来给予人或非人动物。如熟练的业内人士将理解，给予途经和/或方式将随所希望的结果而变化。术语“药学上可接受的载体”是指不干扰活性成分的生物活性的有效性的一种或多种无-毒材料。可以选择对于所希望或所要求的给予方式、溶解度和/或稳定性来说适合的药学上可接受的载体。
当用于体内给予时，本披露的配制品应是无菌的。本披露的配制品可以通过各种灭菌方法灭菌，包括无菌过滤、辐射等。在一个方面，将该配制品用预先灭菌的0.22微米过滤器过滤灭菌。用于注射的无菌组合物可以根据“remington:thescience&practiceofpharmacy”,21sted.,lippincottwilliams&wilkins,(2005)[“雷明顿药物科学与实践”，第21版，利平科特威廉斯威尔金斯出版公司(2005)]中描述的常规药学实践来配制。
在此方面的实施例中，治疗组合物可以配制用于特定的给予途经，如口服、经鼻、经肺、局部(包括经颊和舌下)、经直肠、经阴道和/或肠胃外给予。如在此使用的措辞“肠胃外给予(parenteraladministration)”和“肠胃外给予(administeredparenterally)”是指除了肠道和局部给予以外的给予方式，通常通过注射，并且包括但不限于静脉、肌肉内、动脉内、鞘内、囊内、眶内、心内、皮内、腹膜内、经气管、皮下、表皮下、关节内、囊下、蛛网膜下、脊柱内、硬脑膜外以及胸骨内注射和输注。本披露的适合于局部或经皮给予的配制品包括粉剂、喷雾剂、软膏剂、糊剂、乳剂、洗剂、凝胶剂、溶液、贴剂以及吸入剂。这些抑制剂和其他活性物可以在无菌条件下与药学上可接受的载体混合、并且与可能要求的任何防腐剂、缓冲剂、或推进剂混合(美国专利号7,378,110；7,258,873；7,135,180；美国专利号2004-0042972；以及2004-0042971)。
这些配制品可以合宜地呈现为单位剂型，并且可以通过药学领域已知的任何方法来制备。本披露的药物组合物中的活性成分的实际剂量水平可以变化以便于获得有效实现对于具体的患者、组合物、以及给予方式来说希望的治疗应答而对患者无毒的量(例如，“治疗有效量的”)的活性成分。选择的剂量水平将取决于各种药代动力学因素，包括所采用的具体组合物的活性、给予途径、给予时间、所采用的具体化合物的排泄率、治疗持续时间，与所采用的具体组合物组合使用的其他药物、化合物和/或材料，所治疗的患者的年龄、性别、体重、状况、总体健康和先前病史、以及在医学领域中熟知的类似因素。
本披露类似地涵盖：还可以制备适于诊断和研究使用的配制品。这类配制品中的活性剂的浓度以及赋形剂的存在或缺乏可以基于具体应用和预期用途来选择。
d.试剂盒
本披露的另一个方面涉及试剂盒。在一个方面，试剂盒包括如上所述的任何抑制剂、试剂、组合物或药物组合物，以及指导适当使用或给予的说明书或标签。任选地，试剂盒还可以包括一个或多个容器和/或注射器或其他装置以便于递送或使用。本披露考虑用于进行研究测定、诊断测定和/或用于给予治疗有效量的组分的全部或任何子集可以封装在试剂盒中。类似地，试剂盒可以包括通过例如在适合的条件下在本披露的抑制剂与治疗或诊断部分之间形成共价键以形成轭合物来制备轭合物的说明书。通过举出另外的实例，用于本披露的治疗性方法中的试剂盒可以包括含有lox1的一种或多种抑制剂的药物配制品溶液或一种或多种抑制剂的冻干制剂，以及用于将该组合物给予至对其有需要的患者和/或用于重构冻干产物的说明书。
本披露还涵盖完成包装的并且带标签的药物产品。这种制造物品包括在适当器皿或容器(例如，玻璃小瓶或其他密封容器)中的适当的单位剂型。在适于肠胃外给予的剂型的情况下，活性成分是无菌的，并且适于作为无颗粒溶液给予。在某些方面，该配制品适合于静脉给予，例如对人或动物的静脉输注。
在特定的方面，将本披露的配制品配制为在单剂量小瓶中的无菌液体。示例性的容器包括但不限于小瓶、瓶子、预填充注射器、iv包、泡罩包装(包括一个或多个药丸)。任选地，与这样一个或多个容器相关的可以是由管理药物或生物制品的制造、使用或销售的政府机构规定的形式的公告，所述公告反映针对人类诊断和/或给予的政府机构对制造、使用或销售的许可。
与任何药物产品一样，包装材料和容器被设计为在储存和装运期间保护产品的稳定性。此外，本披露的产品包括建议医师、技术员或患者关于如何适当预防或治疗所讨论的疾病或障碍的使用说明书或其他信息材料。换句话说，制造物品包括指示或建议给药方案(包括但不限于实际剂量、监测程序等)，以及其他监测信息的说明书工具。
用于诊断测定的试剂盒可以包括含有在此披露的lox1的抑制剂的溶液，或者可替代地或另外还包括用于检测lox1的存在的试剂。不同试剂可以根据本领域已知的和在此描述的方法标记，包括但不限于例如小分子荧光标签、蛋白质例如生物素、gfp或其他荧光蛋白，或表位序列例如his或myc的标记物。类似地，试剂盒中可包括用于检测lox1的一级抗体。一级抗体可以针对lox1上的序列或针对可用以标记lox1的标记物、标签或表位。一级抗体可以进而被标记用于检测，或者如果需要进一步扩增信号，则一级抗体可以通过二级抗体检测，二级抗体也可以包括在试剂盒中。
也考虑用于研究用途的试剂盒。这样的试剂盒可以例如类似于旨在用于诊断或治疗用途的试剂盒，但还包括指定试剂盒及其使用仅限于研究目的的标签。
标记物、轭合物和部分
本披露涉及方法、组合物和试剂盒，其包括为了诊断和其他测定的目的可以与标记物轭合的试剂，其中一种或多种靶分子可以由这样的一种或多种经标记的试剂结合和检测。标记物包括但不限于发色团、荧光团、荧光蛋白、磷光性染料、叠层染料(tandemdye)、颗粒、半抗原、酶以及放射性同位素。
在某些方面，这些试剂轭合至荧光团。附接至所述试剂上的荧光团的选择将确定被轭合的分子的吸收和荧光发射特性。可以使用的荧光团标记的物理特性包括但不限于，光谱特征(吸收、发射和斯托克斯位移)、荧光强度、寿命、极化以及光致漂白率、或其组合。所有这些物理特性可以用于将一个荧光团与另一个荧光团区分开，并且从而允许多元分析。荧光标记的其他适合的特性可以包括细胞渗透性和低毒性，例如，如果在细胞或生物体(例如，活体动物)中进行所述试剂的标记。
在某些方面，酶是标记物并且轭合至试剂。酶可以是适合的标记物，因为可以获得可检测信号的扩大，导致测定灵敏度增加。酶自身不产生可检测的响应，但是当它被适当的底物接触时，起到分解底物的作用，这样使得被转化的底物产生荧光、比色或发光信号。因为标记试剂上的一种酶可以导致多个底物被转化成可检测的信号，所以酶将可检测的信号放大。选择酶底物以产生优选的可测量的产物，例如，比色、荧光或化学发光。这种底物广泛用于本领域并且是本领域技术人员熟知的，包括例如氧化还原酶如辣根过氧化物酶和底物如3,3’-二氨基联苯胺(dab)；磷酸酶，例如酸性磷酸酶、碱性磷酸酶以及底物例如5-溴-6-氯-3-吲哚基磷酸(bcip)；糖苷酶，例如β-半乳糖苷酶、β-葡糖醛酸糖苷酶或β-葡糖苷酶以及底物如5-溴-4-氯-3-吲哚基-β-d-吡喃半乳糖苷(x-gal)；另外的酶包括水解酶如胆碱酯酶和肽酶、氧化酶如葡萄糖氧化酶和细胞色素氧化酶、以及还原酶，对于这些酶适合的底物是已知的。
酶以及其产生化学发光的适当底物适合于一些测定。这些包括但不限于天然和重组形式的荧光素酶和水母发光蛋白。磷酸酶、糖苷酶和氧化酶的产生化学发光的底物，如含有稳定的二氧杂环丁烷、鲁米诺、异氨基苯二酰肼以及吖啶酯的那些也是有用的。
