发明领域
本公开涉及在重组宿主中重组产生甜菊醇糖苷和甜菊醇糖苷前体。具体地，本公开涉及在重组宿主中产生包括以下的甜菊醇糖苷：甜菊醇-13-o-葡糖苷(13-smg)、甜菊醇-19-o-葡糖苷(19-smg)、甜菊醇-1，2-二糖苷、甜菊醇-1，3-二糖苷、1，2-甜菊苷、1，3-甜菊苷、甜茶苷(rubu)、莱鲍迪苷a(reba)、莱鲍迪苷b(rebb)、莱鲍迪苷c(rebc)、莱鲍迪苷d(rebd)、莱鲍迪苷e(rebe)、莱鲍迪苷f(rebf)、莱鲍迪苷m(rebm)、莱鲍迪苷q(rebq)、莱鲍迪苷i(rebi)、杜克苷a、三葡糖基化甜菊醇糖苷、四葡糖基化甜菊醇糖苷、五葡糖基化甜菊醇糖苷、六葡糖基化甜菊醇糖苷、七葡糖基化甜菊醇糖苷或其异构体。
相关技术的描述
甜味剂作为食品、饮料或糖果工业中最常用的成分是众所周知的。可将甜味剂在产生过程中掺入最终的食品中，也可以在适当稀释下作为佐餐甜味剂或作为烘焙中糖的家用替代品单独使用。甜味剂包括天然甜味剂诸如蔗糖、高果糖玉米糖浆、糖蜜、枫糖浆和蜂蜜以及人工甜味剂诸如阿斯巴甜、糖精和三氯蔗糖。甜叶菊提取物是可从多年生灌木甜叶菊(steviarebaudiana)中分离和提取的天然甜味剂。甜叶菊在南美洲和亚洲被普遍种植用于商业产生甜叶菊提取物。经过不同程度的纯化的甜叶菊提取物在商业上用作食品和共混合物中的高强度甜味剂，或单独用作佐餐甜味剂。
图2中显示了几种甜菊醇糖苷的化学结构，包括二萜甜菊醇和多种甜菊醇糖苷。甜叶菊植物的提取物通常包含有助于甜味的甜菊醇糖苷，尽管每种甜菊醇糖苷的量，除其它以外，在不同的产生批次间通常是变化的。
由于从甜叶菊植物中回收和纯化甜菊醇糖苷已被证明是劳动密集型的和低效的，因此存在对能够以高产率积累所需甜菊醇糖苷(诸如rebd和rebm)的重组产生系统的需要。还需要改善用于商业用途的重组宿主中甜菊醇糖苷的产生。同样，存在对鉴定对特定底物具有选择性的酶以产生一种或多种特定甜菊醇糖苷的需要。在一些方面，存在提高具有19-o糖基化活性的酶的催化能力以产生更高产量的甜菊醇糖苷的需要。
发明概述
针对上述背景，本发明提供了优于现有技术的某些有利方面和进步。
尽管本文公开的本发明不限于特定的有利方面或功能性，但本发明提供了包含编码多肽的重组基因的重组宿主细胞，所述多肽能够使甜菊醇或甜菊醇糖苷在其c-19羧基处糖基化，并与seqidno：2或119所示的氨基酸序列具有至少50％序列同一性，其中所述重组宿主细胞能够产生甜菊醇糖苷或甜菊醇糖苷组合物。
在一些方面，重组宿主细胞还包含：
(a)编码能够从法呢基二磷酸(fpp)和异戊烯基二磷酸(ipp)合成牻牛儿基牻牛儿基焦磷酸(ggpp)的多肽的基因；
(b)编码能够从ggpp合成内根-柯巴基二磷酸(ent-copalyldiphosphate)的多肽的基因；
(c)编码能够从内根-柯巴基焦磷酸合成内根-贝壳杉稀酸的多肽的基因；
(d)编码能够从内根-贝壳杉稀合成内根-贝壳杉烯酸的多肽的基因；
(e)编码能够还原细胞色素p450复合物的多肽的基因；和
(f)编码能够从内根-贝壳杉烯酸合成甜菊醇的多肽的基因；
(g)编码能够使甜菊醇或甜菊醇糖苷在其c-13羟基处糖基化的多肽的基因；
(h)编码能够使甜菊醇糖苷的13-o-葡萄糖、19-o-葡萄糖或13-o-葡萄糖和19-o-葡萄糖两者的c3′进行β1，3糖基化的多肽的基因；
(i)编码能够使甜菊醇或甜菊醇糖苷糖在其c-19羧基处糖基化的多肽的基因；
(j)编码能够使甜菊醇糖苷的13-o-葡萄糖、19-o-葡萄糖或13-o-葡萄糖和19-o-葡萄糖的的c2′进行β1，2糖基化的多肽的基因；和/或
(k)编码能够从ggpp合成内根-柯巴基二磷酸并且从内根-柯巴基焦磷酸合成内根-贝壳杉烯的双功能多肽的基因；
其中所述基因中的至少一个是重组基因。
在本文公开的重组宿主细胞的一些方面中：
(a)能够合成ggpp的多肽包括与seqidno：20、seqidno：22、seqidno：24、seqidno：26、seqidno：28、seqidno：30、seqidno：32或seqidno：116所示的氨基酸序列具有至少70％同一性的多肽；
(b)能够合成内根-柯巴基二磷酸的多肽包括与seqidno：34、seqidno：36、seqidno：38、seqidno：40或seqidno：42所示的氨基酸序列具有至少70％同一性的多肽；
(c)能够合成内根-贝壳杉烯的多肽包括与seqidno：44、seqidno：46、seqidno：48、seqidno：50或seqidno：52所示的氨基酸序列具有至少70％同一性的多肽；
(d)能够合成内根-贝壳杉烯酸的多肽包括与seqidno：60、seqidno：62、seqidno：66、seqidno：68、seqidno：70、seqidno：72、seqidno：74、seqidno：76或seqidno：117所示的氨基酸序列具有至少70％同一性的多肽；
(e)能够还原细胞色素p450复合物的多肽包括与seqidno：78、seqidno：80、seqidno：82、seqidno：84、seqidno：86、seqidno：88、seqidno：90、seqidno：92所示的氨基酸序列具有至少70％同一性的多肽；
(f)能够合成甜菊醇的多肽包括与seqidno：94、seqidno：97、seqidno：100、seqidno：101、seqidno：102、seqidno：103、seqidno：104、seqidno：106、seqidno：108、seqidno：110、seqidno：112或seqidno：114所示的氨基酸序列具有至少70％同一性的多肽；
(g)能够使甜菊醇或甜菊醇糖苷在其c-13羟基处糖基化的多肽包括与seqidno：7所示的氨基酸序列具有至少55％同一性的多肽；(h)能够使甜菊醇糖苷的13-o-葡萄糖、19-o-葡萄糖或13-o-葡萄糖和19-o-葡萄糖两者的c3′进行β1，3糖基化的多肽包括与seqidno：9所示的氨基酸序列具有至少50％同一性的多肽；
(i)能够使甜菊醇或甜菊醇糖苷在其c-19羧基处糖基化的多肽包括与seqidno：4所示的氨基酸序列具有至少55％同一性的多肽；
(j)能够使甜菊醇糖苷的13-o-葡萄糖、19-o-葡萄糖或13-o-葡萄糖和19-o-葡萄糖两者的c2′进行β1，2糖基化的多肽包括与seqidno：11所示的氨基酸序列具有80％或更高的同一性的多肽；与seqidno：13所示的氨基酸序列具有80％或更高同一性的多肽；或与seqidno：16所示的氨基酸序列具有至少65％同一性的多肽；和
(k)能够从ggpp合成内根-柯巴基二磷酸并且从内根-柯巴基焦磷酸合成内根-贝壳杉烯的双功能多肽包括与seqidno：54、seqidno：56或seqidno：58所示的氨基酸序列具有至少50％同一性的多肽。
在一些方面，本文公开的重组宿主细胞包括植物细胞、哺乳动物细胞、昆虫细胞、真菌细胞、藻类细胞、古细菌(archeal)细胞或细菌细胞。
在一些方面，细菌细胞包括埃希氏菌属(escherichia)细菌细胞、乳杆菌属(lactobacillus)细胞、乳球菌属(lactococcus)、棒杆菌属(cornebacterium)细胞、醋杆菌属(acetobacter)细胞、不动杆菌属(acinetobacter)细胞或假单胞菌属(pseudomonas)细胞。
在一些方面，真菌细胞包括酵母细胞。
在一些方面，酵母细胞是来自酿酒酵母(saccharomycescerevisiae)，粟酒裂殖酵母(schizosaccharomycespombe)、解脂耶氏酵母(yarrowialipolytica)、光滑念珠菌(candidaglabrata)、棉阿舒囊霉(ashbyagossypii)、产朊假丝酵母(cyberlindnerajadinii)、巴斯德毕赤酵母(pichiapastoris)、乳酸克鲁维酵母(kluyveromyceslactis)、多形汉逊酵母(hansenulapolymorpha)、博伊丁假丝酵母(candidaboidinii)、解腺嘌呤阿氏酵母(arxulaadeninivorans)、红发夫酵母(xanthophyllomycesdendrorhous)或白色念珠菌(candidaalbicans)种的细胞。
在一些方面，酵母细胞是酵母菌。
在一些方面，酵母细胞是来自酿酒酵母种的细胞。
本发明还提供了产生甜菊醇糖苷或甜菊醇糖苷组合物的方法，其包括在其中表达基因的条件下使本文公开的重组宿主细胞在细胞培养基中生长，其中所述甜菊醇糖苷或甜菊醇糖苷组合物由所述重组宿主细胞产生。
本发明还提供了用于产生甜菊醇糖苷或甜菊醇糖苷组合物的方法，其包括使用重组多肽，在细胞培养基中进行源自植物的或合成的甜菊醇和/或甜菊醇糖苷的全细胞生物转化，并由此合成甜菊醇糖苷，所述重组多肽由本文公开的重组宿主细胞产生，能够使甜菊醇或甜菊醇糖苷在其c-19羧基处糖基化并与seqidno：2或119所示的氨基酸序列具有至少50％序列同一性。
在一些方面，本文公开的方法还包括分离甜菊醇糖苷或甜菊醇糖苷组合物。
在本文公开的方法的一些方面中，分离步骤包括：
(a)提供包含甜菊醇糖苷或甜菊醇糖苷组合物的细胞培养基；
(b)将细胞培养基的液相与细胞培养物的固相分离以获得包含甜菊醇糖苷或甜菊醇糖苷组合物的上清液；
(c)提供一种或多种吸附树脂，包括在填充柱中提供吸附树脂；以及
(d)使步骤(b)的上清液与一种或多种吸附树脂接触以获得至少一部分甜菊醇糖苷或甜菊醇糖苷组合物，由此分离甜菊醇糖苷或甜菊醇糖苷组合物。
在本文公开的方法的一些方面，分离步骤包括：
(a)提供包含甜菊醇糖苷或甜菊醇糖苷组合物的细胞培养物；
(b)将细胞培养物的液相与细胞培养物的固相分离以获得包含甜菊醇糖苷或甜菊醇糖苷组合物的上清液；
(c)提供一个或多个离子交换或离子交换或反相色谱柱；以及
(d)使步骤(b)的上清液与一个或多个离子交换或离子交换或反相色谱柱接触，以获得至少一部分甜菊醇糖苷或甜菊醇糖苷组合物。
在本文公开的方法的一些方面中，分离步骤包括：
(a)提供包含甜菊醇糖苷或甜菊醇糖苷组合物的细胞培养物；
(b)将细胞培养物的液相与细胞培养物的固相分离以获得包含甜菊醇糖苷或甜菊醇糖苷组合物的上清液；
(c)使甜菊醇糖苷结晶或对其进行提取，从而分离甜菊醇糖苷或甜菊醇糖苷组合物。
在一些方面，本文公开的方法还包括单独回收甜菊醇糖苷或以包含甜菊醇糖苷的组合物形式回收甜菊醇糖苷。
在本文公开的方法的一些方面，回收的组合物相对于来自甜叶菊植物的糖苷组合物富集甜菊醇糖苷，并且相对于源自植物的甜叶菊提取物具有降低的水平的源自甜叶菊植物的组分。
在本文公开的方法的一些方面，回收的组合物相对于源自植物的甜叶菊提取物具有降低的水平的源自甜叶菊植物的组分。
在本文公开的方法的一些方面，细胞培养基包含：
(a)通过本文公开的重组宿主细胞或源自植物的或合成的甜菊醇和/或甜菊醇糖苷的全细胞生物转化产生的甜菊醇糖苷或甜菊醇糖苷组合物，
(b)葡萄糖、果糖和/或蔗糖；和/或
(c)包含痕量金属、维生素、盐、酵母氮源基础培养基(ynb)和/或氨基酸的补充营养物。
在本文公开的方法的一些方面，在透化的重组宿主细胞中产生甜菊醇糖苷，所述重组宿主细胞已经用编码能够使甜菊醇或甜菊醇糖苷在其c-19羧基处糖基化的多肽的基因转化。
在本文公开的方法的一些方面，重组宿主包括植物细胞、哺乳动物细胞、昆虫细胞、真菌细胞、藻类细胞或细菌细胞。
在本文公开的方法的一些方面，细菌细胞包括埃希氏菌属细菌细胞、乳杆菌属细胞、乳球菌属细胞、棒杆菌属细胞、醋杆菌属细胞、不动杆菌属细胞或假单胞菌属细胞。
在此公开的方法的一些方面，真菌细胞包括酵母细胞。
在本文公开的方法的一些方面，酵母细胞是来自酿酒酵母、粟酒裂殖酵母、解脂耶氏酵母、光滑念珠菌、棉阿舒囊霉、产朊假丝酵母、巴斯德毕赤酵母、乳酸克鲁维酵母、多形汉逊酵母、博伊丁假丝酵母、解腺嘌呤阿氏酵母、红发夫酵母或白色念珠菌种的细胞。
在此公开的方法的一些方面，酵母细胞是酵母菌。
在此公开的方法的一些方面，酵母细胞是来自酿酒酵母种的细胞。
本发明还提供了用于产生甜菊醇-19-o-葡糖苷(19-smg)的体外方法，其包括向反应混合物中添加能够使甜菊醇或甜菊醇糖苷在其c-19羧基处糖基化并与seqidno：2或119所示的氨基酸序列具有至少50％序列同一性的重组多肽和源自植物的或合成的甜菊醇；以及由此合成19-smg。
在本文公开的方法的一些方面中，反应混合物包含：
(a)一种或多种19-smg；
(b)重组多肽；
(c)葡萄糖、果糖和/或蔗糖、尿苷二磷酸(udp)-葡萄糖、udp-鼠李糖、udp-木糖和/或n-乙酰基葡糖胺；和/或
(d)反应缓冲液和/或盐。
在本文公开的方法的一些方面，甜菊醇糖苷包括甜菊醇-13-o-葡糖苷(13-smg)、甜菊醇-1，2-二糖苷、甜菊醇-1，3-二糖苷、甜菊醇-19-o-葡糖苷(19-smg)、甜菊苷、1，3-甜菊苷、甜茶苷、莱鲍迪苷a(reba)、莱鲍迪苷b(rebb)、莱鲍迪苷c(rebc)、莱鲍迪苷d(rebd)、莱鲍迪苷e(rebe)、莱鲍迪苷f(rebf)、莱鲍迪苷m(rebm)、莱鲍迪苷q(rebq)、莱鲍迪苷i(rebi)、杜克苷a或其异构体。
本发明还提供了细胞培养基，其包含：
(a)本文公开的重组宿主细胞；和
(b)由本文公开的重组宿主细胞产生的一种或多种甜菊醇糖苷；
其中一种或多种甜菊醇糖苷以至少0.1mg/升细胞培养基的浓度存在。
本发明还提供了细胞培养基，其包含：
(a)本文公开的重组宿主细胞；和
(b)由本文公开的重组宿主细胞产生的一种或多种甜菊醇糖苷；
其中一种或多种甜菊醇糖苷以至少0.1mg/升细胞培养基的浓度存在，并且所述细胞培养基还包含葡萄糖、蔗糖、udp-葡萄糖、udp-鼠李糖、udp-木糖、n-乙酰基-葡糖胺和/或ynb。
本发明还提供了细胞培养基，其包含：
(a)本文公开的重组宿主细胞；和
(b)由本文公开的重组宿主细胞产生的一种或多种甜菊醇糖苷；
其中一种或多种甜菊醇糖苷以至少0.1mg/升培养基的浓度存在，并且细胞培养基还包含葡萄糖、蔗糖、udp-葡萄糖、udp-鼠李糖、udp-木糖、n-乙酰基-葡糖胺，和/或ynb；以及
其中所述细胞培养基相对于源自植物的甜叶菊提取物具有降低的水平的源自甜叶菊植物的组分。
本发明还提供了细胞培养基，其包含：
(a)本文公开的重组宿主细胞；和
(b)由本文公开的重组宿主细胞产生的一种或多种甜菊醇糖苷；
其中一种或多种甜菊醇糖苷以至少0.1mg/升细胞培养基的浓度存在，并且所述细胞培养基还包含葡萄糖、蔗糖、udp-葡萄糖、udp-鼠李糖、udp-木糖、n-乙酰基-葡糖胺和/或ynb；以及
其中所述细胞培养基相对于来自甜叶菊植物的甜菊醇糖苷提取物富集19-smg，并且相对于源自植物的甜叶菊提取物具有降低的水平的源自甜叶菊植物的组分。
本发明还提供了一种细胞裂解物，其包含由本文公开的重组宿主细胞产生的一种或多种甜菊醇糖苷，并且细胞裂解物还包含葡萄糖、蔗糖、udp-葡萄糖、udp-鼠李糖、udp-木糖、n-乙酰基葡糖胺和/或ynb。
本发明还提供了由本文公开的重组宿主细胞产生的甜菊醇糖苷。
本发明还提供了通过本文公开的方法产生的甜菊醇糖苷。
本发明还提供了甜味剂组合物，其包含由本文公开的重组宿主细胞或方法产生的甜菊醇糖苷。
本发明还提供了包含本文公开的甜味剂组合物的食品。
本发明还提供包含本文公开的甜味剂组合物的饮料或饮料浓缩物。
本发明还提供了由本文公开的重组宿主产生的甜菊醇糖苷的组合物，其中组合物中甜菊醇糖苷的相对水平对应于重组宿主中甜菊醇糖苷的相对水平。
在一些方面，所述组合物相对于由缺乏编码多肽的基因的相应重组宿主细胞产生的甜菊醇糖苷组合物还包含升高的水平的19-smg，所述多肽能够使甜菊醇或甜菊醇糖苷在其c-19羧基处糖基化并与seqidno：2或119所示的氨基酸序列具有至少50％序列同一性。
根据以下结合所附权利要求的详细描述，将更充分地理解本发明的这些和其它特征和有利方面。应当注意，权利要求的范围由其中的陈述来定义，而不是由本说明书中所阐述的特征和有利方面的具体论述来定义。
附图简述
当结合以下附图阅读时，可以最好地理解本发明的实施方案的以下详细描述，其中类似的结构用同样的参考数码标示，并且其中：
图1显示使用能够从法尼基二磷酸(fpp)和异戊烯基二磷酸(ipp)合成牻牛儿基牻牛儿基焦磷酸(ggpp)的多肽(例如，牻牛儿基牻牛儿基二磷酸合酶(ggpps))、能够从ggpp合成内根-柯巴基二磷酸的多肽(例如，内根-柯巴基二磷酸合酶(cdps))、能够从内根-柯巴基焦磷酸合成内根-贝壳杉稀的多肽(例如，贝壳杉烯合酶(ks))、能够从内根-贝壳杉稀合成内根-贝壳杉烯酸的多肽(例如，贝壳杉烯氧化酶(ko))、能够还原细胞色素p450复合物的多肽(例如，细胞色素p450还原酶(cpr))(未显示)和能够从内根-贝壳杉烯酸合成甜菊醇的多肽(例如，甜菊醇合酶(kah))在酵母中从牻牛儿基牻牛儿基二磷酸产生甜菊醇的经工程改造的生物合成途径的示意图。
图2显示由适合的尿苷5′-二磷酸(udp)糖基转移酶(ugt)催化的代表性甜菊醇糖苷糖基化反应和几种甜菊醇糖苷化合物的化学结构。
图3显示由供给甜菊醇的表达ugt33942(seqidno：1，seqidno：2)的酿酒酵母菌株产生的19-smg累积(以曲线下面积表示；auc)。
图4显示来自供给甜菊醇的酿酒酵母对照菌株(顶部)和供给甜菊醇的表达ugt33786(seqidno：118，seqidno：119)的酿酒酵母菌株(底部)的样品的对应于19-smg的质量的液相色谱-质谱(lc-ms)的选定的离子记录(sir)描迹线。
发明详述
在详细描述本发明之前，将定义多个术语。如本文中所用，除非上下文另有明确规定，否则单数形式“一个/种(a)”、“一个/种(an)”和“该(the)”包括复数指代物。例如，提及“核酸”是指一个/种或多个/种核酸。
应注意，术语如“优选地”、“一般地”和“通常”在本文中不用于限制要求保护的发明的范围，或暗示某些特性对于要求保护的发明的结构或功能是至关重要的、必要的或者甚至是重要的。相反，这些术语仅旨在突出可被用在或不被用在本发明的特定实施方案中的替代或额外特征。
为了描述和限定本发明的目的，应注意，术语“基本上”在本文中用于表示可归因于任何定量比较、值、测量或其它表示的固有不确定性程度。术语“基本上”在本文中也用于表示在不导致所讨论主题的基本功能变化的情况下，定量表达可与所述参考不同的程度。
可使用本领域技术人员熟知的方法来构建根据本发明的基因表达构建体和重组细胞。这些方法包括体外重组dna技术、合成技术、体内重组技术和聚合酶链式反应(pcr)技术。参见，例如，green和sambrook，2012，molecularcloning：alaboratorymanual，第4版，coldspringharborlaboratory，newyork；ausubel等，1989，currentprotocolsinmolecularbiology，greenepublishingassociatesandwileyinterscience，newyork，和pcrprotocols：aguidetomethodsandapplications(innis等，1990，academicpress，sandiego，ca)中所描述的技术。
如本文中所用，术语“多核苷酸”、“核苷酸”、“寡核苷酸”和“核酸”可互换使用，是指在单链或双链实施方案中(取决于技术人员所理解的上下文)包括dna、rna、其衍生物或其组合的核酸。
如本文中所用，术语“微生物”、“微生物宿主”、“微生物宿主细胞”、“宿主”和“宿主细胞”可以互换使用。如本文中所用，术语“重组宿主”或“重组微生物”旨在表示这样的宿主，其基因组已增强了至少一个dna序列。此类dna序列包括但不限于非天然存在的基因、通常不被转录成rna或翻译成蛋白质(“表达的”)的dna序列、以及期望引入至宿主中的其它基因或dna序列。应该理解，通常通过稳定地引入一种或多种重组基因来增强本文所述的重组宿主的基因组。一般而言，引入的dna最初不是作为dna受体的宿主中所固有的，而是在本公开的范围内从给定的宿主分离dna片段并随后将该dna的一个或多个另外的拷贝引入同一宿主中，例如，以增加基因产物的产量或改变基因的表达模式。在一些情况下，所述引入的dna将通过例如同源重组或定点诱变来修饰或甚至替代内源基因或dna序列。合适的重组宿主包括微生物。
如本文中所用，术语“重组基因”是指被引入受体宿主的基因或dna序列，而不论相同或相似的基因或dna序列是否可能已经存在于此类宿主中。本说明书中的“引入”或“增强”在本领域中已知意指通过人工来引入或增强。因此，重组基因可以是来自另一物种的dna序列，或者可以是源自或存在于同一物种中但已通过重组方法整合至宿主中以形成重组宿主的dna序列。应当理解，被引入宿主中的重组基因可与通常存在于被转化的宿主中的dna序列相同，并被引入以提供所述dna的一个或多个额外拷贝，从而允许该dna的基因产物的过表达或经修饰的表达。在一些方面，所述重组基因由cdna编码。在其它实施方案中，重组基因是合成的和/或经密码子优化的，以用于在酿酒酵母中表达。
如本文中所用，术语“经工程改造的生物合成途径”是指如本文所述的在重组宿主中发生的生物合成途径。在一些方面，生物合成途径的一个或多个步骤并非天然地存在于未修饰的宿主中。在一些实施方案中，将基因的异源形式引入包含内源形式的基因的宿主。
如本文中所用，术语“内源”基因是指源自特定生物体、组织或细胞并在其内产生或合成的基因。在一些实施方案中，内源基因是酵母基因。在一些实施方案中，该基因对于酿酒酵母(包括但不限于酿酒酵母菌株s288c)是内源的。在一些实施方案中，内源酵母基因过表达。如本文中所用，术语“过表达”用于指基因在生物体中以高于在野生型生物体中基因表达水平的水平进行的表达。参见例如prelich，2012，genetics190：841-54。在一些实施方案中，使内源酵母基因缺失。参见例如giaever及nislow，2014，genetics197(2)：451-65。如本文中所用，术语“缺失(deletion)”、“缺失(deleted)”、“敲除(knockout)”和“敲除(knockedout)”可互换使用，指已被操作变得不再在生物体(包括但不限于酿酒酵母)中表达的内源基因。
如本文中所用，术语“异源序列”和“异源编码序列”用于描述源自除重组宿主外的物种的序列。在一些实施方案中，重组宿主是酿酒酵母细胞，并且异源序列来源于除酿酒酵母外的生物。例如，异源编码序列可来自与表达该异源序列的重组宿主不同的原核微生物、真核微生物、植物、动物、昆虫或真菌。在一些实施方案中，编码序列是对于宿主是天然的序列。
“可选择标记”可以是补充宿主细胞营养缺陷，提供抗生素抗性或导致颜色变化的众多基因之一。然后使用本领域公知的方法(参见下文)将基因置换载体的线性化dna片段引入细胞。线性片段至基因组中的整合以及基因的破坏可基于可选择标记来确定并且可通过例如pcr或southern印迹分析来验证。在将其用于选择之后，可以通过例如cre-loxp系统从宿主细胞的基因组中去除可选择标记(参见例如gossen等，2002，ann.rev.genetics36：153-173和u.s.2006/0014264)。或者，可以以包括待破坏基因的一部分的方式构建基因置换载体，其中该部分缺乏任何内源基因启动子序列，并且不编码所述基因的编码序列，或编码基因的编码序列的无活性片段。
如本文中所用，术语“变体”和“突变体”用于描述与特定蛋白质的野生型序列相比在一个或多个氨基酸处已被修饰的蛋白质序列。
如本文中所用，术语“无活性片段”是编码活性小于例如从基因的全长编码序列所产生的蛋白质的约10％(例如，小于约9％，小于约8％，小于约7％，小于约6％，小于约5％，小于约4％，小于约3％，小于约2％，小于约1％或0％)的蛋白质的基因片段。这样的基因部分以这样的方式插入至载体中，使得没有已知的启动子序列可操作地连接至基因序列，但终止密码子和转录终止序列可操作地连接至基因序列的部分。随后可将该载体在基因序列的所述部分中线性化并转化至细胞中。通过单一同源重组，然后将该线性化载体整合到基因的内源对应物中，使其失活。
如本文中所用，术语“甜菊醇糖苷”是指莱鲍迪苷a(reba)(cas#58543-16-1)、莱鲍迪苷b(rebb)(cas#58543-17-2)、莱鲍迪苷c(rebc)(cas#63550-99-2)、莱鲍迪苷d(rebd)(cas#63279-13-0)、莱鲍迪苷e(rebe)(cas#63279-14-1)、莱鲍迪苷f(rebf)(cas#438045-89-7)、莱鲍迪苷m(rebm)(cas#1220616-44-3)、甜茶苷(cas#63849-39-4)、杜克苷a(cas#64432-06-0)、莱鲍迪苷i(rebi)(massbank记录：fu000332)、莱鲍迪苷q(rebq)、1，2-甜菊苷(cas#57817-89-7)、1，3-甜菊苷(rebg)、1，2-二糖苷(massbank记录：fu000299)、1，3-二糖苷、甜菊醇-13-o-葡糖苷(13-smg)、甜菊醇-19-o-葡糖苷(19-smg)、三-葡糖基化甜菊醇糖苷、四葡糖基化甜菊醇糖苷、五葡糖基化甜菊醇糖苷、六葡糖基化甜菊醇糖苷、七葡糖基化甜菊醇糖苷及其异构体。参见图2；另见，由harrietwallin，foodagric.org筹备的steviolglycosideschemicalandtechnicalassessment69thjecfa，2007。
如本文中所用，术语“甜菊醇糖苷前体”和“甜菊醇糖苷前体化合物”用于指甜菊醇糖苷生物合成途径中的中间化合物。甜菊醇糖苷前体包括但不限于牻牛儿基牻牛儿基二磷酸(ggpp)、内根-柯巴基-二磷酸、内根-贝壳杉烯、内根-贝壳杉烯醇(ent-kaurenol)、内根-贝壳杉烯醛(ent-kaurenal)、内根-贝壳杉烯酸和甜菊醇。参见图1。在一些实施方案中，甜菊醇糖苷前体本身是甜菊醇糖苷化合物。例如，19-smg、甜茶苷、甜菊苷和rebe是rebm的甜菊醇糖苷前体。参见图2。甜菊醇糖苷和/或甜菊醇糖苷前体可以在体内(即在重组宿主中)、体外(即酶促)产生或通过全细胞生物转化来产生。如本文中所用，术语“产生”和“积累”可以互换使用，用于描述体内、体外合成甜菊醇糖苷和甜菊醇糖苷前体或通过全细胞生物转化合成甜菊醇糖苷和甜菊醇糖苷前体。
在wo2011/153378、wo2013/022989、wo2014/122227和wo2014/122328中描述了产生重组甜菊醇糖苷的酿酒酵母(s.cerevisiae)菌株。在wo2011/153378、wo2013/022989、wo2014/122227和wo2014/122328中中也描述了通过全细胞生物转化和体外在重组宿主中产生甜菊醇糖苷的方法。所有这些出版物均由此通过引用整体并入本文。
在一些实施方案中，通过在重组宿主中表达参与甜菊醇糖苷生物合成途径的一种或多种酶而在体内产生甜菊醇糖苷。例如，产生甜菊醇的重组宿主可以在体内产生甜菊醇糖苷，所述重组宿主表达编码多肽的重组基因，所述多肽能够使甜菊醇或甜菊醇糖苷在其c-19羧基处糖基化，并与seqidno：2或119所示的氨基酸序列具有至少50％序列同一性(结构类似于ugt85家族成员的能够使甜菊醇或甜菊醇糖苷在其c-19羧基处糖基化的udp-糖基转移酶(ugt)多肽)。
在一些实施方案中，包含以下基因的重组宿主能够在体内产生甜菊醇：编码能够从法尼基二磷酸(fpp)和异戊烯基二磷酸(ipp)合成牻牛儿基牻牛儿基焦磷酸(ggpp)的多肽(例如，牻牛儿基牻牛儿基二磷酸合酶(ggpps))的基因；编码能够从ggpp合成内根-柯巴基二磷酸的多肽(例如，内根-柯巴基二磷酸合酶(cdps))的基因；编码能够从内根-柯巴基焦磷酸合成内根-贝壳杉稀的多肽(例如，贝壳杉烯合酶(ks))的基因；编码能够从内根-贝壳杉稀合成内根-贝壳杉烯酸的多肽(例如，贝壳杉烯氧化酶(ko))的基因；编码能够还原细胞色素p450复合物的多肽(例如，细胞色素p450还原酶(cpr)；例如，但不限于能够在nadph至nadp+的转化过程中将电子从nadph转移至细胞色素p450复合物的多肽，其用作萜类生物合成的辅因子)的基因；和编码能够从内根-贝壳杉烯酸合成甜菊醇的多肽(例如，甜菊醇合酶(kah))的基因；和/或编码能够从ggpp合成内根-柯巴基二磷酸并且从内根-柯巴基焦磷酸合成内根-贝壳杉烯的双功能多肽(例如，内根-柯巴基二磷酸合酶(cdps)-内根-贝壳杉烯合酶(ks)多肽)的基因。参见例如图1。技术人员将会理解，这些基因中的一种或多种对于宿主可以是内源性的，条件是这些基因中的至少一种(在一些实施方案中全部)是被引入重组宿主中的重组基因。