在另一个方面，也利用如生物素的半抗原作为标记物。生物素是有用的，这是因为它可以在酶系统中起作用以进一步放大可检测的信号并且它可以充当一个有待在亲和色谱中使用用于分离目的标签。出于检测目的，使用对于生物素具有亲和力的酶轭合物，如抗生物素蛋白-hrp。随后添加一种过氧化物酶底物以产生可检测的信号。
半抗原还包括激素、天然存在和合成的药物、污染物、过敏原、影响分子、生长因子、趋化因子、细胞因子、淋巴因子、氨基酸、肽、化学中间体、核苷酸及相似物。
在某些方面，荧光蛋白可以轭合至所述试剂作为标记。荧光蛋白的实例包括绿色荧光蛋白(gfp)和藻胆蛋白以及其衍生物。荧光蛋白，特别是藻胆蛋白，对于产生叠层染料标记的标记试剂尤其有用。出于获得较大的斯托克斯位移的目的，这些叠层染料包括荧光蛋白和荧光团，其中发射光谱从荧光蛋白的吸收光谱的波长发生更远的位移。
在某些方面，标记物是放射性同位素。适合的放射性材料的实例包括但不限于：碘(121i、123i、125i、131i)、碳(14c)、硫(35s)、氚(3h)、铟(111in、112in、113min、115min)、锝(99tc、99mtc)、铊(201ti)、镓(68ga、67ga)、钯(103pd)、钼(99mo)、氙(135xe)、氟(18f)、153sm、177lu、159gd、149pm、140la、175yb、166ho、90y、47sc、186re、188re、142pr、105rh以及97ru。
在一些方面，药物或毒素可以轭合至所述试剂。例如，试剂可以与细胞毒性药物轭合。在这个实例中，试剂可以与lox1或lox1与配体或受体之间的复合物结合，并且然后将细胞毒性药物递送至细胞。在一些实施例中，该试剂-轭合物可以在细胞中内化，其将该细胞毒性药物释放到该细胞中。可以轭合本领域中已知的任何细胞毒性药物。一些抗体轭合物已经被fda批准或正在进行临床试验。
呈现下面的实例以便提供上面披露的一些方面和实施例的附加说明。这些实例不应以任何方式被解释为限制本披露或所附权利要求的范围的宽度。
实例
实例1：癌症干细胞富集的细胞群的产生
使用衍生自患者的三种异种移植物(pdx)胰腺肿瘤作为用于筛选的癌症干细胞(csc)的来源。使用晚期和转移性肿瘤来更好地代表临床中看到的患者群体。将切下的肿瘤切成2mm3碎片，并在含有200单位/ml胶原酶(collagenase)iv(worthingtonbiologics公司)的dmem/f12培养基中解离，每10-15分钟机械破碎，直至组织完全解离。然后将细胞在汉克氏(hanks’)平衡盐溶液(hbss)中洗涤2次并通过40微米细胞过滤器。通过将解离的肿瘤细胞铺板到间充质干细胞培养基(mscgm，lonza[隆萨])中的超低附着6孔板中来富集csc。将细胞培养4天然后收获，使用accutase解离并冷冻在cryostar5培养基中。合并细胞悬液以获得淘选和筛选所需的8000万个细胞。
富集胰腺pdx衍生的癌症干细胞。为了富集csc，将购自杰克逊实验室(jacksonlaboratories)的三种不同模型(图1a)的胰腺pdx肿瘤解离成单细胞并于非粘附无血清培养条件下铺板。这导致肿瘤球体的形成(图1b)，在此前显示出csc富集。通过已知在干细胞生物学中起重要作用的基因ezh2、bmi1、sox2和nanog的qpcr以及可用于定义胰腺csc的表面标记cd24和cd44的qpcr确定csc的富集。图1c示出了当将总肿瘤细胞与铺板后第4天收集的球体比较时，所有干性基因(stemnessgene)的基因表达增加40-300倍。然后使用设计的锚重复蛋白“darpin”文库(molecularpartners公司)(参见实例2)将球体解离成单细胞以用于表型选择。
csc球体对比总肿瘤细胞的qpcr。在铺板时，每个解离的pdx模型的300,000个细胞被快速冷冻以用作“总肿瘤”群体。孵育4天后，通过以800rpm离心收获球体。然后用accutase将球体解离并在hbss中洗涤2次。然后快速冷冻三十万个csc球体细胞以与总肿瘤进行比较。按照生产商的说明，使用rneasyplus微型试剂盒(qiagen公司)从冷冻颗粒制备rna。使用nanodrop定量rna。使用superscriptii(lifetechnologies[生命科技公司])在含有10ngrna的反应中逆转录rna。按照制造商的说明书，使用taqman预扩增主要混合物(taqmanpreampmastermix)试剂盒扩增得到的cdna。预扩增后，将反应物以1:20稀释，并将5μl用于taqmanqpcr反应(lifetechnologies[生命科技公司])并在fastdxreal-timepcr仪上运行。
实例2：鉴定增强与癌症干细胞的结合的结合剂
进行噬菌体展示细胞淘选以鉴定与富集的胰腺csc细胞群体结合的darpin。由molecularpartners公司许可的darpin文库对由3种pdx模型形成的球体细胞进行亲和力选择(lloydc等人modellingthehumanimmuneresponse:performanceofa1011humanantibodyrepertoireagainstabroadpaneloftherapeuticallyrelevantantigens[人类免疫应答建模：针对广泛的治疗相关抗原的1011人类抗体库的表现]proteinengdessel[蛋白质工程设计与选择]2009)。
鉴定具有与胰腺csc富集的结合的darpin。图2示出了一般筛选活动的概述。darpin文库首先取消了针对我们不希望分离抗体的重组蛋白的选择。取消选择后，使用富集胰腺pdx球体的csc进行淘选。选择后，使用胰蛋白酶和随后的tea洗脱darpin。针对与从胰腺pdx模型pa-0165分选的csc(cd24+cd44+epcam+细胞)和正常胰腺上皮细胞两者的结合，评估洗脱的darpin。如通过荧光微孔分析技术(fmat)所测量的，stem0268结合至通过流式细胞术富集的从pa-0165肿瘤中分选的csc，但不结合至正常胰腺上皮细胞(图3a)。图3a中的插图示出了细胞的亮视野图像。还使用荧光辅助细胞分选(facs)针对与其他正常上皮细胞系(支气管、结肠和肾)的结合筛选darpin(10ug/ml)。stem0268示出了与肾上皮细胞的微结合，但不与支气管和结肠上皮细胞结合(图3b)。通过facs分析进一步检测结合，其中如与在标准组织培养条件下生长的细胞相比，stem0268示出与pa-0165和pa-0143pdx模型(分别为图4a和图4b)的结合，并示出与由hpac细胞系产生的球体结合的显著增加(图4c)。
darpin与胰腺肿瘤细胞、正常上皮细胞和csc的结合。胰腺癌细胞系购自atcc。正常的胰腺上皮细胞购自cellsystems公司并根据制造商的说明书进行维持。肾上皮细胞、肝细胞和结肠上皮细胞均购自sciencellresearchlaboratories[sciencell研究实验室]并根据制造商的说明书进行维持。心肌细胞和人类支气管上皮细胞均购自promocell公司并按照生产商的说明书进行培养。首先用0.05％胰蛋白酶分离细胞系，或按照上述相同的方案解离胰腺pdx肿瘤块。将细胞在由1xhbss、2％牛血清白蛋白和0.5mmedta组成的流式细胞术缓冲液中洗涤。计数重新悬浮的细胞并以每孔不超过200,000个细胞的密度转移到96孔u形底板的孔中。然后将细胞与2μg/ml的darpin克隆在4℃孵育1小时。细胞在流式细胞仪缓冲液中洗涤，并且将再悬浮的细胞在4℃在黑暗中用apc-山羊抗人fc片段特异性二级抗体染色30分钟。将细胞洗涤并重悬于含有dapi的流式细胞术缓冲液中进行活力染色。在lsrii流式细胞仪上读取样品并使用flowjo软件分析。
b对csc筛选darpin活性。使用用于选择的胰腺pdx模型(pa-0143)中的一种针对抑制球体形成的能力筛选示出优选结合模式的darpin。简而言之，在肿瘤细胞解离后，将它们铺板在含有50μg/mldarpin的mscgm的96孔超低附着板中。所有的darpin都进行了三次重复测试。4天后，读板，并鉴定抑制性分子为，与未处理和对照darpin处理的孔的平均值相比，示出至少1个标准偏差(sd)的抑制活性。还进行了基于ezh2在csc中的表达的第二测定。我们以前在胰腺癌中已经说明，csc可以基于它们对ezh2的高表达和在赖氨酸27上的组蛋白3的三甲基化来鉴定(vanvlerkenl等人2013ezh2isrequiredforbreastandpancreaticcancerstemcellmaintenanceandcanbeusedasafunctionalcancerstemcellreporter[ezh2是乳腺癌和胰腺癌干细胞维持所必需的，并且可用作功能性癌症干细胞报道子]stemcellstranslmed[干细胞转化医学]2(1):43-52)。使用hpac细胞，如先前所述进行ezh2测定，其中包含50μg/mldarpin。从未处理和对照孔的平均值抑制至少1sd的darpin被认为是阳性命中。
实例3：癌症干细胞的抑制剂
stem0268抑制癌症干细胞。为了确定stem0268是否能够抑制csc，我们测试了其抑制胰腺pdx模型的肿瘤球体形成的能力。简而言之，使用200单位/ml的胶原酶iv将细胞解离、铺板、洗涤计数并以30,000个细胞/ml重悬于mscgm(lonza[隆萨])中，并铺板于超低附着的6孔板中。以50μg/ml将抗体添加到适当的孔中。孵育4天后，收集球体，解离并以类似的方式再铺板以产生二次球体并评估csc自我更新的能力。stem0268与未处理或对照darpin-fc(图5a)模型相比在pa-0143中示出27％的抑制，并且在pa-0165模型中(图5b)示出25％的抑制。还测量了stem0268减少ezh2高细胞数量的能力，我们之前已经证明所述细胞标记了hpac细胞系中的胰腺csc(vanvlerkenl等人2013)。如图5c所示，与darpin-fc对照相比，stem0268将ezh2高细胞减少43％(p<0.005)。在这两个实验中，盐霉素(1μm)都作为阳性对照(guptapb等人2009)。这些实验共同证明stem0268可以抑制胰腺pdx模型的csc。
实例4：鉴定lox1为抑制癌症干细胞的靶标
barpin靶标鉴定。为了鉴定stem0268的靶标，我们如先前所述(yao等人)筛选过表达蛋白的hek293细胞的文库。简而言之，将由4319个哺乳动物表达载体(各自编码独特膜蛋白)构成的质粒文库分别转染到hek293t细胞中。将stem0268蛋白在培养基中稀释，与alexafluor647轭合的抗人iggfc二级抗体混合，并添加到转染的细胞中。将细胞与蛋白质在37℃下孵育过夜，并且然后通过共聚焦显微镜检测结合。然后通过facs筛选阳性显微命中。图6a示出了stem0268与过表达lox1的细胞的facs结合。使用fcγ受体2b(fcgr2b)作为与darpin-fc结合的阳性对照。示出了stem0268与其他非靶标蛋白(s1pr2和bmpr1a)的facs结合的实例。为了证实stem0268的靶标的这种鉴定，使用带有flag-标记的重组人类lox1(rhlox1)进行elisa。stem0268确实与rhlox1结合(图6b)。对照darpin-fc都没有结合，并且抗flag抗体也能够检测带有flag-标记的rhlox1。通过octet分析进一步证实了stem0268与lox1结合的能力(图6c)。
lx5140110抑制癌症干细胞。为了进一步确认lox1抑制剂抑制csc球体形成的能力，将包含含有seqidno:33的vl和含有seqidno:4的vh的lox1特异性单克隆抗体(mab)lx5140110(参见例如，表1)与stem0268比较，该比较针对它们抑制胰腺pdx模型中球体形成的能力进行。lx5140110抑制pa-0165和pa-0143模型(图7a)中的球体形成，其程度与stem0268相似。此外，lx5140110能够抑制来自多个胰腺(图7b)和结直肠细胞系(图7c)的csc。
用pa-0143进行体内研究以确定lx5140110体内抑制csc的能力。通过套管针将肿瘤碎片植入6-8周龄的nsg小鼠(nod.cg-prkdcscidil2rgtm1wjl/szj)中将pa-0143pdx肿瘤传代并使其生长至约300mm3，此时将它们随机化并通过皮下注射对照igg1mab或lx5140110，以30mg/kg每周两次持续2周(图8a)进行处理。正如预期的那样，与载体处理的和同样以30mg/kg给药的对照非特异性igg1(p<0.001，tukey比较测试)相比，lx51401110仅略微减少了pa-0143模型的肿瘤生长，因为lox1似乎主要在csc上表达，csc仅代表肿瘤的一小部分。在最后一剂抗体后24小时，将肿瘤从小鼠亚组中取出并分析csc的百分比。与载体对照相比，lx5140110示出了csc的显著减少(图8b)。
lx5140110和化学治疗的组合导致抗肿瘤细胞功效提高。鉴于尽管肿瘤负荷减轻，化学治疗和甚至一些靶向治疗可以富集csc，使用csc特异性靶向治疗与这些药物组合的联合疗法成为治疗癌症患者的有吸引力的方法。由于lx5140110特异性靶向csc，我们试图解决胰腺癌护理化学治疗的当前标准——吉西他滨和lx5140110的联合作用。首先测试了吉西他滨抑制pan02.13的能力。在具有和不具有100ng/ml吉西他滨的标准组织培养条件下，在组织培养物包被的平底板(n＝10)中铺板pan02.13细胞。在100ng/ml时，细胞数目显著减少(图9a，p<0.001学生双尾t检验(student’stwo-tailedt-test))。为了确定治疗对csc的作用，将pan02.13在标准组织培养条件下用50μg/ml的lx5140110或对照抗体与具有或不具有100ng/ml的吉西他滨(gem)处理4天，然后通过流式细胞仪分析csc的百分比。针对每种治疗条件确定csc(epcam+cd24+cd44+)的百分比。首先使用散射和dapi对细胞进行门控，以获得单个活细胞。使用荧光减一(fmo)对照用于门控，分析epcam+群体的cd44和cd24表达。图9b中报道了活细胞的csc的频率。在这些条件和时间点下，lx5140110示出了csc略有减少。如已经报道的，吉西他滨富集csc，并且该富集不受非特异性igg1的包含的影响。然而，用lx5140110进行处理不仅抑制了这种增加，而且还将csc的百分比从基线水平略微降低(0.62％对比0.81％，对于不具有吉西他滨的对照igg1)。