在一些实施方案中，通过在重组宿主中表达重组基因来在体内产生甜菊醇糖苷和/或甜菊醇糖苷前体，所述重组基因编码能够使甜菊醇或甜菊醇糖苷在其c-19羧基处糖基化并与seqidno：2或119所示的氨基酸序列具有至少50％序列同一性的多肽以及参与甜菊醇糖苷生物合成途径的一种或多种酶。例如，包含以下基因的产生甜菊醇的重组宿主可在体内产生甜菊醇糖苷和/或甜菊醇糖苷前体：编码能使甜菊醇或甜菊醇糖苷在其c-19羧基处糖基化并与seqidno：2或119所示的氨基酸序列具有至少50％序列同一性的多肽的基因；编码能够从法尼基二磷酸(fpp)和异戊烯基二磷酸(ipp)合成牻牛儿基牻牛儿基焦磷酸(ggpp)的多肽的基因；编码能够从ggpp合成内根-柯巴基二磷酸的多肽的基因；编码能够从内根-柯巴基焦磷酸合成内根-贝壳杉稀的多肽的基因；编码能够从内根-贝壳杉稀合成内根-贝壳杉烯酸的多肽的基因；编码能够还原细胞色素p450复合物的多肽的基因；和/或编码能够从ggpp合成内根-柯巴基二磷酸并且从内根-柯巴基焦磷酸合成内根-贝壳杉烯的双功能多肽的基因；编码能够使甜菊醇或甜菊醇糖苷在其c-13羟基处糖基化的多肽(例如，ugt85c2多肽)的基因；编码能够使甜菊醇糖苷的13-o-葡萄糖、19-o-葡萄糖或13-o-葡萄糖和19-o-葡萄糖两者的c3′进行β1，3糖基化的多肽(例如，ugt76g1多肽)的基因；编码能够使甜菊醇或甜菊醇糖苷在其c-19羧基处糖基化的多肽(例如，ugt74g1多肽)的基因；和/或编码能够使甜菊醇糖苷的13-o-葡萄糖、19-o-葡萄糖或13-o-葡萄糖和19-o-葡萄糖两者的c2′进行β1，2糖基化的多肽(例如，ugt91d2和eugt11多肽)的基因。参见例如，图1和2。本领域技术人员将会理解，这些基因中的一种或多种对于宿主可以是内源性的，条件是这些基因中的至少一个(并且在一些实施例中全部)是被引入重组宿主的重组基因。
在一些方面，能够从法呢基二磷酸(fpp)和异戊烯基二磷酸(ipp)合成牻牛儿基牻牛儿基焦磷酸(ggpp)的多肽包括具有seqidno：20(其可由seqidno：19所示的核苷酸序列编码)、seqidno：22(由seqidno：21所示的核苷酸序列编码)、seqidno：24(由seqidno：23所示的核苷酸序列编码)、seqidno：26(由seqidno：25所示的核苷酸序列编码)、seqidno：28(由seqidno：27所示的核苷酸序列编码)、seqidno：30(由seqidno：29所示的核苷酸序列编码)、seqidno：32(由seqidno：31所示的核苷酸序列编码)或seqidno：116(由seqidno：115所示的核苷酸序列)所示的氨基酸序列的多肽。
在一些方面，能够从ggpp合成内根-柯巴基二磷酸的多肽包括具有seqidno：34(其可由seqidno：33所示的核苷酸序列编码)、seqidno：36(由seqidno：35所示的核苷酸序列编码)、seqidno：38(由seqidno：37所示的核苷酸序列编码)、seqidno：40(由seqidno：39所示的核苷酸序列编码)或seqidno：42(由seqidno：41所示的核苷酸序列编码)所示的氨基酸序列的多肽。在一些实施方案中，能够从ggpp合成内根-柯巴基二磷酸的多肽缺乏叶绿体转运肽。
在一些方面，能够从内根-柯巴基焦磷酸合成内根-贝壳杉烯的多肽包括具有seqidno：44(其可由seqidno：43中所示的核苷酸序列编码)、seqidno：46(由seqidno：45所示的核苷酸序列编码)、seqidno：48(由seqidno：47所示的核苷酸序列编码)、seqidno：50(由seqidno：49列出的核苷酸序列编码)或seqidno：52(由seqidno：51所示的核苷酸序列编码)所示氨基酸序列的多肽。
在一些实施方案中，重组宿主包含编码双功能多肽的基因，所述双功能多肽能够从ggpp合成内根-柯巴基二磷酸并且从内根-柯巴基焦磷酸合成内根-贝壳杉烯。在一些方面，双功能多肽包括具有seqidno：54(其可由seqidno：53所示的核苷酸序列编码)、seqidno：56(由seqidno：55所示的核苷酸编码)或seqidno：58(由seqidno：57所示的核苷酸序列编码)所示的氨基酸序列。
在一些方面，能够从内根-贝壳杉烯合成内根-贝壳杉烯酸的多肽包括具有seqidno：60(其可由seqidno：59所示的核苷酸序列编码)、seqidno：62(由seqidno：61所示的核苷酸序列编码)、seqidno：66(由seqidno：65所示的核苷酸序列编码)、seqidno：68(由seqidno：67所示的核苷酸序列编码)、seqidno：70(由seqidno：69所示的核苷酸序列编码)、seqidno：72(由seqidno：71所示的核苷酸序列编码)、seqidno：74(由seqidno：73所示的核苷酸序列编码)、seqidno：76(由seqidno：75所示的核苷酸序列编码)或seqidno：117(由seqidno：63或seqidno：64所示的核苷酸序列编码)所示氨基酸序列的多肽。
在一些方面，能够还原细胞色素p450复合物的多肽包括具有seqidno：78(其可由seqidno：77所示的核苷酸序列编码)、seqidno：80(由seqidno：79所示的核苷酸序列编码)、seqidno：82(由seqidno：81所示的核苷酸序列编码)、seqidno：84(由seqidno：83所示的核苷酸序列编码)、seqidno：86(由seqidno：85所示的核苷酸序列编码)、seqidno：88(由seqidno：87所示的核苷酸序列编码)、seqidno：90(由seqidno：89所示的核苷酸序列编码)或seqidno：92(由seqidno：91所示的核苷酸序列编码)所示的氨基酸序列的多肽。
在一些方面，能够从内根-贝壳杉烯酸合成甜菊醇的多肽包括具有seqidno：94(其可由seqidno：93所示的核苷酸序列编码)、seqidno：97(由seqidno：95或seqidno：96所示的核苷酸序列编码)、seqidno：100(由seqidno：98或seqidno：99所示的核苷酸序列编码)、seqidno：101、seqidno：102、seqidno：103、seqidno：104、seqidno：106(由seqidno：105所示的核苷酸序列编码)、seqidno：108(由seqidno：107所示的核苷酸序列编码)、seqidno：110(由seqidno：109所示的核苷酸序列编码)、seqidno：112(由seqidno：111所示的核苷酸序列编码)或seqidno：114(由seqidno：113所示的核苷酸序列编码)所示的氨基酸序列的多肽。
在一些实施方案中，重组宿主包含以下核酸：编码能够使甜菊醇或甜菊醇糖苷在其c-13羧基处糖基化的多肽(例如，ugt85c2多肽)(seqidno：7)的核酸、编码能够使甜菊醇糖苷的13-o-葡萄糖、19-o-葡萄糖或13-o-葡萄糖和19-o-葡萄糖两者的c3′进行β1，3糖基化的多肽(例如ugt76g1多肽)(seqidno：9)的核酸、编码能够使甜菊醇或甜菊醇糖苷在其c-19羧基处糖基化的多肽(例如，ugt74g1多肽)(seqidno：4)的核酸、编码能够使甜菊醇糖苷的13-o-葡萄糖、19-o-葡萄糖或13-o-葡萄糖和19-o-葡萄糖两者的c2′进行β1，2糖基化的多肽(例如，eugt11多肽)(seqidno：16)的核酸、编码能够使甜菊醇或甜菊醇糖苷在其c-19羧基处糖基化的多肽(例如，ugt33942多肽)(seqidno：2)的核酸、和/或编码能够使甜菊醇或甜菊醇糖苷在其c-19羧基处糖基化的多肽(例如，ugt33786多肽)的核酸(seqidno：119)。在一些方面，能够使甜菊醇糖苷的13-o-葡萄糖、19-o-葡萄糖或13-o-葡萄糖和19-o-葡萄糖两者的c2′进行β1，2糖基化的多肽(例如，ugt91d2多肽)可以是ugt91d2e多肽(seqidno：11)或ugt91d2e-b多肽(seqidno：13)。
在一些方面，能够使甜菊醇或甜菊醇糖苷在其c-13羟基处糖基化的多肽由seqidno：5或seqidno：6所示的核苷酸序列编码，能够使甜菜醇糖苷的13-o-葡萄糖、19-o-葡萄糖或13-o-葡萄糖和19-o-葡萄糖两者的c3′进行β1，3糖基化的多肽由seqidno：8所示的核苷酸序列编码，能够使甜菊醇或甜菊醇糖苷在其c-19羧基处糖基化的多肽由seqidno：3所示的核苷酸序列编码，能够使甜菊醇糖苷的13-o-葡萄糖、19-o-葡萄糖或13-o-葡萄糖和19-o-葡萄糖两者的c2′进行β1，2糖基化的多肽由seqidno：10、12、14或15所示的核苷酸序列编码，ugt33942多肽由seqidno：1所示的核苷酸序列编码，并且ugt33786多肽由seqidno：118所示的核苷酸序列编码。技术人员将会理解，这些基因的表达可能是产生特定甜菊醇糖苷所必需的，但是这些基因中的一种或多种对于宿主可以是内源性的，条件是这些基因中的至少一种(在一些实施方案中全部)是被引入重组宿主的重组基因。
在具体的实施方案中，产生甜菊醇的重组微生物包含编码以下多肽的外源核酸：能够使甜菊醇或甜菊醇糖苷在其c-13羟基处糖基化的多肽、能够使甜菊醇糖苷的13-o-葡萄糖、19-o-葡萄糖或13-o-葡萄糖和19-o-葡萄糖两者的c3′进行β1，3糖基化的多肽、或能够使甜菊醇糖苷多肽的13-o-葡萄糖、19-o-葡萄糖或13-o-葡萄糖和19-o-葡萄糖两者的c2’进行β1，2糖基化的多肽。
在另一个具体的实施方案中，产生甜菊醇的重组微生物包含编码以下多肽的外源核酸：能够使甜菊醇或甜菊醇糖苷在其c-13羟基处糖基化的多肽；能够使甜菊醇糖苷的13-o-葡萄糖、19-o-葡萄糖或13-o-葡萄糖和19-o-葡萄糖两者的c3′进行β1，3糖基化的多肽；能够使甜菊醇或甜菊醇糖苷在其c-19羧基处糖基化的多肽；和能够使甜菊醇糖苷的13-o-葡萄糖、19-o-葡萄糖或13-o-葡萄糖和19-o-葡萄糖两者的c2’进行β1，2糖基化的多肽。
在另一个具体的实施方案中，产生甜菊醇的重组微生物包含编码以下多肽的外源核酸：能够使甜菊醇或甜菊醇糖苷在其c-13羟基处糖基化的多肽；能够使甜菊醇糖苷的13-o-葡萄糖、19-o-葡萄糖或13-o-葡萄糖和19-o-葡萄糖两者的c3′进行β1，3糖基化的多肽；能够使甜菊醇或甜菊醇糖苷在其c-19羧基处糖基化的多肽；和能够使甜菊醇糖苷的13-o-葡萄糖、19-o-葡萄糖或13-o-葡萄糖和19-o-葡萄糖两者的c2’进行β1，2糖基化的多肽和/或ugt33942多肽。
在另一个具体的实施方案中，产生甜菊醇的重组微生物包含编码以下多肽的外源核酸：能够使甜菊醇或甜菊醇糖苷在其c-13羟基处糖基化的多肽；能够使甜菊醇糖苷的13-o-葡萄糖、19-o-葡萄糖或13-o-葡萄糖和19-o-葡萄糖两者的c3′进行β1，3糖基化的多肽；能够使甜菊醇或甜菊醇糖苷在其c-19羧基处糖基化的多肽；和能够使甜菊醇糖苷的13-o-葡萄糖、19-o-葡萄糖或13-o-葡萄糖和19-o-葡萄糖两者的c2’进行β1，2糖基化的多肽；和/或ugt33786多肽。
在另一个具体的实施方案中，产生甜菊醇的重组微生物包含编码以下多肽的外源核酸：能够使甜菊醇或甜菊醇糖苷在其c-13羟基处糖基化的多肽；能够使甜菊醇糖苷的13-o-葡萄糖、19-o-葡萄糖或13-o-葡萄糖和19-o-葡萄糖两者的c3′进行β1，3糖基化的多肽；能够使甜菊醇或甜菊醇糖苷在其c-19羧基处糖基化的多肽；和能够使甜菊醇糖苷的13-o-葡萄糖、19-o-葡萄糖或13-o-葡萄糖和19-o-葡萄糖两者的c2’进行β1，2糖基化的多肽；和/或ugt33942多肽和ugt33786多肽。
在一些实施方案中，通过在重组宿主中表达在甜菊醇糖苷生物合成途径中发现的能够反应的一种或多种酶来在体内产生甜菊醇糖苷和/或甜菊醇糖苷前体。例如，表达以下基因中的一种或多种的产生甜菊醇的重组宿主可在体内产生甜菊醇糖苷和/或甜菊醇糖苷前体：编码能够从法尼基二磷酸(fpp)和异戊烯基二磷酸(ipp)合成牻牛儿基牻牛儿基焦磷酸(ggpp)的多肽的基因；编码能够从ggpp合成内根-柯巴基二磷酸的多肽的基因；编码能够从内根-柯巴基焦磷酸合成内根-贝壳杉稀的多肽的基因；编码能够从内根-贝壳杉稀合成内根-贝壳杉烯酸的多肽的基因；编码能够从内根-贝壳杉稀酸合成甜菊醇的多肽的基因；编码能够还原细胞色素p450复合物的多肽的基因；和/或编码能够从ggpp合成内根-柯巴基二磷酸并且从内根-柯巴基焦磷酸合成内根-贝壳杉烯的双功能多肽的基因；和编码以下多肽的一种或多种基因：能够使甜菊醇糖苷的13-o-葡萄糖、19-o-葡萄糖或13-o-葡萄糖和19-o-葡萄糖两者的c3′进行β1，3糖基化的多肽、能够使甜菊醇糖苷的13-o-葡萄糖、19-o-葡萄糖或13-o-葡萄糖和19-o-葡萄糖两者的c2′进行β1，2糖基化的多肽和能够使甜菊醇或甜菊醇糖苷在其c-13羟基处糖基化的多肽、或能够使甜菊醇或甜菊醇糖苷在其c-19羧基处糖基化的多肽。技术人员将会理解，这些基因中的一种或多种对于宿主可以是内源性的，条件是这些基因中的至少一种(并且在一些实施方案中全部)是被引入重组宿主中的重组基因。
在一些实施方案中，通过在重组宿主中表达重组基因来在体内产生甜菊醇糖苷和/或甜菊醇糖苷前体，所述重组基因编码结构类似于ugt85家族成员的能够使甜菊醇或甜菊醇糖苷在其c-19羧基处糖基化的udp-糖基转移酶(ugt)多肽(例如ugt33942和ugt33786)，以及在甜菊醇糖苷生物合成途径中发现的能够反应的一种或多种酶。例如，产生甜菊醇的重组宿主可在体内产生甜菊醇糖苷，所述重组宿主表达在结构类似于ugt85家族成员的能够使甜菊醇或甜菊醇糖苷在其c-19羧基处糖基化的udp-糖基转移酶(ugt)多肽(例如，ugt33942和ugt33786)；以及以下一种或多种基因：编码能够从法尼基二磷酸(fpp)和异戊烯基二磷酸(ipp)合成牻牛儿基牻牛儿基焦磷酸(ggpp)的多肽的基因、编码能够从ggpp合成内根-柯巴基二磷酸的多肽的基因、编码能够从内根-柯巴基焦磷酸合成内根-贝壳杉稀的多肽的基因、编码能够从内根-贝壳杉稀合成内根-贝壳杉烯酸的多肽的基因、编码能够从内根-贝壳杉稀酸合成甜菊醇的多肽的基因、编码能够还原细胞色素p450复合物的多肽的基因和/或编码能够从ggpp合成内根-柯巴基二磷酸并且从内根-柯巴基焦磷酸合成内根-贝壳杉烯的双功能多肽的基因；和编码以下多肽的一种或多种基因：能够使甜菊醇糖苷的13-o-葡萄糖、19-o-葡萄糖或13-o-葡萄糖和19-o-葡萄糖两者的c3′进行β1，3糖基化的多肽、能够使甜菊醇糖苷的13-o-葡萄糖、19-o-葡萄糖或13-o-葡萄糖和19-o-葡萄糖两者的c2′进行β1，2糖基化的多肽、和能够使甜菊醇或甜菊醇糖苷在其c-13羟基处糖基化的多肽或能够使甜菊醇或甜菊醇糖苷在其c-19羧基处糖基化的多肽。技术人员将会理解，这些基因中的一种或多种对于宿主可以是内源性的，条件是这些基因中的至少一种(并且在一些实施方案中全部)是被引入重组宿主中的重组基因。
在另一个实例中，表达以下基因的重组宿主可在体内产生甜菊醇：编码能够从法尼基二磷酸(fpp)和异戊烯基二磷酸(ipp)合成牻牛儿基牻牛儿基焦磷酸(ggpp)的多肽的基因、编码能够从ggpp合成内根-柯巴基二磷酸的多肽的基因、编码能够从内根-柯巴基焦磷酸合成内根-贝壳杉稀的多肽的基因、编码能够从内根-贝壳杉稀合成内根-贝壳杉烯酸的多肽的基因、编码能够从内根-贝壳杉稀酸合成甜菊醇的多肽的基因、编码能够还原细胞色素p450复合物的多肽的基因和/或编码能够从ggpp合成内根-柯巴基二磷酸并且从内根-柯巴基焦磷酸合成内根-贝壳杉烯的双功能多肽的基因。技术人员将会理解，这些基因中的一种或多种对于宿主可以是内源性的，条件是这些基因中的至少一种(并且在一些实施方案中全部)是被引入重组宿主中的重组基因。
在另一个实例中，表达以下基因的重组宿主可在体内产生甜菊醇糖苷：编码结构类似于ugt85家族成员的能够使甜菊醇或甜菊醇糖苷在其c-19羧基处糖基化的udp-糖基转移酶(ugt)多肽(例如ugt33942和ugt33786)的重组基因、编码能够从法尼基二磷酸(fpp)和异戊烯基二磷酸(ipp)合成牻牛儿基牻牛儿基焦磷酸(ggpp)的多肽的基因、编码能够从ggpp合成内根-柯巴基二磷酸的多肽的基因、编码能够从内根-柯巴基焦磷酸合成内根-贝壳杉稀的多肽的基因、编码能够从内根-贝壳杉稀合成内根-贝壳杉烯酸的多肽的基因、编码能够从内根-贝壳杉稀酸合成甜菊醇的多肽的基因、编码能够还原细胞色素p450复合物的多肽的基因、和/或编码能够从ggpp合成内根-柯巴基二磷酸并且从内根-柯巴基焦磷酸合成内根-贝壳杉烯的双功能多肽的基因。技术人员将会理解，这些基因中的一种或多种对于宿主可以是内源性的，条件是这些基因中的至少一种(并且在一些实施方案中全部)是被引入重组宿主中的重组基因。
在另一个实例中，表达以下基因的重组宿主可在体内产生甜菊醇糖苷：编码能够从法尼基二磷酸(fpp)和异戊烯基二磷酸(ipp)合成牻牛儿基牻牛儿基焦磷酸(ggpp)的多肽的基因；编码能够从ggpp合成内根-柯巴基二磷酸的多肽的基因；编码能够从内根-柯巴基焦磷酸合成内根-贝壳杉稀的多肽的基因；编码能够从内根-贝壳杉稀合成内根-贝壳杉烯酸的多肽的基因；编码能够从内根-贝壳杉稀酸合成甜菊醇的多肽的基因；编码能够还原细胞色素p450复合物的多肽的基因；和/或编码能够从ggpp合成内根-柯巴基二磷酸并且从内根-柯巴基焦磷酸合成内根-贝壳杉烯的双功能多肽的基因；和编码以下多肽的一种或多种基因：能够使甜菊醇糖苷的13-o-葡萄糖、19-o-葡萄糖或13-o-葡萄糖和19-o-葡萄糖两者的c3′进行β1，3糖基化的多肽、能够使甜菊醇糖苷的13-o-葡萄糖、19-o-葡萄糖或13-o-葡萄糖和19-o-葡萄糖两者的c2′进行β1，2糖基化的多肽和、能够使甜菊醇或甜菊醇糖苷在其c-13羟基处糖基化的多肽或能够使甜菊醇或甜菊醇糖苷在其c-19羧基处糖基化的多肽。技术人员将会理解，这些基因中的一种或多种对于宿主可以是内源性的，条件是这些基因中的至少一种(并且在一些实施方案中全部)是被引入重组宿主中的重组基因。
在另一个实例中，表达以下基因的重组宿主可在体内产生甜菊醇糖苷：编码结构类似于ugt85家族成员的能够使甜菊醇或甜菊醇糖苷在其c-19羧基处糖基化的udp-糖基转移酶(ugt)多肽(例如，ugt33942和ugt33786)的重组基因；编码能够从法尼基二磷酸(fpp)和异戊烯基二磷酸(ipp)合成牻牛儿基牻牛儿基焦磷酸(ggpp)的多肽的基因；编码能够从ggpp合成内根-柯巴基二磷酸的多肽的基因；编码能够从内根-柯巴基焦磷酸合成内根-贝壳杉稀的多肽的基因；编码能够从内根-贝壳杉稀合成内根-贝壳杉烯酸的多肽的基因；编码能够从内根-贝壳杉稀酸合成甜菊醇的多肽的基因；编码能够还原细胞色素p450复合物的多肽的基因；和/或能够从ggpp合成内根-柯巴基二磷酸并且从内根-柯巴基焦磷酸合成内根-贝壳杉烯的双功能多肽；和编码以下多肽的一种或多种基因：能够使甜菊醇糖苷的13-o-葡萄糖、19-o-葡萄糖或13-o-葡萄糖和19-o-葡萄糖两者的c3′进行β1，3糖基化的多肽、能够使甜菊醇糖苷的13-o-葡萄糖、19-o-葡萄糖或13-o-葡萄糖和19-o-葡萄糖两者的c2′进行β1，2糖基化的多肽、和能够使甜菊醇或甜菊醇糖苷在其c-13羟基处糖基化的多肽或能够使甜菊醇或甜菊醇糖苷在其c-19羧基处糖基化的多肽。技术人员将会理解，这些基因中的一种或多种对于宿主可以是内源性的，条件是这些基因中的至少一种(并且在一些实施方案中全部)是被引入重组宿主中的重组基因。
在一些实施方案中，甜菊醇糖苷包括甜菊醇-13-o-葡糖苷(13-smg)、甜菊醇-1，2-二糖苷、甜菊醇-1，3-二糖苷、甜菊醇-19-o-葡糖苷(19-smr)、甜菊苷、1，3-甜菊苷、甜茶苷、莱鲍迪苷a(reba)、莱鲍迪苷b(rebb)、莱鲍迪苷c(rebc)、莱鲍迪苷d(rebd)、莱鲍迪苷e(rebe)、莱鲍迪苷f(rebf)、莱鲍迪苷m(rebm)、莱鲍迪苷q(rebq)、莱鲍迪苷i(rebi)、杜克苷a或其异构体。
在一些方面，能够从法呢基二磷酸(fpp)和异戊烯基二磷酸(ipp)合成牻牛儿基牻牛儿基焦磷酸焦磷酸(ggpp)的多肽包括具有seqidno：20(其可由seqidno：19所示的核苷酸序列编码)、seqidno：22(由seqidno：21所示的核苷酸序列编码)、seqidno：24(由seqidno：23所示的核苷酸序列编码)、seqidno：26(由seqidno：25所示的核苷酸序列编码)、seqidno：28(由seqidno：27所示的核苷酸序列编码)、seqidno：30(由seqidno：29所示的核苷酸序列编码)、seqidno：32(由seqidno：31所示的核苷酸序列编码)或seqidno：116(由seqidno：115所示的核苷酸序列)所示的氨基酸序列的多肽。
在一些方面，能够从ggpp合成内根-柯巴基二磷酸的多肽包括具有seqidno：34(其可由seqidno：33所示的核苷酸序列编码)、seqidno：36(由seqidno：35所示的核苷酸序列编码)、seqidno：38(由seqidno：37所示的核苷酸序列编码)、seqidno：40(由seqidno：39所示的核苷酸序列编码)或seqidno：42(由seqidno：41所示的核苷酸序列编码)所示的氨基酸序列的多肽。在一些实施方案中，能够从ggpp合成内根-柯巴基二磷酸的多肽缺乏叶绿体转运肽。
在一些方面，能够从内根-柯巴基焦磷酸合成内根-贝壳杉烯的多肽包括具有seqidno：44(其可由seqidno：43中所示的核苷酸序列编码)、seqidno：46(由seqidno：45所示的核苷酸序列编码)、seqidno：48(由seqidno：47所示的核苷酸序列编码)、seqidno：50(由seqidno：49列出的核苷酸序列编码)或seqidno：52(由seqidno：51所示的核苷酸序列编码)所示氨基酸序列的多肽。
在一些方面，能够从内根-贝壳杉烯合成内根-贝壳杉烯酸的多肽包括具有seqidno：60(其可由seqidno：59所示的核苷酸序列编码)、seqidno：62(由seqidno：61所示的核苷酸序列编码)、seqidno：66(由seqidno：65所示的核苷酸序列编码)、seqidno：68(由seqidno：67所示的核苷酸序列编码)、seqidno：70(由seqidno：69所示的核苷酸序列编码)、seqidno：72(由seqidno：71所示的核苷酸序列编码)、seqidno：74(由seqidno：73所示的核苷酸序列编码)、seqidno：76(由seqidno：75所示的核苷酸序列编码)或seqidno：117(由seqidno：63或seqidno：64所示的核苷酸序列编码)所示氨基酸序列的多肽。
在一些方面，能够还原细胞色素p450复合物的多肽包括具有seqidno：78(其可由seqidno：77所示的核苷酸序列编码)、seqidno：80(由seqidno：79所示的核苷酸序列编码)、seqidno：82(由seqidno：81所示的核苷酸序列编码)、seqidno：84(由seqidno：83所示的核苷酸序列编码)、seqidno：86(由seqidno：85所示的核苷酸序列编码)、seqidno：88(由seqidno：87所示的核苷酸序列编码)、seqidno：90(由seqidno：89所示的核苷酸序列编码)或seqidno：92(由seqidno：91所示的核苷酸序列编码)所示的氨基酸序列的多肽。
在一些方面，能够从内根-贝壳杉烯酸合成甜菊醇的多肽包括具有seqidno：94(其可由seqidno：93所示的核苷酸序列编码)、seqidno：97(由seqidno：95或seqidno：96所示的核苷酸序列编码)、seqidno：100(由seqidno：98或seqidno：99所示的核苷酸序列编码)、seqidno：101、seqidno：102、seqidno：103、seqidno：104、seqidno：106(由seqidno：105所示的核苷酸序列编码)、seqidno：108(由seqidno：107所示的核苷酸序列编码)、seqidno：110(由seqidno：109所示的核苷酸序列编码)、seqidno：112(由seqidno：111所示的核苷酸序列编码)或seqidno：114(由seqidno：113所示的核苷酸序列编码)所示的氨基酸序列的多肽。
在一些方面，能够从ggpp合成内根-柯巴基二磷酸并且从内根-柯巴基焦磷酸合成内根-贝壳杉烯的双功能多肽包括与seqidno：54、seqidno：56或seqidno：58所示的氨基酸序列具有至少50％同一性的多肽。
在一些方面，能够使甜菊醇或甜菊醇糖苷在其c-13羟基处糖基化的多肽包括具有seqidno：7(其可由seqidno：5或seqidno：6所示的核苷酸序列编码)所示的氨基酸序列的多肽。在一些方面，能够使甜菊醇糖苷的13-o-葡萄糖、19-o-葡萄糖或13-o-葡萄糖和19-o-葡萄糖两者的c3′进行β1，3糖基化的多肽包括具有seqidno：9(由seqidno：8所示的核苷酸序列编码)所示的序列的多肽。在一些方面，能够使甜菊醇或甜菊醇糖苷在其c-19羧基处糖基化的多肽包括具有seqidno：2、seqidno：4或seqidno：119(由seqidno：1、seqidno：3或seqidno：118所示的核苷酸序列编码)所示的序列的多肽。在某些方面，能够使甜菊醇糖苷的13-o-葡萄糖、19-o-葡萄糖或13-o-葡萄糖和19-o-葡萄糖两者的c2′β1，2糖基化的多肽包括具有seqidno：16、seqidno：11或seqidno：13(由seqidno：10、seqidno：12、seqidno：14或seqidno：15所示的核苷酸序列编码)所示的氨基酸序列的多肽。
在一些实施方案中，能够从法尼基二磷酸(fpp)和异戊烯二磷酸(ipp)合成牻牛儿基牻牛儿基焦磷酸(ggpp)的多肽是牻牛儿基牻牛儿基二磷酸合酶(ggpps)多肽。在一些实施方案中，能够从ggpp合成内根-柯巴基二磷酸的多肽是内根-柯巴基二磷酸合酶(cdps)多肽。在一些实施方案中，能够从内根-柯巴基焦磷酸合成内根-贝壳杉烯的多肽是内根-贝壳杉烯合酶(ks)多肽。在一些实施方案中，能够从内根-贝壳杉烯合成内根-贝壳杉烯酸的多肽是内根-贝壳杉烯氧化酶(ko)多肽。在一些实施方案中，能够从内根-贝壳杉烯酸合成甜菊醇的多肽是内根-贝壳杉烯酸羟化酶(kah)多肽。在一些实施方案中，能够还原细胞色素p450复合物的多肽是细胞色素p450还原酶(cpr)多肽。在一些实施方案中，所述能够使甜菊醇糖苷的13-o-葡萄糖、19-o-葡萄糖或13-o-葡萄糖和19-o-葡萄糖两者的c3′进行β1，3糖基化的多肽是能够使甜菊醇糖苷的13-o-葡萄糖、19-o-葡萄糖或13-o-葡萄糖和19-o-葡萄糖两者的c3′进行β1，3糖基化的多肽。在一些实施方案中，能够使甜菊醇或甜菊醇糖苷在其c-13羟基处糖基化的多肽是能够使甜菊醇或甜菊醇糖苷在其c-13羟基处糖基化的多肽。在一些实施方案中，能够从ggpp合成内根-柯巴基二磷酸并且从内根-柯巴基焦磷酸合成内根-贝壳杉烯的双功能多肽是内根-柯巴基二磷酸合酶(cdps)-内根-贝壳杉烯合酶(ks)多肽。在一些实施方案中，能够使甜菊醇或甜菊醇糖苷在其c-19羧基处糖基化的多肽是ugt74g1多肽、ugt33942多肽或ugt33786多肽。在一些实施方案中，能够使甜菊醇糖苷的13-o-葡萄糖、19-o-葡萄糖或13-o-葡萄糖和19-o-葡萄糖两者的c2′进行β1，2糖基化的多肽是ugt91d2多肽，诸如ugt91d2e或ugt91d2e-b或eugt11多肽。