抑制lox1可减少化学治疗引起的心肌细胞损伤。尽管化学治疗和抗csc靶向治疗的组合可能在临床中有用，但已知除了抗肿瘤活性以外，许多化学治疗还具有意想不到的有害副作用。一种此类副作用是心脏损害，心脏损害导致心肌细胞死亡和心力衰竭。已经示出，lox1在阿霉素介导的心肌细胞损害中起主要作用(参见，spallarossa等人，biochemicalandbiophysicalresearchcommunications[生物化学和生物物理研究通讯](2005)335188-196，yokoyama等人，(2016)plosone[公共科学图书馆·综合]11(5):e0154994.doi:10.1371/journal.pone.0154994)。首先，我们检测了在人类主动脉内皮细胞(haec)和胚胎干细胞衍生的心肌细胞中应答阿霉素处理的lox1表达。氧化ldl(ox-ldl)是lox1的常规配体并且作为对照添加，因为之前的报道示出在大鼠心肌细胞中响应于ox-ldl的lox1增加(spallarossa等人，(2005))。将四万个细胞铺板在96孔板中并用单独的培养基或含有5μm阿霉素的培养基处理24小时。然后将细胞刮下来，并用含有蛋白酶抑制剂的1xripa缓冲液在冰上裂解1小时。将上样缓冲液添加到每个样品中，然后在90℃加热10分钟。在4％-12％bis-tris梯度凝胶中每泳道加载12微升样品。在mops缓冲液中，将凝胶在200v下运行40min。使用iblot将蛋白转移到硝化纤维素膜上。用酪蛋白溶液将膜过夜封闭。在酪蛋白封闭缓冲液中将lx5140110以1μg/ml添加至膜上并在室温下孵育1h。用tbst缓冲液将膜洗涤3次，每次5分钟。在酪蛋白封闭缓冲液中以1:5000稀释度添加与hrp轭合的抗人fc抗体，并在室温下温育1h。将膜用tbst洗涤两次，每次10min，然后用tbs缓冲液最后洗涤15min。添加supersignalelisapico化学发光底物持续1min。将膜暴露于胶片上并使其显影。如图10a所示，在ox-ldl和dox处理的人类主动脉内皮细胞中上调lox1蛋白，这是心脏中化学治疗剂的首次出现。有趣的是，我们还检测到用5μmdox处理的心肌细胞中lox1表达的增加(图10b)。
接下来，我们试图确定抑制lox1是否可以阻断阿霉素介导的心肌细胞损害。cytiviatm心肌细胞购自gehealthcare[ge医疗集团]，并按照生产商的说明书进行铺板，用牛纤连蛋白替代人纤连蛋白。使细胞粘附4天，并且然后更换培养基。在第5-7天，除去培养基并在添加5μm阿霉素(dox)之前将细胞与指定浓度的lx5140110一起预孵育4小时。添加dox后，将细胞再孵育24小时。孵育后，除去培养基，并用dapi(1:4000稀释度1mg/ml)、toto-3(1ul染料溶液/1ml培养基)和5μmfluo-4进行细胞染色。将细胞在37℃孵育1小时，并且然后在gein细胞分析仪[geincellanalyzer]上的image上成像。通过获得不包括dapi和toto-3染料的细胞的数量来确定活力，而使用fluo-4来测定钙浓度。已知心肌细胞在内毒素诱导的心脏功能障碍期间示出钙负荷增加。(thompson等人，pediatricresearch，[儿科研究](2000)47:669-676)。如图11a所示，与示出心肌细胞功能障碍的未处理对照相比，在用5μmdox孵育的心肌细胞中钙浓度增加约2.5倍。重要的是，由于dox处理，lx5140110能够抑制钙的积累。此外，dox导致心肌细胞活力降低(图11b)，lox1抑制剂lx5140110再次逆转了心肌细胞活力的降低。
讨论
上述实例中的数据证明了lox1先前未知的和意想不到的功能，除了其在冠状动脉和循环系统健康方面的已知作用。具体地，在此呈现的研究证明，就癌症而言，lox1在csc功能上具有特定的作用，代表了以前未报告的发现。在几个说明性实例中，结果示出在胰腺癌和结直肠癌模型中，lox1由csc过表达并且在csc活性中具有功能性作用，因为向pdx模型外源给予lox1抑制剂(darpin和mab)提供了直接的csc抑制。此外，上述实例中的数据示出lox1抑制剂可以抑制由化学治疗诱导的csc的增加，并且使这些的组合使用成为有吸引力的临床范例。此外，我们在上述实例中提供了证据，即lox1抑制剂也可以保护免受由化学治疗引起的心脏损害，所述心脏损害是用这些药物治疗的患者的显著问题。
大量的临床前和临床证据指出csc在癌症治疗中具有关键功能，因此靶向这一肿瘤细胞群的治疗可具有很高的价值。这里描述的工作不仅指明lox1在csc维持中的新颖和重要作用，而且表明lox1的中和可以是抑制csc功能的有用策略，并且通过阻断lox1抑制csc可以允许改善患者生活的独特和有效的治疗的出现。
通过引用的结合
在此提及的所有公开物和专利特此以其全文通过引用而结合，如同每个单独的出版物或专利被明确且单独地表明通过引用而结合。
虽然已经讨论了本披露的特定方面，但上述说明是说明性而非限制性的。通过回顾此说明书和以下权利要求，本披露的多种变体对于本领域的技术人员而言将变得明显。应通过参考权利要求、连同它们的等效物的全部范围、以及说明书、连同这类变体，确定本披露的全部范围。
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<210>34
<211>10
<212>prt
<213>人工序列
<220>
<223>lx5140094cdr-3轻链序列
<400>34
glnsertyraspsermettyrargphegly
1510
<210>35
<211>11
<212>prt
<213>人工序列
<220>
<223>lx5140093cdr-3轻链序列
<400>35
glnsertyraspserserhisargalatrpala
1510
<210>36
<211>110
<212>prt
<213>人工序列
<220>
<223>lx5140094轻链序列
<400>36
glnservalvalthrglnproproservalserglyalaproglygln
151015
argvalthrilesercysthrglyserserserasnileglyalagly
202530
tyraspvalhistrptyrglnglnleuproglythralaprolysleu
354045
leuiletyrglyasnserasnargproserglyvalproaspargphe
505560
serglyserlysserglythrseralaserleualailethrglyleu
65707580
glnalagluaspglualaasptyrtyrcysglnsertyraspsermet
859095
tyrargpheglypheglyglyglythrlysleuthrvalleu
100105110
<210>37
<211>111
<212>prt
<213>人工序列
<220>
<223>lx5140093轻链序列
<400>37
glnservalvalthrglnproproservalserglyalaproglygln
151015
argvalthrilesercysthrglyserserserasnileglyalagly
202530
tyraspvalhistrptyrglnglnleuproglythralaprolysleu
354045
leuiletyrglyasnserasnargproserglyvalproaspargphe