在某些实施方案中，甜菊醇糖苷是reba、rebb、rebd和/或rebm。reba可在例如产生甜菊醇的重组微生物中合成，所述重组微生物表达能够使甜菊醇或甜菊醇糖苷在其c-13羟基处糖基化的多肽、能够使甜菊醇糖苷的13-o-葡萄糖、19-o-葡萄糖或13-o-葡萄糖和19-o-葡萄糖两者的c3′进行β1，3糖基化的多肽、能够使甜菊醇糖苷的13-o-葡萄糖、19-o-葡萄糖或13-o-葡萄糖和19-o-葡萄糖两者的c2′进行β1，2糖基化的多肽，和i)能够使甜菊醇或甜菊醇糖苷在其c-19羧基处糖基化的多肽、ii)ugt33942和/或iii)ugt33786。rebb可在例如产生甜菊醇的重组微生物中合成，所述重组微生物表达能够使甜菊醇或甜菊醇糖苷在其c-13羟基处糖基化的多肽、能够使甜菊醇糖苷的13-o-葡萄糖、19-o-葡萄糖或13-o-葡萄糖和19-o-葡萄糖两者的c3′进行β1，3糖基化的多肽、和能够使甜菊醇糖苷的13-o-葡萄糖、19-o-葡萄糖或13-o-葡萄糖和19-o-葡萄糖两者的c2′进行β1，2糖基化的多肽。rebd可在例如产生甜菊醇的重组微生物中合成，所述重组微生物表达能够使甜菊醇或甜菊醇糖苷在其c-13羟基处糖基化的多肽、能够使甜菊醇糖苷的13-o-葡萄糖、19-o-葡萄糖或13-o-葡萄糖和19-o-葡萄糖两者的c3′进行β1，3糖基化的多肽、能够使甜菊醇糖苷的13-o-葡萄糖、19-o-葡萄糖或13-o-葡萄糖和19-o-葡萄糖两者的c2′进行β1，2糖基化的多肽，和i)能够使甜菊醇或甜菊醇糖苷在其c-19羧基处糖基化的多肽、ii)ugt33942和/或iii)ugt33786。rebm可在例如产生甜菊醇的重组微生物中合成，所述重组微生物表达能够使甜菊醇或甜菊醇糖苷在其c-13羟基处糖基化的多肽、能够使甜菊醇糖苷的13-o-葡萄糖、19-o-葡萄糖或13-o-葡萄糖和19-o-葡萄糖两者的c3′进行β1，3糖基化的多肽、能够使甜菊醇糖苷的13-o-葡萄糖、19-o-葡萄糖或13-o-葡萄糖和19-o-葡萄糖两者的c2′进行β1，2糖基化的多肽，和i)能够使甜菊醇或甜菊醇糖苷在其c-19羧基处糖基化的多肽、ii)ugt33942和/或iii)ugt33786(参见图2)。
在某些实施方案中，甜菊醇糖苷是reba、rebb、rebd和/或rebm。reba可在产生甜菊醇的重组微生物中合成，所述重组微生物表达能够使甜菊醇或甜菊醇糖苷在其c-13羟基处糖基化的多肽、能够使甜菊醇糖苷的13-o-葡萄糖、19-o-葡萄糖或13-o-葡萄糖和19-o-葡萄糖两者的c3′进行β1，3糖基化的多肽、能够使甜菊醇糖苷的13-o-葡萄糖、19-o-葡萄糖或13-o-葡萄糖和19-o-葡萄糖两者的c2′进行β1，2糖基化的多肽，和i)能够使甜菊醇或甜菊醇糖苷在其c-19羧基处糖基化的多肽，ii)ugt33942和/或iii)ugt33786；rebb可在产生甜菊醇的重组微生物中合成，所述重组微生物表达能够使甜菊醇或甜菊醇糖苷在其c-13羟基处糖基化的多肽、能够使甜菊醇糖苷的13-o-葡萄糖、19-o-葡萄糖或13-o-葡萄糖和19-o-葡萄糖两者的c3′进行β1，3糖基化的多肽、和能够使甜菊醇糖苷的13-o-葡萄糖、19-o-葡萄糖或13-o-葡萄糖和19-o-葡萄糖两者的c2′进行β1，2糖基化的多肽；rebd可在产生甜菊醇的重组微生物中合成，所述重组微生物表达能够使甜菊醇或甜菊醇糖苷在其c-13羟基处糖基化的多肽、能够使甜菊醇糖苷的13-o-葡萄糖、19-o-葡萄糖或13-o-葡萄糖和19-o-葡萄糖两者的c3′进行β1，3糖基化的多肽、能够使甜菊醇或甜菊醇糖苷在其c-19羧基处糖基化的多肽，以及能够使甜菊醇糖苷的13-o-葡萄糖、19-o-葡萄糖或13-o-葡萄糖和19-o-葡萄糖两者的c2′进行β1，2糖基化的多肽，和i)能够使甜菊醇或甜菊醇糖苷在其c-19羧基处糖基化的多肽、ii)ugt33942和/或iii)ugt33786；rebm可在产生甜菊醇的重组微生物中合成，所述重组微生物表达能够使甜菊醇或甜菊醇糖苷在其c-13羟基处糖基化的多肽、能够使甜菊醇糖苷的13-o-葡萄糖、19-o-葡萄糖或13-o-葡萄糖和19-o-葡萄糖两者的c3′进行β1，3糖基化的多肽、能够使甜菊醇或甜菊醇糖苷在其c-19羧基处糖基化的多肽，以及能够使甜菊醇糖苷的13-o-葡萄糖、19-o-葡萄糖或13-o-葡萄糖和19-o-葡萄糖两者的c2′进行β1，2糖基化的多肽，和i)能够使甜菊醇或甜菊醇糖苷在其c-19羧基处糖基化的多肽、ii)ugt33942和/或iii)ugt33786；其中所述产生甜菊醇的宿主表达以下基因中的一种或多种基因：编码能够从法尼基二磷酸(fpp)和异戊烯基二磷酸(ipp)合成牻牛儿基牻牛儿基焦磷酸(ggpp)的多肽(例如，牻牛儿基牻牛儿基二磷酸合酶(ggpps))的基因；编码能够从ggpp合成内根-柯巴基二磷酸的多肽(例如，内根-柯巴基二磷酸合酶(cdps))的基因；编码能够从内根-柯巴基焦磷酸合成内根-贝壳杉稀的多肽(例如，贝壳杉烯合酶(ks))的基因；编码能够从内根-贝壳杉稀合成内根-贝壳杉烯酸的多肽(例如，贝壳杉烯氧化酶(ko))的基因；编码能够还原细胞色素p450复合物的多肽(例如，细胞色素p450还原酶(cpr))的基因；和编码能够从内根-贝壳杉烯酸合成甜菊醇的多肽(例如，甜菊醇合酶(kah))的基因；和/或编码能够从ggpp合成内根-柯巴基二磷酸并且从内根-柯巴基焦磷酸合成内根-贝壳杉烯的双功能多肽(例如，内根-柯巴基二磷酸合酶(cdps)-内根-贝壳杉烯合酶(ks)多肽)的基因；以及编码ugt多肽的基因，可在体内产生甜菊醇糖苷和/或甜菊醇糖苷前体。
在一些实施方案中，表达编码ugt33942多肽(seqidno：1、seqidno：2)的基因的酿酒酵母菌株将甜菊醇转化为19-smg。ugt33942是与ugt85家族的成员具有高度结构相似性的ugt多肽，并且催化甜菊醇和甜菊醇糖苷的19-o位的糖基化。参见实施例1和图3。在一些实施方案中，ugt33942催化i)甜菊醇-1，2-二糖苷至甜菊苷、ii)甜菊醇-1，3-二糖苷至1，3-甜菊苷、iii)13-smg至甜茶苷和/或iv)rebb至reba的转化。
在一些实施方案中，表达编码ugt33786多肽(seqidno：118、seqidno：119)的基因的酿酒酵母菌株将甜菊醇转化为19-smg。ugt33786是与ugt85家族的成员具有高度结构相似性的ugt多肽，并且催化甜菊醇和甜菊醇糖苷的19-o位的糖基化。参见实施例2和图4。在一些实施方案中，ugt33786催化i)甜菊醇-1，2-二糖苷至甜菊苷、ii)甜菊醇-1，3-二糖苷至1，3-甜菊苷、iii)13-smg至甜茶苷和/或iv)rebb至reba的转化。
在一些实施方案中，通过在体外使甜菊醇糖苷前体与参与甜菊醇糖苷途径的一种或多种酶接触来产生甜菊醇糖苷和/或甜菊醇糖苷前体。例如，使甜菊醇与ugt多肽接触可以引起在体外产生甜菊醇糖苷。在一些实施方案中，通过使上游甜菊醇糖苷前体与参与甜菊醇糖苷途径的一种或多种酶体外接触来产生甜菊醇糖苷前体。例如，使内根-贝壳杉烯酸与能够从内根-贝壳杉烯酸合成甜菊醇的多肽接触可引起在体外产生甜菊醇。
在一些实施方案中，通过使甜菊醇糖苷和/或甜菊醇糖苷前体与能够使甜菊醇或甜菊醇糖苷在其c-19羧基处糖基化的多肽接触来在体外产生甜菊醇糖苷。例如，使甜菊醇与能够使甜菊醇或甜菊醇糖苷在其c-19羧基处糖基化的多肽接触可引起在体外产生甜菊醇糖苷。在一些实施方案中，能够使甜菊醇或甜菊醇糖苷在其c-19羧基处糖基化的多肽是ugt33786多肽。在一些实施方案中，ugt33942多肽包括与seqidno：2所示的氨基酸序列具有至少50％同一性的多肽。在一些实施方案中，ugt33786多肽包括与seqidno：119所示的氨基酸具有至少50％同一性的多肽。在一些实施方案中，所产生的甜菊醇糖苷是19-smg。在一些实施方案中，接触发生在反应混合物中，所述反应混合物包含19-smg、结构类似于ugt85家族成员的能够使甜菊醇或甜菊醇糖苷在其c-19羧基处糖基化的udp-糖基转移酶(ugt)多肽(例如，ugt33942和ugt33786)、尿苷二磷酸(udp)-葡萄糖、udp-鼠李糖、udp-木糖和/或n-乙酰基-葡糖胺和/或反应缓冲液和/或盐。
在一些实施方案中，通过全细胞生物转化产生甜菊醇糖苷或甜菊醇糖苷前体。为了进行全细胞生物转化，使表达参与甜菊醇糖苷途径的一种或多种酶的宿主细胞摄取并修饰细胞中的甜菊醇糖苷或甜菊醇糖苷前体；在体内修饰后，甜菊醇糖苷或甜菊醇糖苷前体保留在细胞中和/或被分泌至细胞培养基中。例如，表达编码ugt多肽的基因的重组宿主细胞可摄取细胞中的甜菊醇和糖基化甜菊醇；在体内糖基化后，甜菊醇糖苷可被分泌到细胞培养基中。在一些实施方案中，将细胞透化以摄取待修饰的底物或分泌经修饰的产物。在另一个实例中，表达编码ugt多肽的基因的重组宿主细胞可摄取甜菊醇并使甜菊醇在细胞中糖基化；在体内糖基化后，甜菊醇糖苷可被分泌到细胞培养基中。然后可将透化的重组宿主细胞加入到细胞培养基中以摄取所述分泌的甜菊醇糖苷以进一步修饰并分泌另外的经修饰的产物。
在一些实施方案中，ugt多肽可以是能够使甜菊醇或甜菊醇糖苷在其c-13羟基处糖基化的多肽；能够使甜菊醇糖苷的13-o-葡萄糖、19-o-葡萄糖或13-o-葡萄糖和19-o-葡萄糖两者的c3′进行β1，3糖基化的多肽；能够使甜菊醇或甜菊醇糖苷在其c-19羧基处糖基化的多肽；以及能够使甜菊醇糖苷的13-o-葡萄糖、19-o-葡萄糖或13-o-葡萄糖和19-o-葡萄糖两者的c2′进行β1，2糖基化的多肽，和i)能够使甜菊醇或甜菊醇糖苷在其c-19羧基处糖基化的多肽和/或ii)结构类似于ugt85家族成员的能够使甜菊醇或甜菊醇糖苷在其c-19羧基处糖基化的udp-糖基转移酶(ugt)多肽(例如，ugt33942和ugt33786)。
在另一个实例中，表达以下基因中的一种或多种基因的产生甜菊醇的重组宿主可在细胞中产生甜菊醇：编码能够从法尼基二磷酸(fpp)和异戊烯基二磷酸(ipp)合成牻牛儿基牻牛儿基焦磷酸(ggpp)的多肽(例如，牻牛儿基牻牛儿基二磷酸合酶(ggpps))的基因；编码能够从ggpp合成内根-柯巴基二磷酸的多肽(例如，内根-柯巴基二磷酸合酶(cdps))的基因；编码能够从内根-柯巴基焦磷酸合成内根-贝壳杉稀的多肽(例如，贝壳杉烯合酶(ks))的基因；编码能够从内根-贝壳杉稀合成内根-贝壳杉烯酸的多肽(例如，贝壳杉烯氧化酶(ko))的基因；编码能够还原细胞色素p450复合物的多肽(例如，细胞色素p450还原酶(cpr))的基因；和编码能够从内根-贝壳杉烯酸合成甜菊醇的多肽(例如，甜菊醇合酶(kah))的基因；和/或编码能够从ggpp合成内根-柯巴基二磷酸并且从内根-柯巴基焦磷酸合成内根-贝壳杉烯的双功能多肽(例如，内根-柯巴基二磷酸合酶(cdps)-内根-贝壳杉烯合酶(ks)多肽)的基因；在体内产生后，甜菊醇可被分泌到细胞培养基中。然后将表达编码能够在体内使甜菊醇或甜菊糖苷糖基化的ugt多肽的基因的透化的重组宿主细胞添加到细胞培养基中，以摄取所述分泌的甜菊醇进行修饰并分泌经修饰的产物。
在一些实施方案中，ugt多肽可以是能够使甜菊醇或甜菊醇糖苷在其c-13羟基处糖基化的多肽；能够使甜菊醇糖苷的13-o-葡萄糖、19-o-葡萄糖或13-o-葡萄糖和19-o-葡萄糖两者的c3′进行β1，3糖基化的多肽；能够使甜菊醇或甜菊醇糖苷在其c-19羧基处糖基化的多肽；以及能够使甜菊醇糖苷的13-o-葡萄糖、19-o-葡萄糖或13-o-葡萄糖和19-o-葡萄糖两者的c2′进行β1，2糖基化的多肽，和i)能够使甜菊醇或甜菊醇糖苷在其c-19羧基处糖基化的多肽和/或ii)结构类似于ugt85家族成员的能够使甜菊醇或甜菊醇糖苷在其c-19羧基处糖基化的udp-糖基转移酶(ugt)多肽(例如，ugt33942和ugt33786)。
在一些实施方案中，通过在重组宿主中在表达参与甜菊醇糖苷生物合成途径的一种或多种酶的宿主细胞中进行全细胞生物转化来产生甜菊醇糖苷或甜菊醇糖苷前体。例如，表达编码能够使甜菊醇或甜菊醇糖苷在其c-19羧基处糖基化的多肽的重组基因的宿主细胞可在体内修饰甜菊醇糖苷和/或甜菊醇糖苷前体。
在一些实施方案中，可通过将能够使甜菊醇或甜菊醇糖苷在其c-19羧基处糖基化的多肽与锚定基序融合而将其展示在本文公开的重组宿主细胞的表面上。可通过n末端融合、c末端融合或夹心融合，将待展示的能够使甜菊醇或甜菊醇糖苷在其c-19羧基处糖基化的多肽(乘客蛋白(passengerprotein))与锚定基序(载体蛋白(carrierprotein))融合。此类细胞表面展示可以用于通过全细胞生物转化来产生甜菊醇糖苷和甜菊醇糖苷前体。
在一些实施方案中，能够使甜菊醇或甜菊醇糖苷在其c-19羧基处糖基化的多肽是ugt33942多肽。在一些实施方案中，能够使甜菊醇或甜菊醇糖苷在其c-19羧基处糖基化的多肽是ugt33786多肽。在一些实施方案中，ugt33942多肽包括与seqidno：2所示的氨基酸序列具有至少50％同一性的多肽。在一些实施方案中，ugt33786多肽包括与seqidno：119所示的氨基酸序列具有至少50％同一性的多肽。
在一些实施方案中，通过在重组宿主中在表达参与甜菊醇糖苷生物合成途径的一种或多种酶的宿主细胞中进行全细胞生物转化来产生甜菊醇糖苷或甜菊醇糖苷前体。例如，表达以下基因中的一种或多种基因的产生甜菊醇的重组宿主可在体内修饰甜菊醇糖苷或甜菊醇糖苷前体：编码能够从法尼基二磷酸(fpp)和异戊烯基二磷酸(ipp)合成牻牛儿基牻牛儿基焦磷酸(ggpp)的多肽(例如，牻牛儿基牻牛儿基二磷酸合酶(ggpps))的基因；编码能够从ggpp合成内根-柯巴基二磷酸的多肽(例如，内根-柯巴基二磷酸合酶(cdps))的基因；编码能够从内根-柯巴基焦磷酸合成内根-贝壳杉稀的多肽(例如，贝壳杉烯合酶(ks))的基因；编码能够从内根-贝壳杉稀合成内根-贝壳杉烯酸的多肽(例如，贝壳杉烯氧化酶(ko))的基因；编码能够还原细胞色素p450复合物的多肽(例如，细胞色素p450还原酶(cpr))的基因；和编码能够从内根-贝壳杉烯酸合成甜菊醇的多肽(例如，甜菊醇合酶(kah))的基因；和/或编码能够从ggpp合成内根-柯巴基二磷酸并且从内根-柯巴基焦磷酸合成内根-贝壳杉烯的双功能多肽(例如，内根-柯巴基二磷酸合酶(cdps)-内根-贝壳杉烯合酶(ks)多肽)的基因；以及编码ugt的基因。参见例如图1和2。技术人员将理解，这些基因中的一种或多种对于宿主可以是内源性的，条件是这些基因中的至少一种(并且在一些实施例中全部)是被引入重组宿主中的重组基因。
在一些实施方案中，通过在重组宿主中在宿主细胞中进行全细胞生物转化来产生甜菊醇糖苷或甜菊醇糖苷前体，所述宿主细胞表达能够使甜菊醇或甜菊醇糖苷在其c-19羧基处糖基化的多肽(例如，ugt33942和ugt33786)和参与重组宿主甜菊醇糖苷生物合成途径的一种或多种酶。例如，产生甜菊醇的重组宿主可在体内修饰甜菊醇糖苷和/或甜菊醇糖苷前体，所述重组宿主表达结构类似于ugt85家族成员的能够使甜菊醇糖苷或甜菊醇糖苷在其c-19羧基处糖基化的udp-糖基转移酶(ugt)多肽(例如，ugt33942和ugt33786)以及以下基因中的一种或多种：编码能够从法尼基二磷酸(fpp)和异戊烯基二磷酸(ipp)合成牻牛儿基牻牛儿基焦磷酸(ggpp)的多肽(例如，牻牛儿基牻牛儿基二磷酸合酶(ggpps))的基因；编码能够从ggpp合成内根-柯巴基二磷酸的多肽(例如，内根-柯巴基二磷酸合酶(cdps))的基因；编码能够从内根-柯巴基焦磷酸合成内根-贝壳杉稀的多肽(例如，贝壳杉烯合酶(ks))的基因；编码能够从内根-贝壳杉稀合成内根-贝壳杉烯酸的多肽(例如，贝壳杉烯氧化酶(ko))的基因；编码能够还原细胞色素p450复合物的多肽(例如，细胞色素p450还原酶(cpr))的基因；和编码能够从内根-贝壳杉烯酸合成甜菊醇的多肽(例如，甜菊醇合酶(kah))的基因；和/或编码能够从ggpp合成内根-柯巴基二磷酸并且从内根-柯巴基焦磷酸合成内根-贝壳杉烯的双功能多肽(例如，内根-柯巴基二磷酸合酶(cdps)-内根-贝壳杉烯合酶(ks)多肽)的基因；以及编码ugt多肽的基因。