505560
serglyserlysserglythrseralaserleualailethrglyleu
65707580
glnalagluaspglualaasptyrtyrcysglnsertyraspserser
859095
hisargalatrpalapheglyglyglythrlysleuthrvalleu
100105110
<210>38
<211>5
<212>prt
<213>人工序列
<220>
<223>lox696cdr-1重链序列
<400>38
asptyralamethis
15
<210>39
<211>17
<212>prt
<213>人工序列
<220>
<223>lox696cdr-2重链序列
<400>39
glyilesertrpasnserglyserileglytyralaaspservallys
151015
gly
<210>40
<211>11
<212>prt
<213>人工序列
<220>
<223>lx6960073_g82bs_glcdr-3重链序列
<400>40
gluglysertrpasntyraspalaleuaspile
1510
<210>41
<211>120
<212>prt
<213>人工序列
<220>
<223>lx6960073_g82bs_gl重链序列
<400>41
gluvalglnleuvalgluserglyglyglyleuvalglnproglyarg
151015
serleuargleusercysalaalaserglyphethrseraspasptyr
202530
alamethistrpvalargglnalaproglylysglyleuglutrpval
354045
serglyilesertrpasnserglyserileglytyralaaspserval
505560
lysglyargphethrileserargaspasnalalysasnserleutyr
65707580
leuglnmetasnserleuargalagluaspthralavaltyrtyrcys
859095
alaarggluglysertrpasntyraspalaleuaspiletrpglygln
100105110
glythrmetvalthrvalserser
115120
<210>42
<211>17
<212>prt
<213>人工序列
<220>
<223>lx6960067_ngl1cdr-2重链序列
<400>42
glyvalserleuglngluleutyrthrglytyralaaspservallys
151015
gly
<210>43
<211>17
<212>prt
<213>人工序列
<220>
<223>lx6960086_ngl1cdr-2重链序列
<400>43
glyilesertrpasnserproaspargtyrmetaspaspservallys
151015
gly
<210>44
<211>11
<212>prt
<213>人工序列
<220>
<223>lox696cdr-3重链序列
<400>44
gluglyasntrpasntyraspalapheaspile
1510
<210>45
<211>11
<212>prt
<213>人工序列
<220>
<223>lx6960067_ngl1cdr-3重链序列
<400>45
gluglysertrpasntyraspalapheaspile
1510
<210>46
<211>11
<212>prt
<213>人工序列
<220>
<223>lx6960073_ngl1cdr-3重链序列
<400>46
gluglysertrpasntyraspalaleuaspile
1510
<210>47
<211>11
<212>prt
<213>人工序列
<220>
<223>lx6960101_ngl1cdr-3重链序列
<400>47
gluglyasntrpasntyraspalapheaspval
1510
<210>48
<211>120
<212>prt
<213>人工序列
<220>
<223>lx6960067_ngl1重链序列
<400>48
glnvalglnleuvalglnserglyglyglyleuvalglnproglyarg
151015
serleuargleusercysalaalaserglyphethrpheaspasptyr
202530
alamethistrpvalargglnalaproglylysglyleuglutrpval
354045
serglyvalserleuglngluleutyrthrglytyralaaspserval
505560
lysglyargphethrvalserglyaspasnalalysasnserleutyr
65707580
leuglnmetasnserleuargalagluaspthralavaltyrtyrcys
859095
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100105110
glythrthrvalthrvalserser
115120
<210>49
<211>120
<212>prt
<213>人工序列
<220>
<223>lx6960071_ngl1重链序列
<400>49
glnvalglnleuvalglnserglyglyglyleuvalglnproglyarg
151015
serleuargleusercysalaalaserglyphethrpheaspasptyr
202530
alamethistrpvalargglnalaproglylysglyleuglutrpval
354045
serglyilesertrpasnserglyserileglytyralaaspserval
505560
lysglyargphethrileserargaspasnalalysasnserleutyr
65707580
leuglnmetaspserleuargalagluaspthralavaltyrtyrcys
859095
alaarggluglyasntrpasntyraspalapheaspiletrpglyarg
100105110
glythrthrvalthrvalserser
115120
<210>50
<211>120
<212>prt
<213>人工序列
<220>
<223>lx6960073_ngl1重链序列
<400>50
glnvalglnleuvalglnserglyglyglyleuvalglnproglyarg
151015
serleuargleusercysalaalaserglyphethrseraspasptyr
202530
alamethistrpvalargglnalaproglylysglyleuglutrpval
354045
serglyilesertrpasnserglyserileglytyralaaspserval
505560
lysglyargphethrileserargaspasnalalysasnserleutyr
65707580
leuglnmetasnglyleuargalagluaspthralavaltyrtyrcys
859095
alaarggluglysertrpasntyraspalaleuaspiletrpglyarg
100105110
glythrthrvalthrvalserser
115120
<210>51
<211>120
<212>prt
<213>人工序列
<220>
<223>lx6960086_ngl1重链序列
<400>51
glnvalglnleuvalglnserglyglyglyleuvalglnproglyarg
151015
serleuargleusercysalaalaserglyphethrpheaspasptyr
202530
alamethistrpvalargglnalaproglylysglyleuglutrpval
354045
serglyilesertrpasnserproaspargtyrmetaspaspserval
505560
lysglyargphethrileserargaspasnalaglnasnserleutyr
65707580
leuglnmetaspserleuargalagluaspthralavaltyrtyrcys
859095
alaarggluglyasntrpasntyraspalapheaspiletrpglyarg
100105110
glythrthrvalthrvalserser
115120
<210>52
<211>120
<212>prt
<213>人工序列
<220>
<223>lx6960101_ngl1重链序列
<400>52
glnvalglnleuvalglnserglyglyglyleuvalglnproglyarg
151015
serleuargleusercysalaalaserglyphethrpheaspasptyr
202530
alamethistrpvalargglnalaproglylysglyleuglutrpval
354045
serglyilesertrpasnserglyserileglytyralaaspserval
505560
lysglyargphethrileserargaspasnalalysasnserleutyr
65707580
leuglnmetasnglyleuargalagluaspthralavaltyrtyrcys
859095
alaarggluglyasntrpasntyraspalapheaspvaltrpglyarg
100105110
glythrthrvalthrvalserser
115120
<210>53
<211>120
<212>prt
<213>人工序列
<220>
<223>lx6960073_gl重链序列
<400>53
gluvalglnleuvalgluserglyglyglyleuvalglnproglyarg
151015
serleuargleusercysalaalaserglyphethrseraspasptyr
202530
alamethistrpvalargglnalaproglylysglyleuglutrpval
354045
serglyilesertrpasnserglyserileglytyralaaspserval
505560
lysglyargphethrileserargaspasnalalysasnserleutyr
65707580
leuglnmetasnglyleuargalagluaspthralavaltyrtyrcys
859095
alaarggluglysertrpasntyraspalaleuaspiletrpglygln
100105110
glythrmetvalthrvalserser
115120
<210>54
<211>120
<212>prt
<213>人工序列
<220>
<223>lox696重链序列
<400>54
glnvalglnleuvalglnserglyglyglyleuvalglnproglyarg
151015
serleuargleusercysalaalaserglyphethrpheaspasptyr
202530
alamethistrpvalargglnalaproglylysglyleuglutrpval
354045
serglyilesertrpasnserglyserileglytyralaaspserval
505560
lysglyargphethrileserargaspasnalalysasnserleutyr
65707580
leuglnmetasnserleuargalagluaspthralavaltyrtyrcys
859095
alaarggluglyasntrpasntyraspalapheaspiletrpglyarg
100105110
glythrthrvalthrvalserser
115120
<210>55
<211>14
<212>prt
<213>人工序列
<220>
<223>lx6960073_g82bs_glcdr-1轻链序列
<400>55
thrglythrserseraspvalglyglytyrasntyrvalser
1510
<210>56
<211>7
<212>prt
<213>人工序列
<220>
<223>lx6960073_g82bs_glcdr-2轻链序列
<400>56
aspvalserlysargproser
15
<210>57
<211>11
<212>prt
<213>人工序列
<220>
<223>lx6960073_g82bs_glcdr-3轻链序列
<400>57
metglyglymetglyargserthrasntrpval
1510
<210>58
<211>111
<212>prt
<213>人工序列
<220>
<223>lx6960073_g82bs_gl轻链序列
<400>58
glnseralaleuthrglnproalaservalserglyserproglygln
151015
proilethrilesercysthrglythrserseraspvalglyglytyr
202530
asntyrvalsertrptyrglnglnhisproglylysalaprolysleu
354045
metiletyraspvalserlysargproserglyvalserasnargphe
505560
serglyserlysserglyasnthralaserleuthrileserglyleu
65707580
glnalagluaspglualaasptyrtyrcysmetglyglymetglyarg
859095
serthrasntrpvalpheglyglyglythrlysleuthrvalleu
100105110
<210>59
<211>14
<212>prt
<213>人工序列
<220>
<223>lx6960116_ngl1cdr-1轻链序列
<400>59
thrglythrserasnaspvalglyglytyrasntyrvalser
1510
<210>60
<211>7
<212>prt
<213>人工序列
<220>
<223>lox696cdr-2轻链序列