在一些实施方案中，甜菊醇糖苷包括甜菊醇-13-o-葡糖苷(13-smg)、甜菊醇-1，2-二糖苷、甜菊醇-1，3-二糖苷、甜菊醇-19-o-葡糖苷(19-smg)、甜菊苷、1，3-甜菊苷、甜茶苷、莱鲍迪苷a(reba)、莱鲍迪苷b(rebb)、莱鲍迪苷c(rebc)、莱鲍迪苷d(rebd)、莱鲍迪苷e(rebe)、莱鲍迪苷f(rebf)、莱鲍迪苷m(rebm)、莱鲍迪苷q(rebq)、莱鲍迪苷i(rebi)、杜克苷a或其异构体。
在一些实施方案中，通过共培养两种或更多种宿主来产生甜菊醇、一种或多种甜菊醇糖苷前体和/或一种或多种甜菊醇糖苷。在一些实施方案中，各自表达参与甜菊醇糖苷途径的一种或多种酶的一种或多种宿主产生甜菊醇、一种或多种甜菊醇糖苷前体和/或一种或多种甜菊醇糖苷。例如，包含能够从法尼基二磷酸(fpp)和异戊烯基二磷酸(ipp)合成牻牛儿基牻牛儿基焦磷酸(ggpp)的多肽、能够从ggpp合成内根-柯巴基二磷酸的多肽、能够从内根-贝壳杉稀合成内根-贝壳杉烯酸的多肽、能够从内根-柯巴基焦磷酸合成内根-贝壳杉稀的多肽、能够从内根-贝壳杉烯酸合成甜菊醇的多肽和/或能够还原细胞色素p450复合物的多肽的宿主和包含一种或多种ugt的宿主产生一种或多种甜菊醇糖苷。
在一些实施方案中，甜菊醇糖苷包括甜菊醇-13-o-葡糖苷(13-smg)、甜菊醇-1，2-二糖苷、甜菊醇-1，3-二糖苷、甜菊醇-19-o-葡糖苷(19-smg)、甜菊苷、1，3-甜菊苷、甜茶苷、莱鲍迪苷a(reba)、莱鲍迪苷b(rebb)、莱鲍迪苷c(rebc)、莱鲍迪苷d(rebd)、莱鲍迪苷e(rebe)、莱鲍迪苷f(rebf)、莱鲍迪苷m(rebm)、莱鲍迪苷q(rebq)、莱鲍迪苷i(rebi)、杜克苷a或其异构体。
在一些实施方案中，体内、体外或通过全细胞生物转化产生的甜菊醇糖苷或甜菊醇糖苷前体组合物相较于来自除其它以外甜叶菊植物的甜叶菊提取物不包含或包含减少量或降低水平的源自植物的组分。源自植物的组分可以促成异味并且包括色素、脂质、蛋白质、酚类、糖类、匙叶桉油烯醇和其它倍半萜类、半日花烷型二萜、单萜、癸酸、8，11，14-二十碳三烯酸、2-甲基十八烷、二十五烷、二十八烷、二十四烷、十八烷醇、豆固醇、β-谷固醇、α-和β-香树素、羽扇豆醇、β-乙酸香树素酯、五环三萜、矢车菊黄素(centauredin)、槲皮素、表-α-杜松醇、丁香烯(carophyllene)及衍生物、β-蒎烯、β-谷固醇和赤霉素。在一些实施方案中，本文提及的源自植物的组分是非糖苷化合物。
如本文中所用，术语“可检测的量”、“可检测浓度”、“可测量的量”和“可测量的浓度”是指以auc、μm/od600、mg/l、μm或mm表示的测量的甜菊醇糖苷的水平。可通过本领域技术人员通常可获得的技术检测和/或分析甜菊醇糖苷产量(即，总的上清液和/或细胞内甜菊醇糖苷水平)，所述技术是例如但不限于液相色谱-质谱法(lc-ms)、薄层色谱法(tlc)、高效液相色谱法(hplc)、紫外-可见光谱/分光光度法(uv-vis)、质谱法(ms)和核磁共振光谱法(nmr)。
如本文中所用，术语“不可检测的浓度”是指太低而不能通过技术诸如tlc、hplc、uv-vis、ms或nmr测量和/或分析的化合物的水平。在一些实施方案中，“不可检测的浓度”的化合物不存在于甜菊醇糖苷或甜菊醇糖苷前体组合物中。
如本文中所用，术语“或”和“和/或”被用于描述多种组分的组合或彼此排除。例如，“x、y和/或z”可单独指“x”、单独指“y”、单独指“z”、“x、y和z”、“(x和y)或z”、“x或(y和z)”或“x或y或z”。在一些实施方案中，“和/或”用于指重组细胞包含的外源核酸，其中重组细胞包含选自组的一种或多种外源核酸。在一些实施方案中，“和/或”用于指甜菊醇糖苷和/或甜菊醇糖苷前体的产生。在一些实施方案中，“和/或”用于指甜菊醇糖苷的产生，其中产生一种或多种甜菊醇糖苷。在一些实施方案中，“和/或”用于指甜菊醇糖苷的产生，其中一种或多种甜菊醇糖苷通过一个或多个以下步骤产生：培养重组微生物，在重组微生物中合成一种或多种甜菊醇糖苷，和/或分离一种或多种甜菊醇糖苷。
功能同源物
上述多肽的功能同源物也适用于在重组宿主中产生甜菊醇糖苷。功能同源物是与参考多肽具有序列相似性并且执行参考多肽的一种或多种生物化学或生理功能的多肽。功能同源物和参照多肽可以是天然存在的多肽，并且序列相似性可以归因于趋同或趋异进化事件。因此，功能同源物有时在文献中被指定为同源物，或直系同源物或旁系同源物。天然存在的功能同源物的变体，诸如由野生型编码序列的突变体编码的多肽本身可以是功能同源物。也可以通过多肽编码序列的定点诱变或通过组合来自不同天然存在的多肽的编码序列的结构域(“结构域交换(domainswapping)”)来产生功能同源物。用于修饰本文所述的编码功能性多肽的基因的技术是已知的，并且包括，除其它以外，定向进化技术、定点诱变技术和随机诱变技术，并且可用于增加多肽的比活性，改变底物特异性，改变表达水平，改变亚细胞定位，或以期望的方式修饰多肽-多肽相互作用。此类经修饰的多肽被认为是功能同源物。术语“功能同源物”有时应用于编码功能上同源的多肽的核酸。
可通过分析核苷酸和多肽序列比对来鉴定功能同源物。例如，对核苷酸或多肽序列的数据库进行查询可鉴定甜菊醇糖苷生物合成多肽的同源物。序列分析可涉及使用ugt氨基酸序列作为参考序列的非冗余数据库的blast、交互blast或psi-blast分析。在某些情况下，氨基酸序列是从核苷酸序列推导而来的。数据库中具有大于40％序列同一性的那些多肽是用于进一步评估作为甜菊醇糖苷生物合成多肽的适合性的候选物。氨基酸序列相似性允许保守的氨基酸取代，诸如一个疏水残基对另一个疏水残基的取代或一个极性残基对另一个极性残基的取代。如果需要，可对此类候选物进行手动检查，以缩小待进一步评估的候选物数量。手动检查可通过选择似乎具有存在于甜菊醇糖苷生物合成多肽中的结构域(例如保守功能结构域)的那些候选物来实施。在一些实施方案中，基于表达水平而非通过使用blast分析从转录组数据鉴定核酸和多肽。
保守区可以通过定位甜菊醇糖苷生物合成多肽的一级氨基酸序列内的一个区域来鉴定，所述区域是重复序列，形成一些二级结构(例如，螺旋和β折叠)，建立带正电荷或负电荷的结构域，或者代表蛋白质基序或结构域。参见，例如，在万维网上于sanger.ac.uk/software/pfam/和pfam.janelia.org/上描述各种蛋白质基序和结构域的共有序列的pfam网站。包含在pfam数据库中的信息描述于sonnhammer等，nucl.acidsres.，26：320-322(1998)；sonnhammer等，proteins，28：405-420(1997)和bateman等，nucl.acidsres.，27：260-262(1999)中。保守区还可通过比对来自密切相关的物种的相同或相关多肽的序列来确定。密切相关的物种优选来自同一科。在一些实施方案中，来自两种不同物种的序列的比对足以鉴定此类同源物。
通常，表现出至少约40％氨基酸序列同一性的多肽可用于鉴定保守区域。相关多肽的保守区域显示出至少45％的氨基酸序列同一性(例如，至少50％，至少60％，至少70％，至少80％或至少90％氨基酸序列同一性)。在一些实施方案中，保守区显示至少92％、94％、96％、98％或99％氨基酸序列同一性。
例如，适合在重组宿主中产生甜菊醇的多肽包括ugt的功能同源物。
修饰例如ugt的底物特异性的方法是本领域技术人员已知的，并且包括但不限于定点/合理诱变方法、随机定向进化方法和组合，其中随机诱变/饱和技术在酶的活性位点附近进行。例如参见osmani等，2009，phytochemistry70：325-347。
候选序列通常具有参考序列长度的80％至200％的长度，例如82％、85％、87％、89％、90％、93％、95％、97％、99％、100％、105％、110％、115％、120％、130％、140％、150％、160％、170％、180％、190％或200％的参考序列的长度。功能同源物多肽通常具有为参考序列长度的95％至105％的长度，例如90％、93％、95％、97％、99％、100％、105％、110％、115％或120％的参考序列的长度，或其间的任何范围内的长度。任何候选核酸或多肽相对于参考核酸或多肽的同一性百分比可如下确定。使用允许在它们的整个长度(全局比对)上进行核酸或多肽序列的比对的计算机程序clustalw(1.83版，默认参数)将参考序列(例如，本文所述的核酸序列或氨基酸序列)与一个或多个候选序列进行比对。chenna等，2003，nucleicacidsres.31(13)：3497-500。
clustalw计算参考序列与一个或多个候选序列之间的最佳匹配，并比对它们以便可确定同一性、相似性和差异。可将一个或多个残基的空位插入参考序列、候选序列或两者中，以最大化序列比对。对于核酸序列的快速成对比对，使用以下默认参数：字长：2；窗口大小：4；评分方法：年龄％；顶对角线数目：4；以及空位罚分：5。对于核酸酸序列的多重比对，使用以下参数：空位开放罚分：10.0；空位延伸罚分：5.0；以及权重转换：是。对于蛋白质序列的快速成对比对，使用以下参数：字长：1；窗口大小：5；评分方法：年龄％；顶对角线数目：5；空位罚分：3。对于蛋白质序列的多重比对，使用以下参数：权重矩阵：blosum；空位开放罚分：10.0；空位延伸罚分：0.05；亲水空位：开；亲水残基：gly、pro、ser、asn、asp、gln、glu、arg和lys；残基特异性空位罚分：开。clustalw输出是反映序列之间关系的序列比对。例如，clustalw可以在万维网上的baylorcollegeofmedicinesearchlauncher网站(searchlauncher.bcm.tmc.edu/multi-align/multi-align.html)以及万维网上的欧洲生物信息学研究所网站(ebi.ac.uk/clustalw)上运行。
为了确定候选核酸或氨基酸序列与参考序列的同一性百分比，使用clustalw比对序列，将比对中的相同匹配的数量除以参考序列的长度，并将结果乘以100。要注意的是，可将同一性百分比值四舍五入至最接近的十分之一。例如，78.11、78.12、78.13和78.14四舍五入为78.1，而78.15、78.16、78.17、78.18和78.19四舍五入为78.2。
应当理解，功能ugt蛋白质(例如，能够使甜菊醇或甜菊醇糖苷在其c-19羧基处糖基化的多肽)可包括不参与由酶进行的酶活性的另外的氨基酸。在一些实施方案中，ugt蛋白是融合蛋白。术语“嵌合体”、“融合多肽”、“融合蛋白”、“融合酶”、“融合构建体”、“嵌合蛋白”、“嵌合多肽”、“嵌合构建体”和“嵌合酶”在本文中可互换地用于指通过连接两个或更多个编码不同蛋白质的基因而工程改造的蛋白质。在一些实施方案中，编码ugt多肽(例如，能够使甜菊醇或甜菊醇糖苷在其c-19羧基处糖基化的多肽)的核酸序列可包括编码被设计用于促进随后操作(例如，以便于纯化或检测)、分泌或编码的多肽的定位的“标签”的标签序列。可将标签序列插入编码多肽的核酸序列中，使得编码的标签位于多肽的羧基或氨基末端。编码标签的非限制性实例包括绿色荧光蛋白(gfp)、人流感血凝素(ha)、谷胱甘肽s转移酶(gst)、聚组氨酸-标签(his标签)和flagtm标签(kodak，newhaven，ct)。标签的其它实例包括叶绿体转运肽、线粒体转运肽、造粉体肽、信号肽或分泌标签。
在一些实施方案中，融合蛋白是通过结构域交换而改变的蛋白质。如本文中所用，术语“结构域交换”用于描述用第二种蛋白质的结构域置换第一种蛋白质的结构域的过程。在一些实施方案中，第一种蛋白质的结构域和第二种蛋白质的结构域功能相同或功能相似。在一些实施方案中，第二种蛋白质的结构域的结构和/或序列与第一种蛋白质的结构域的结构和/或序列不同。在一些实施方案中，通过结构域交换来改变ugt多肽(例如，能够使糖基化甜菊醇或甜菊醇糖苷在其c-19羧基处的多肽)。
在一些实施方案中，融合蛋白是通过环状变换(circularpermutation)改变的蛋白质，其包含随后可在其它地方打开的蛋白质末端的共价连接。因此，可改变序列的顺序而不引起蛋白质的氨基酸的变化。在一些实施方案中，可产生靶向环状变换，例如但不限于通过设计间隔子以连接原始蛋白质的末端。一旦确定了间隔子，则存在通过普遍接受的分子生物学技术(例如但不限于通过经由pcr产生多联体并随后扩增多联体内部的特定变换，或通过扩增蛋白质的分立片段以进行交换来以不同顺序连接它们)产生变换的几种可能性。产生变换的步骤之后可以是通过结合片段末端和随机重新切割产生环状基因，从而形成来自独特构建体的变换的集合。在一些实施方案中，ugt多肽(例如，能够使甜菊醇或甜菊醇糖苷在其c-19羧基处糖基化的多肽)通过环状变换来改变。
在一些实施方案中，能够使甜菊醇或甜菊醇糖苷在其c-19羧基处糖基化的多肽是ugt33942多肽。在一些实施方案中，能够使甜菊醇或甜菊醇糖苷在其c-19羧基处糖基化的多肽是ugt33786多肽。在一些实施方案中，ugt33942多肽包括与seqidno：2所示的氨基酸序列具有至少50％同一性的多肽。在一些实施方案中，ugt33786多肽包括与seqidno：119所示的氨基酸序列具有至少50％同一性的多肽。
甜菊醇和甜菊醇糖苷生物合成核酸
编码本文所述多肽的重组基因包含该多肽的编码序列，其与适于表达所述多肽的一个或多个调控区以有义方向可操作地连接。由于许多微生物能够从多顺反子mrna表达多种基因产物，因此如果需要，可在这些微生物的单一调控区的控制下表达多种多肽。当调控区和编码序列被定位成使得调控区能够有效地调节所述序列的转录或翻译时，认为该编码序列和调控区是可操作地连接的。通常，对于单顺反子基因，编码序列的翻译阅读框的翻译起始位点位于调控区下游1个至约50个核苷酸之间。