<400>60
aspvalserasnargproser
15
<210>61
<211>11
<212>prt
<213>人工序列
<220>
<223>lox696cdr-3轻链序列
<400>61
sersertyrthrserserserthrasntrpval
1510
<210>62
<211>11
<212>prt
<213>人工序列
<220>
<223>lx6960067_ngl1cdr-3轻链序列
<400>62
leuglyargthrtrpserserthrasntrpval
1510
<210>63
<211>11
<212>prt
<213>人工序列
<220>
<223>lx6960071_ngl1cdr-3轻链序列
<400>63
metglysermetglyargserthrasntrpval
1510
<210>64
<211>11
<212>prt
<213>人工序列
<220>
<223>lx6960094_ngl1cdr-3轻链序列
<400>64
alaglnargthrvalserserthrasntrpval
1510
<210>65
<211>111
<212>prt
<213>人工序列
<220>
<223>lx6960067_ngl1轻链序列
<400>65
glnseralaleuthrglnproalaservalserglyserproglygln
151015
serilethrilesercysthrglythrserseraspvalglyglytyr
202530
asntyrvalsertrptyrglnglnhisproglylysalaprolysleu
354045
metiletyraspvalserasnargproserglyvalserasnargphe
505560
serglyserlysserglyasnthralaserleuthrileserglyleu
65707580
glnalagluaspglualaasptyrtyrcysleuglyargthrtrpser
859095
serthrasntrpvalpheglyglyglythrlysleuthrvalleu
100105110
<210>66
<211>111
<212>prt
<213>人工序列
<220>
<223>lx6960071_ngl1轻链序列
<400>66
glnseralaleuthrglnproalaservalserglyserproglygln
151015
proilethrilesercysthrglythrserseraspvalglyglytyr
202530
asntyrvalsertrptyrglnglnhisproglylysalaprolysleu
354045
metiletyraspvalserasnargproserglyvalserasnargphe
505560
serglyserlysserglyasnthralaserleuthrileserglyleu
65707580
glnalagluaspglualaasptyrtyrcysmetglysermetglyarg
859095
serthrasntrpvalpheglyglyglythrlysleuthrvalleu
100105110
<210>67
<211>111
<212>prt
<213>人工序列
<220>
<223>lx6960073_ngl1轻链序列
<400>67
glnseralaleuthrglnproalaservalserglyserproglygln
151015
proilethrilesercysthrglythrserseraspvalglyglytyr
202530
asntyrvalsertrptyrglnglnhisproglylysalaprolysleu
354045
metiletyraspvalserlysargproserglyvalserasnargphe
505560
serglyserlysserglyasnthralaserleuthrileserglyleu
65707580
glnalagluaspglualaasptyrtyrcysmetglyglymetglyarg
859095
serthrasntrpvalpheglyglyglythrlysleuthrvalleu
100105110
<210>68
<211>111
<212>prt
<213>人工序列
<220>
<223>lx6960094_ngl1轻链序列
<400>68
glnseralaleuthrglnproalaservalserglyserproglygln
151015
serilethrilesercysthrglythrserseraspvalglyglytyr
202530
asntyrvalsertrptyrglnglnhisproglylysalaprolysleu
354045
metiletyraspvalserasnargproserglyvalserasnargphe
505560
serglyserlysserglyasnthralaserleuthrileserglyleu
65707580
glnalagluaspglualaasptyrtyrcysalaglnargthrvalser
859095
serthrasntrpvalpheglyglyglythrlysleuthrvalleu
100105110
<210>69
<211>111
<212>prt
<213>人工序列
<220>
<223>lx6960116_ngl1轻链序列
<400>69
glnseralaleuthrglnproalaservalserglyserproglygln
151015
serilethrilesercysthrglythrserasnaspvalglyglytyr
202530
asntyrvalsertrptyrglnglnhisproglylysalaprolysleu
354045
metiletyraspvalserasnargproserglyvalserasnargphe
505560
serglyserlysserglyasnthralaserleuthrileserglyleu
65707580
glnalagluaspglualaasptyrtyrcysmetglysermetglyarg
859095
serthrasntrpvalpheglyglyglythrlysleuthrvalleu
100105110
<210>70
<211>111
<212>prt
<213>人工序列
<220>
<223>lox696轻链序列
<400>70
glnseralaleuthrglnproalaservalserglyserproglygln
151015
serilethrilesercysthrglythrserseraspvalglyglytyr
202530
asntyrvalsertrptyrglnglnhisproglylysalaprolysleu
354045
metiletyraspvalserasnargproserglyvalserasnargphe
505560
serglyserlysserglyasnthralaserleuthrileserglyleu
65707580
glnalagluaspglualaasptyrtyrcyssersertyrthrserser
859095
serthrasntrpvalpheglyglyglythrlysleuthrvalleu
100105110
<210>71
<211>17
<212>prt
<213>人工序列
<220>
<223>lox514vhcdr2
<220>
<221>尚未归类的特征
<222>(7)..(7)
<223>xaa是gly、trp、tyr或phe
<220>
<221>尚未归类的特征
<222>(8)..(8)
<223>xaa是glu、thr、gln、ser、lys或ala
<220>
<221>尚未归类的特征
<222>(9)..(9)
<223>xaa是thr、tyr、ile或asn
<220>
<221>尚未归类的特征
<222>(10)..(10)
<223>xaa是ile、ala、arg或his
<220>
<221>尚未归类的特征
<222>(11)..(11)
<223>xaa是tyr、val、thr、leu或gln
<220>
<221>尚未归类的特征
<222>(12)..(12)
<223>xaa是ala、asp、gly、ser或his
<400>71
glypheaspprogluaspxaaxaaxaaxaaxaaxaaglnlysphegln
151015
gly
<210>72
<211>20
<212>prt
<213>人工序列
<220>
<223>lox514vhcdr3
<220>
<221>尚未归类的特征
<222>(1)..(1)
<223>xaa是pro、ser或val
<220>
<221>尚未归类的特征
<222>(2)..(2)
<223>xaa是asn、thr、trp或asp
<220>
<221>尚未归类的特征
<222>(4)..(4)
<223>xaa是gln、arg或thr
<220>
<221>尚未归类的特征
<222>(5)..(5)
<223>xaa是gln或his
<220>
<221>尚未归类的特征
<222>(6)..(6)
<223>xaa是gly或gln
<220>
<221>尚未归类的特征
<222>(7)..(7)
<223>xaa是lys或gly
<400>72
xaaxaaglyxaaxaaxaaxaaglyvalargglytrpasptyrtyrtyr
151015
glymetaspval
20
<210>73
<211>11
<212>prt
<213>人工序列
<220>
<223>lox514vlcdr3
<220>
<221>尚未归类的特征
<222>(6)..(6)
<223>xaa是ser或met
<220>
<221>尚未归类的特征
<222>(7)..(7)
<223>xaa是leu、tyr或his
<220>
<221>尚未归类的特征
<222>(8)..(8)
<223>xaa是ser或arg
<220>
<221>尚未归类的特征
<222>(9)..(9)
<223>xaa是gly、ala或无氨基酸
<220>
<221>尚未归类的特征
<222>(10)..(10)
<223>xaa是trp或phe
<220>
<221>尚未归类的特征
<222>(11)..(11)
<223>xaa是val、gly或ala
<400>73
glnsertyraspserxaaxaaxaaxaaxaaxaa
1510
<210>74
<211>17
<212>prt
<213>人工序列
<220>
<223>lox696vhcdr2
<220>
<221>尚未归类的特征
<222>(2)..(2)
<223>xaa是ile或val
<220>
<221>尚未归类的特征
<222>(4)..(4)
<223>xaa是trp或leu
<220>
<221>尚未归类的特征
<222>(5)..(5)
<223>xaa是asn或gln
<220>
<221>尚未归类的特征
<222>(6)..(6)
<223>xaa是ser或glu
<220>
<221>尚未归类的特征
<222>(7)..(7)
<223>xaa是gly、leu或pro
<220>
<221>尚未归类的特征
<222>(8)..(8)
<223>xaa是ser、tyr或asp
<220>
<221>尚未归类的特征
<222>(9)..(9)
<223>xaa是ile、thr或arg
<220>
<221>尚未归类的特征
<222>(10)..(10)
<223>xaa是gly或tyr
<220>
<221>尚未归类的特征
<222>(11)..(11)
<223>xaa是tyr或met
<220>
<221>尚未归类的特征
<222>(12)..(12)
<223>xaa是ala或asp
<400>74
glyxaaserxaaxaaxaaxaaxaaxaaxaaxaaxaaaspservallys
151015
gly
<210>75
<211>11
<212>prt
<213>人工序列
<220>
<223>lox696vhcdr3
<220>
<221>尚未归类的特征
<222>(3)..(3)
<223>xaa是asn或ser
<220>
<221>尚未归类的特征
<222>(9)..(9)
<223>xaa是phe或leu
<220>
<221>尚未归类的特征
<222>(11)..(11)
<223>xaa是ile或val
<400>75
gluglyxaatrpasntyraspalaxaaaspxaa
1510
<210>76
<211>14
<212>prt
<213>人工序列
<220>
<223>lox696vlcdr1
<220>
<221>尚未归类的特征
<222>(5)..(5)
<223>xaa是ser或asn
<400>76
thrglythrserxaaaspvalglyglytyrasntyrvalser
1510
<210>77
<211>7
<212>prt
<213>人工序列
<220>
<223>lox696vlcdr2
<220>
<221>尚未归类的特征
<222>(4)..(4)
<223>xaa是asn或lys
<400>77
aspvalserxaaargproser
15
<210>78
<211>11
<212>prt
<213>人工序列
<220>
<223>lox696vlcdr3
<220>
<221>尚未归类的特征
<222>(1)..(1)
<223>xaa是ser、leu、met或ala
<220>
<221>尚未归类的特征
<222>(2)..(2)
<223>xaa是ser、gly或gln
<220>
<221>尚未归类的特征
<222>(3)..(3)
<223>xaa是tyr、arg、ser或gly
<220>
<221>尚未归类的特征
<222>(4)..(4)
<223>xaa是thr或met
<220>
<221>尚未归类的特征
<222>(5)..(5)
<223>xaa是ser、trp、gly或val
<220>
<221>尚未归类的特征
<222>(6)..(6)
<223>xaa是ser或arg
<400>78
xaaxaaxaaxaaxaaxaaserthrasntrpval
1510