在许多情况下，本文所述的多肽的编码序列在除重组宿主外的物种中被鉴定，即其是异源核酸。因此，如果重组宿主是微生物，则编码序列可以来自其它原核或真核微生物、植物或动物。然而，在一些情况下，编码序列是对宿主天然的并且将被重新引入该生物体的序列。天然序列(nativesequence)与天然存在的序列(naturallyoccurringsequence)的区别通常在于存在与外源核酸连接的非天然序列，例如位于重组核酸构建体中天然序列侧翼的非天然调节序列。另外，稳定转化的外源核酸通常整合在不同于其中发现天然序列的位置的位置。“调控区”是指具有影响转录或翻译起始和速率以及转录或翻译产物的稳定性和/或移动性的核苷酸序列的核酸。调控区包括但不限于启动子序列、增强子序列、应答元件、蛋白质识别位点、诱导型元件、蛋白质结合序列、5′和3′非翻译区(utr)、转录起始位点、终止序列、多腺苷酸化序列、内含子及其组合。调控区通常包含至少一个核心(基础)启动子。调控区还可包括至少一个控制元件，诸如增强子序列、上游元件或上游激活区(uar)。通过将调控区与编码序列定位成使得调控区有效地调节序列的转录或翻译，来使得调控区与编码序列可操作地连接。例如，为了可操作地连接编码序列和启动子序列，编码序列的翻译阅读框的翻译起始位点通常定位于启动子下游1至约50个核苷酸之间。然而，调控区也可能被定位在翻译起始位点上游多达约5,000个核苷酸处，或者转录起始位点上游约2,000个核苷酸处。
对要包含的调控区的选择取决于若干因素，包括但不限于效率、可选择性、可诱导性、期望的表达水平和在某些培养阶段期间的优先表达。对本领域技术人员而言，通过相对于编码序列适当地选择和定位调控区来调节编码序列的表达是常规问题。应该理解，可存在不止一个调控区，例如内含子、增强子、上游激活区、转录终止子和诱导型元件。
可将一个或多个基因以“模块(module)”方式组合在重组核酸构建体中，用于甜菊醇和/或甜菊醇糖苷产生的一个独立方面。将多个基因组合在模块，特别是多顺反子模块中，便于在多种物种中使用所述模块。例如，可以以多顺反子模块组合甜菊醇生物合成基因簇或ugt基因簇，使得在插入合适的调控区后，可将模块引入至众多的物种中。作为另一个实例，可组合ugt基因簇，使得每个ugt编码序列可操作地连接至单独的调控区域，以形成ugt模块。此类模块可用于那些必须或期望单顺反子表达的物种中。除了对甜菊醇或甜菊醇糖苷产生有用的基因以外，重组构建体通常还含有复制起点和使构建体保持在合适的物种中的一种或多种可选择标记。
应理解，由于遗传密码的简并性，许多核酸可编码特定多肽；即，对于许多氨基酸，存在不止一个核苷酸三联体充当该氨基酸的密码子。因此，使用针对宿主(例如，微生物)的合适密码子偏向性表，可以将给定多肽的编码序列中的密码子进行修饰，从而获得在所述特定宿主中的最佳表达。作为经分离的核酸，这些经修饰的序列可以作为经纯化的分子存在，也可以被整合到载体或病毒中用于构建重组核酸构建体的模块。
在一些情况下，期望抑制内源多肽的一种或多种功能，以便使代谢中间体转向甜菊醇或甜菊醇糖苷生物合成。例如，可能需要下调酵母菌株中固醇的合成，以例如通过下调角鲨烯环氧化酶进一步增加甜菊醇或甜菊醇糖苷的产量。作为另一个实例，可能需要抑制某些内源基因产物(例如，从次级代谢物去除葡萄糖部分的糖水解酶或如本文所论述的磷酸酶)的降解功能。在此类情况下，可在转化入菌株的重组构建物中包含过表达多肽或基因产物的核酸。或者，可使用诱变来生成需要增加或增强其功能的基因的突变体。
宿主微生物
重组宿主可用于表达用于产生甜菊醇糖苷的多肽，其包括哺乳动物、昆虫、植物和藻类细胞。许多原核生物和真核生物也适用于构建本文所述的重组微生物，例如革兰阴性细菌、酵母和真菌。首先分析选择用作甜菊醇糖苷产生菌株的物种和菌株以确定哪些产生基因对于菌株是内源的以及哪些基因不存在。对于其内源对应物不存在于菌株中的基因，其有利地装配在一个或更多个重组构建体中，然后将其转化入菌株以提供缺失的功能。
通常，使重组微生物在发酵罐中在一定的温度下生长一段时间，其中温度和时间段有助于甜菊醇糖苷的产生。可使用常规发酵方法培养由本发明提供的构建的和基因工程改造的微生物，所述发酵方法，除其它以外，包括恒化器、分批、补料分批培养、半连续发酵诸如吸取和填充、连续灌流发酵和连续灌流细胞培养。根据该方法中使用的特定微生物，也可存在和表达其它重组基因诸如异戊烯基生物合成基因以及萜烯合酶和环化酶基因。可通过从培养基中提取样品以根据公开的方法进行分析来确定底物和中间体(例如异戊烯基二磷酸、二甲基烯丙基二磷酸、ggpp、内根-贝壳杉烯和内根-贝壳杉烯酸)的水平。
本方法中使用的碳源包括可被重组宿主细胞代谢以促进生长和/或甜菊醇糖苷产生的任何分子。合适的碳源的实例包括但不限于蔗糖(例如，如在糖蜜中发现的)、果糖、木糖、乙醇、甘油、葡萄糖、纤维素、淀粉、纤维二糖或其它含葡萄糖的聚合物。例如在采用酵母作为宿主的实施方案中，碳源诸如蔗糖、果糖、木糖、乙醇、甘油和葡萄糖是合适的。可在整个培养期间中向宿主生物体提供碳源，或者可选地，可使生物体在另一种能量来源(例如蛋白质)的存在下生长一段时间，然后仅在补料分批阶段为其提供碳源。
在培养物中使重组微生物生长一段时间后，其中温度和时间段有助于甜菊醇糖苷的产生，然后可使用本领域已知的各种技术从培养物中回收甜菊醇和/或一种或多种甜菊醇糖苷。在一些实施方案中，可加入透化剂以帮助原料进入宿主和产物离开。例如，可将培养的微生物的粗制裂解物离心以获得上清液。然后可将所得的上清液施加到色谱柱(例如，c-18柱)上，并用水洗涤以除去亲水性化合物，随后用溶剂(诸如甲醇)洗脱目标化合物。然后可通过制备hplc进一步纯化化合物。另见，wo2009/140394。
应当理解，本文论述的各种基因和模块可存在于两个或更多个重组宿主中而不是单个宿主中。当使用多种重组宿主时，可将它们在混合培养物中生长以积累甜菊醇和/或甜菊醇糖苷。
或者，可使两种或更多种宿主各自在单独的培养基中生长，并且可将第一培养基的产物例如甜菊醇引入第二培养基中以转化成随后的中间体或转化成终产品诸如，例如reba。然后回收由第二或最终宿主产生的产物。还应理解的是，在一些实施方案中，使用除培养基外的营养源并利用除发酵罐外的系统来使重组宿主生长。
下面更详细地描述示例性原核生物和真核生物物种。然而，应当理解，其它物种也是合适的。例如，合适的物种可属于诸如以下属的属：伞菌属(agaricus)、曲霉属(aspergillus)、芽孢杆菌属(bacillus)、念珠菌属(candida)、棒状杆菌属(corynebacterium)、假囊酵母属(eremothecium)、埃希氏菌属、镰刀菌属(fusarium)/赤霉菌属(gibberella)、克鲁维酵母属(kluyveromyces)、硫磺菌属(laetiporus)、香菇属(lentinus)、法夫酵母属(phaffia)、平革菌属(phanerochaete)、毕赤酵母属(pichia)、小立碗藓属(physcomitrella)、红酵母属(rhodoturula)、酵母属(saccharomyces)、裂殖酵母属(schizosaccharomyces)、痂圆孢属(sphaceloma)、红法夫酵母属(xanthophyllomyces)或耶氏酵母属(yarrowia)。来自此类属的示例性物种包括虎皮香菇(lentinustigrinus)、硫磺菌(laetiporussulphureus)、黄孢原毛平革菌(phanerochaetechrysosporium)、巴斯德毕赤氏酵母、产朊假丝酵母、小立碗藓(physcomitrellapatens)、粘红酵母(rhodoturulaglutinis)、胶红酵母(rhodoturulamucilaginosa)、红发夫酵母(phaffiarhodozyma)、红法夫酵母(schizosaccharomycesdendrorhous)、藤仓镰刀菌(fusariumfujikuroi)/藤仓赤霉菌(gibberellafujikuroi)、产朊假丝酵母菌(candidautilis)、光滑念珠菌(candidaglabrata)、白色念珠菌和解脂耶氏酵母。
在本文中另外描述的重组宿主的一些实施方案中，微生物可以是原核生物诸如埃希氏菌属细菌，例如大肠杆菌(escherichiacoli)细胞；乳杆菌属细菌细胞；乳球菌属细菌细胞；棒状杆菌属细菌细菌；醋酸杆菌属细菌细胞；不动杆菌属细菌细菌细胞；或假单胞菌属细菌细胞。
在本文中另外描述的重组宿主的一些实施方案中，微生物可以是子囊菌(ascomycete)，诸如藤仓赤霉菌、乳酸克鲁维酵母、粟酒裂殖酵母、黑曲霉(aspergillusniger)、解脂耶氏酵母、棉阿舒囊霉或酿酒酵母。
在本文另外描述的重组宿主的一些实施方案中，微生物可以是藻类细胞，诸如三孢布拉氏霉菌(blakesleatrispora)、盐生杜氏藻(dunaliellasalina)、雨生红球藻(haematococcuspluvialis)、小球藻属的某一个种(chlorellasp.)、裙带菜(undariapinnatifida)、马尾藻属(sargassum)、海带(laminariajaponica)、scenedesmusalmeriensis物种。
在本文中另外描述的重组宿主的一些实施方案中，微生物可以是蓝细菌(cyanobacterial)细胞，例如三孢布拉氏霉菌、盐生杜氏藻、雨生红球藻、小球藻的某一个种、裙带菜、马尾藻属、海带、scenedesmusalmeriensis。
酵母属的某些种
酵母属是合成生物学中广泛使用的底盘生物，并且可用作如本文中另外描述的重组宿主的重组微生物平台。例如，存在可用于酿酒酵母的突变体文库、质粒、代谢的详细计算机模型和其它信息，允许合理设计各种模块以提高产物产量。用于制备重组微生物的方法是已知的。
曲霉属的某些种
曲霉菌属的某些种诸如米曲霉(a.oryzae)、黑曲霉和酱油曲霉(a.sojae)是食品生产中广泛使用的微生物，并且也可以用如作本文中另外描述的重组宿主的重组微生物平台。构巢曲霉(a.nidulans)、烟曲霉(a.fumigatus)、米曲霉、棒曲霉(a.clavatus)、黄曲霉(a.flavus)、黑曲霉和土曲霉(a.terreus)的基因组的核苷酸序列是可获得的，从而允许合理设计和修饰内源途径以增加通量并增加产物产量。已开发了用于曲霉菌属的代谢模型，以及转录组学研究和蛋白质组学研究。黑曲霉被培养用于许多食品成分诸如柠檬酸和葡糖酸的工业生产，因此诸如黑曲霉等种通常适用于产生甜菊醇糖苷。
大肠杆菌
大肠杆菌，作为另一种广泛用于合成生物学的平台生物，也可以用作如本文中另外描述的重组宿主的重组微生物平台。与酵母属相似，大肠杆菌拥有可供使用的突变体文库、质粒、代谢的详细计算机模型和其它信息，从而允许合理设计各种模块以提高产物产量。类似于上述用于酵母属的方法可用于制备重组大肠杆菌微生物。
伞菌属、赤霉菌属和平革菌属的某些种
伞菌属、赤霉菌属和平革菌属的某些种是可用的，因为已知它们在培养物中产生大量类异戊二烯。因此，用于产生大量甜菊醇糖苷的萜烯前体已由内源基因产生。因此，可将包含甜菊醇糖苷生物合成多肽的重组基因的模块引入来自此类属的种中，而无需引入甲羟戊酸或mep途径基因。因此，伞菌属、赤霉菌属和平革菌属的某些种可用作如本文中另外描述的重组宿主的重组微生物平台。
解腺嘌呤阿氏酵母(blastobotrysadeninivorans)
解腺嘌呤阿氏酵母是具有独特的生物化学特征的二态酵母(其在高至42℃的温度下，生长为类似面包酵母的出芽酵母，高于该阈值，其以丝状形式生长)。其可在多种底物上生长，并且可以同化硝酸盐。其已被成功应用于产生可产生天然塑料的菌株，或者应用于开发用于环境样品中的雌激素的生物传感器。因此，解腺嘌呤阿氏酵母可用作如本文中另外描述的重组宿主的重组微生物平台。
解脂耶氏酵母
解脂耶氏酵母是二态酵母(参见解腺嘌呤阿氏酵母)并且属于半子囊菌科(hemiascomycetes)。解脂耶氏酵母的整个基因组是已知的。耶氏酵母属的种是需氧的并且被认为是非致病性的。耶氏酵母属在使用疏水性底物(例如烷烃、脂肪酸、油)方面是高效的，并且可以在糖上生长。其具有很高的工业应用潜力，是一种产油微生物。解脂耶氏酵母可将脂质含量积累至干细胞重量的约40％，并且是用于脂质积累和再动员的模式生物体。参见例如nicaud，2012，yeast29(10)：409-18；beopoulos等，2009，biochimie91(6)：692-6；bankar等，2009，applmicrobiolbiotechnol.84(5)：847-65。因此，解脂耶氏酵母可用作如本文中另外描述的重组宿主的重组微生物平台。
红酵母属的某一个种
红酵母属是单细胞的、含色素的酵母。已显示产油红酵母粘红酵母从粗甘油产生脂质和类胡萝卜素(saenge等，2011，processbiochemistry46(1)：210-8)。已显示圆红酵母(rhodotorulatoruloides)菌株是用于改善生物质和脂质产生力的高效补料分批发酵系统(li等，2007，enzymeandmicrobialtechnology41：312-7)。因此，红酵母属可用作如本文中另外描述的重组宿主的重组微生物平台。
圆红冬孢酵母
圆红冬孢酵母是产油酵母并且可用于工程改造脂质产生途径(参见例如zhu等，2013，naturecommun.3：1112；ageitos等，2011，appliedmicrobiologyandbiotechnology90(4)：1219-27)。因此，圆红冬孢酵母可用作如本文中另外描述的重组宿主的重组微生物平台。
博伊丁假丝酵母
博伊丁假丝酵母是甲基营养型酵母(其可以在甲醇上生长)。与其它甲基营养型物种诸如多形汉逊酵母和巴斯德毕赤酵母一样，其为产生异源蛋白质提供了极好的平台。已经报道了分泌型外源蛋白质在数克范围内的产率。最近，计算方法ipro预测了在实验上将博伊丁假丝酵母木糖还原酶的辅因子特异性从nadph转换为nadh的突变。参见例如mattanovich等，2012，methodsmolbiol.824：329-58；khoury等，2009，proteinsci.18(10)：2125-38。因此，博伊丁假丝酵母可用作如本文中另外描述的重组宿主的重组微生物平台。
多形汉逊酵母(安格斯毕赤酵母(pichiaangusta))
多形汉逊酵母是甲基营养型酵母(参见博伊丁假丝酵母)。其还可在多种其它底物上生长；其是耐热的，并且可同化硝酸盐(另见乳酸克鲁维酵母)。其已被应用于生产乙型肝炎疫苗、胰岛素和干扰素α-2a(用于治疗丙型肝炎)，还用于一系列技术酶。参见，例如xu等，2014，virolsin.29(6)：403-9。因此，多形汉逊酵母可用作如本文中另外描述的重组宿主的重组微生物平台。
乳酸克鲁维酵母
乳酸克鲁维酵母是常规地应用于生产开菲尔(kefir)的酵母。其可在数种糖上生长，最重要地在存在于牛奶和乳清中的乳糖上生长。其已被成功地应用于，除其它以外，生产凝乳酶(一种通常存在于小牛胃中的酶)以生产奶酪。生产以40,000l规模在发酵罐中进行。参见，例如，vanooyen等，2006，femsyeastres.6(3)：381-92。因此，乳酸克鲁维酵母可用作如本文中另外描述的重组宿主的重组微生物平台。
巴斯德毕赤酵母
巴斯德毕赤酵母是甲基营养型酵母(参见博伊丁假丝酵母和多形汉逊酵母)。其为产生外源蛋白质提供了高效平台。平台元件可作为试剂盒提供，并且其在全球范围内在学术界中用于产生蛋白质。已将菌株工程改造成可产生复杂的人n-聚糖(酵母聚糖与人中发现的类似，但不相同)。参见，例如piirainen等，2014，nbiotechnol.31(6)：532-7。因此，巴斯德毕赤酵母可以用作如本文中另外描述的重组宿主的重组微生物平台。
小立宛藓属的多个种
小立碗藓苔藓(physcomitrellamosses)在悬浮培养物中生长时具有与酵母或其它真菌培养物类似的特征。该属可用于产生可能难以在其它类型的细胞中产生的植物次生代谢产物。因此，小立碗藓苔藓可用作如本文中另外描述的重组宿主的重组微生物平台。
甜菊醇糖苷组合物
甜菊醇糖苷在不同的食物体系中不一定具有等同的性能。因此希望具有将合成导向选择的甜菊醇糖苷组合物的能力。本文所述的重组宿主可产生选择性富集特定甜菊醇糖苷(例如，19-smg、rebd或rebm)并具有一致的味道特征的组合物。如本文中所用，术语“富集”用于描述与来自甜叶菊植物的甜菊醇糖苷组合物(提取物)相比具有增加的比例的特定甜菊醇糖苷的甜菊醇糖苷组合物。因此，本文所述的重组宿主可促进这样的组合物的产生，所述组合物被定制来满足给定食品所需的甜味特性，并且每批之间具有每种甜菊醇糖苷的一致比例。在一些实施方案中，本文所述的宿主不产生或产生减少量的在甜叶菊提取物中发现的不希望的源自植物的组分。因此，由本文所述的重组宿主产生的甜菊醇糖苷组合物与源自甜叶菊植物的组合物是可区分的。
累积的单种甜菊醇糖苷(例如，reba、rebb、rebd或rebm)的量可以为约1至约7,000mg/l，例如，约1至约10mg/l、约3至约10mg/l、约5至约20mg/l、约10至约50mg/l、约10至约100mg/l、约25至约500mg/l、约100至约1,500mg/l，或约200至约1,000mg/l、至少约1,000mg/l、至少约1,200mg/l、至少约至少1,400mg/l、至少约1,600mg/l、至少约1,800mg/l、至少约2,800mg/l，或至少约7,000mg/l。在某些方面，单种甜菊醇糖苷的量可超过7000mg/l。甜菊醇糖苷(例如，reba、rebb、rebd或rebm)的组合的累积量可以为约1mg/l至约7,000mg/l，例如约200至约1,500、至少约2,000mg/l、至少约3,000mg/l、至少约4,000mg/l、至少约5,000mg/l、至少约6,000mg/l或至少约7,000mg/l。在一些方面，甜菊醇糖苷的组合的量可超过7000mg/l。一般来说，较长的培养时间将导致更大量的产物。因此，可将重组微生物培养1天至7天、1天至5天、3天至5天、约3天、约4天或约5天。
应当理解，本文讨论的各种基因和模块可存在于两种或更多种重组微生物中而不是单一微生物中。当使用多种重组微生物时，可使它们在混合培养物中生长以产生甜菊醇和/或甜菊醇糖苷。例如，第一微生物可包含一种或多种用于产生甜菊醇糖苷前体的生物合成基因，而第二微生物包含甜菊醇糖苷生物合成基因。然后回收第二或终微生物产生的产物。还应理解，在一些实施方案中，使用除培养基外的营养源并利用除发酵罐外的系统使重组微生物生长。
或者，可使两种或更多种微生物各自在单独的培养基中生长并且可将第一培养基的产物例如甜菊醇引入至第二培养基中以转化成随后的中间体或转化成终产物诸如reba。然后回收第二或终微生物产生的产物。还应理解的是，在一些实施方案中，使用除培养基外的营养源并利用除发酵罐外的系统来使重组微生物生长。
可将通过本文公开的方法获得的甜菊醇糖苷和组合物用于制备食品、膳食补充剂和甜味剂组合物。参见，例如wo2011/153378、wo2013/022989、wo2014/122227和wo2014/122328。这些出版物在此通过引用整体并入本文。
例如，可将基本上纯的甜菊醇或甜菊醇糖苷诸如rebm或rebd包含在食品诸如冰淇淋、碳酸饮料、果汁、酸奶、烘焙食品、口香糖、硬糖和软糖以及调味汁中。还可将基本上纯的甜菊醇或甜菊醇糖苷包含在非食品产品诸如药品、医药产品、膳食补充剂和营养补充剂中。还可将基本上纯的甜菊醇或甜菊醇糖苷包含在用于农业产业和伴侣动物产业的动物饲料产品中。或者，可通过分别培养重组微生物(每种微生物产生特定的甜菊醇或甜菊醇糖苷)，从每种微生物中回收基本上纯的甜菊醇糖醇或甜菊醇糖苷，然后将化合物组合以获得包含所需比例的每种化合物的混合物来制备甜菊醇糖醇和/或甜菊醇糖苷的混合物。与目前的甜叶菊产品相比，本文所述的重组微生物允许获得更精确和一致的混合物。
在另一种替代方案中，可将基本上纯的甜菊醇或甜菊醇糖苷与其它甜味剂(例如糖精、右旋糖、蔗糖、果糖、赤藓糖醇、阿斯巴甜、三氯蔗糖、莫纳甜或乙酰磺胺酸钾)一起掺入食品中。甜菊醇或甜菊醇糖苷相对于其它甜味剂的重量比可根据需要改变，以在最终食品中获得令人满意的味道。参见，例如，u.s.2007/0128311。在一些实施方案中，可将甜菊醇或甜菊醇糖苷与风味剂(例如柑橘)一起提供，以作为风味调节剂。
可将由本文所述的重组微生物产生的组合物掺入食物产品中。例如，取决于甜菊醇糖苷和食品的类型，可将由重组微生物产生的甜菊醇糖苷组合物基于按干重以约20mg甜菊醇糖苷/kg的食品至约1800mg甜菊醇糖苷/kg的食品的量掺入食品中。例如，可将由重组微生物产生的甜菊醇糖苷组合物掺入甜食、冷的糖食(例如，冰淇淋)、乳制品(例如，酸奶)或饮料(例如，碳酸饮料)中，使得食品基于干重具有最多500mg甜味醇糖苷/kg食物。可将由重组微生物产生的甜菊醇糖苷组合物掺入烘焙食品(例如，饼干)中，使得食品基于干重具有最多300mg甜菊醇糖苷/kg食物。可将由重组微生物产生的甜菊醇糖苷组合物掺入酱汁(例如，巧克力糖酱)或蔬菜产品(例如，泡菜)中，使得食品基于干重具有最多1000mg甜菊醇糖苷/kg食物。可将由重组微生物产生的甜菊醇糖苷组合物掺入面包中，使得食品基于干重具有最多160mg甜菊醇糖苷/kg食物。可将由重组微生物、植物或植物细胞产生的甜菊醇糖苷组合物掺入硬糖或软糖中，使得食品基于干重具有最多1600mg甜菊醇糖苷/kg食物。可将由重组微生物、植物或植物细胞产生的甜菊醇糖苷组合物掺入加工的水果产品(例如果汁、水果馅、果酱和果冻)中，使得食品基于干重具有最多1000mg甜菊醇糖苷/kg食物。在一些实施方案中，本文中产生的甜菊醇糖苷组合物是药物组合物的组分。参见，例如，steviolglycosideschemicalandtechnicalassessment69thjecfa，2007，由harrietwallin，foodagric.org.筹备的；efsapanelonfoodadditivesandnutrientsourcesaddedtofood(ans)，“scientificopiniononthesafetyofsteviolglycosidesfortheproposedusesasafoodadditive，”2010，efsajournal8(4)：1537；美国食品药物管理局gras通告323；美国食品药物管理局gras通告329；wo2011/037959；wo2010/146463；wo2011/046423和wo2011/056834。
例如，此类甜菊醇糖糖组合物相对于源自植物的甜叶菊提取物可具有90-99重量％的reba和不可检测量的源自甜叶菊植物的组分，并且基于干重以25-1600mg/kg，例如，100-500mg/kg、25-100mg/kg、250-1000mg/kg、50-500mg/kg或500-1000mg/kg掺入食品中。
此类甜菊醇糖苷组合物可以是富含rebb的组合物，其具有大于3重量％的rebb，并且被掺入至食品中，使得产品中rebb的量基于干重为25-1600mg/kg，例如，100-500mg/kg、25-100mg/kg、250-1000mg/kg、50-500mg/kg或500-1000mg/kg。通常，富含rebb的组合物相对于源自植物的甜叶菊提取物，具有不可检测量的源自甜叶菊植物的组分。
此类甜菊醇糖苷组合物可以是富含rebd的组合物，其具有大于3重量％的rebd，并且被掺入到食品中，使得产品中rebd的量基于干重为25-1600mg/kg，例如，100-500mg/kg、25-100mg/kg、250-1000mg/kg、50-500mg/kg或500-1000mg/kg。通常，富含rebd的组合物相对于源自植物的甜叶菊提取物，具有不可检测量的源自甜叶菊植物的组分。
此类甜菊醇糖苷组合物可以是富含rebe的组合物，其具有大于3重量％的rebe并且被掺入至食品中，使得产品中rebe的量基于干重为25-1600mg/kg，例如，100-500mg/kg、25-100mg/kg、250-1000mg/kg、50-500mg/kg或500-1000mg/kg。通常，富含rebe的组合物相对于源自植物的甜叶菊提取物，具有不可检测量的源自甜叶菊植物的组分。
此类甜菊醇糖苷组合物可以是富含rebm的组合物，其具有大于3重量％的rebm并且被掺入至食品中，使得产品中rebm的量基于干重为25-1600mg/kg，例如，100-500mg/kg、25-100mg/kg、250-1000mg/kg、50-500mg/kg或500-1000mg/kg。通常，富含rebm的组合物相对于源自植物的甜叶菊提取物，具有不可检测量的源自甜叶菊植物的组分。
在一些实施方案中，将基本上纯的甜菊醇或甜菊醇糖苷掺入佐餐甜味剂或“杯饮(cup-for-cup)”产品中。此类产品通常用本领域技术人员已知的一种或多种填充剂(例如，麦芽糖糊精)稀释至适当的甜度水平。可将富含reba、rebb、rebd、rebe或rebm的甜菊醇糖苷组合物例如基于干重以10,000至30,000mg甜菊醇糖苷/kg产品包装于例如小袋中，用于佐餐使用。在一些实施方案中，在体外、体内或通过全细胞生物转化产生甜菊醇糖苷。
将在以下实施例中进一步描述本发明，所述实施例不限制权利要求中描述的本发明的范围。
实施例
下面的实施例是本发明的具体实施方案及其各种用途的说明。它们仅仅是为了解释的目的而提出的，并不被视为限制本发明。
实施例1.包含ugt33942的酿酒酵母菌株的工程改造
在酿酒酵母菌株中克隆和过表达ugt33942。使用ugt33942表达质粒转化的酿酒酵母菌株在缺乏尿嘧啶的合成完全培养基(sc培养基)中生长24小时以选择在30℃存在于其中的质粒。生长24小时后，将甜菊醇加入至培养物中至最终浓度为40μm。在添加甜菊醇后24小时，通过将1体积的培养物与1体积的dmso混合，将它们于80℃放置10分钟，并在eppendorff离心机5415d中以最大速度离心，来制备用于lc-ms的样品。然后将所得上清液的等分试样转移到新的小瓶中并进行lc-ms分析。
在与watersacquityesi(电喷雾电离)-tqd三重四极杆质谱仪联接的watersacquityuplc(waterscorporation，milford，ma)上进行lc-ms分析。在配备有acquityuplcbehc18vanguard前置柱(
测定了过表达ugt33942的酿酒酵母菌株和包含空载体的对照酿酒酵母菌株的对应于甜菊醇和19-smg的lc-ms衍生峰的曲线下面积(auc)值。结果示于图3中。供给过表达ugt33942的酿酒酵母菌株的大部分甜菊醇转化为19-smg，而对照酵母菌株没有转化供给的甜菊醇。因此，ugt33942使甜菊醇在19-o-位上葡糖基化，引起19-smg产生。在甜叶菊中，ugt74g家族的ugt催化19-o糖基化；然而，ugt33942是与ugt85家族的成员具有高结构相似性的ugt多肽。ugt33942的活性令人惊讶且出人意料，因为ugt85家族的成员先前未被表征为具有显著的19-o糖基化活性。
实施例2.包含ugt33786的酿酒酵母菌株的工程改造
在酿酒酵母菌株中克隆和过表达ugt33786。使用ugt33786表达质粒转化的酿酒酵母菌株在缺乏尿嘧啶的合成完全培养基(sc培养基)中生长24小时，以选择存在于其中的质粒并在30℃保持质粒。生长24小时后，将甜菊醇加入至培养物中至最终浓度为40μm。在添加甜菊醇后24小时，通过将1体积的培养物与1体积的dmso混合，将它们于80℃放置10分钟，并在eppendorff离心机5415d中以最大速度离心，来制备用于lc-ms的样品。然后将所得上清液的等分试样转移至新的小瓶中并进行lc-ms分析。
根据实施例1中描述的方法进行lc-ms分析。测定了过表达ugt33786的酿酒酵母菌株和包含空载体的对照酿酒酵母菌株的对应于甜菊醇和19-smg的lc-ms衍生峰的曲线下面积(auc)值。结果示于图4中。供给过表达ugt33786的酿酒酵母菌株的部分甜菊醇转化为19-smg，而对照酵母菌株没有转化供给的甜菊醇。因此，ugt33786使甜菊醇在19-o-位上葡糖基化，引起19-smg产生。至于ugt33944，ugt33786是与ugt85家族的成员具有高度结构相似性的ugt多肽。因此，ugt33944的19-o糖基化活性也令人惊讶且出人意料。
已经详细描述了本发明并且通过参考其具体实施方案，显而易见的是，在不背离所附权利要求限定的本发明的范围的情况下，可能进行修改和变化。更具体地，虽然本发明的一些方面在本文中被认为是特别有利的，但是可以预期，本发明不一定限于本发明的这些特定方面。
表1.本文公开的序列