本发明提供了来自土壤宏基因组的新型内切葡聚糖酶基因(gh5家族)。更具体而言，本发明提供了重组质粒和用于表达具有纤维素酶活性的新型基因序列的重组宿主。本发明的纤维素酶对底物如羧甲基纤维素和大麦-β-葡聚糖等中的β-1,4键具有高比活性。这种新型纤维素酶可具有许多工业应用，例如，食品和饲料工业、洗涤剂、纺织和生物燃料工业等。
背景技术：
一方面需求的不断增加和另一方面化石燃料作为能源的日益枯竭已使得开发替代能源成为必要。使用天然丰富的木质纤维素生物质如农业废弃物、林业废弃物和城市废弃物生产可再生生物燃料将减小社会对化石燃料的依赖。纤维素是木质纤维素的主要组分，已经在很大程度上认识到对新型且高效的纤维素酶的需要(xing等,2012)。
纤维素酶可用于各种各样的工业应用中，如用于造纸工业中以使再生纸脱墨，用于纺织工业以使织物生物抛光和降低棉布的粗糙度，用于洗衣业作为洗涤剂的添加剂，用于食品和饲料工业以改善食物的可消化性，用于酿造工业和农业以实现作物的生物加工，及用于许多其他应用(bhat,2000；xing等,2012)。
纤维素酶属于酶的糖基水解酶家族，其以协同方式催化纤维素水解。内切葡聚糖酶(ec3.2.1.4)随机切割内部1,4-β-d-葡聚糖键，产生游离的末端。外切葡聚糖酶(ec3.2.1.91和3.2.1.176)逐步作用于还原性和非还原性末端以释放纤维二糖。所产生的二糖然后由β-葡糖苷酶(ec3.2.1.21)消化以释放游离的葡萄糖。这些酶协同作用而导致纤维素水解(aubert等,1988；lynd等,2002)。
内切葡聚糖酶是引发和导致内部键的广泛水解的主要的酶。根据碳水化合物活性酶数据库(http://www.cazy.org/)(lombard等,2014)的分类，内切葡聚糖酶属于糖基水解酶家族的14个家族。
发现新型纤维素酶的方法之一是通过宏基因组学，宏基因组学是研究微生物多样性和探索具有工业重要性的新型酶的独立于培养的方法(handelsman,2004；zengler等,2002)。
在各种自然环境中，土壤就其中存在的微生物区系而言是最具多样性和挑战性的(daniel,2005)。已从土壤宏基因组学发现了许多新型的工业相关酶，如纤维素酶、淀粉酶、脂肪酶、蛋白酶、木聚糖酶等(daniel,2005；xing等,2012)。这些酶中的若干在活性、特异性、稳定性等方面具有远优于已知酶的性质。
许多纤维素酶已从宏基因组研究中获得，其具有显著的性质，如热稳定性、盐稳定性、ph稳定性。作为实例，已从奶牛的瘤胃液分离出新型宏基因组gh5纤维素酶，其对广泛的底物具有活性(ko等,2013)。已从甘蔗渣分离出在75℃下具有最佳活性的嗜热gh9内切葡聚糖酶(kanokratana等,2014)。从叶枝堆肥分离出的宏基因组衍生gh12纤维素酶具有90℃的最适温度(okano等,2014)。从牛的瘤胃分离出的纤维素酶对作为底物的cmc具有在6-70u/mg范围内的比活性(ferrer等,2008)。与具有工业相关性的更新型的蛋白质相关的这样的性质对于收获生物质作为可负担且绿色的能源这一充分和成功的目标来说是极其需要的。
因此，本发明的目的在于提供纤维素酶，其在高温下在宽ph范围内具有活性，对一系列化学和物理条件具有广泛的稳定性和耐受性，在盐和化学品等的存在下具有高活性。
附图说明
图1：来自质粒文库的阳性克隆的测序揭示了由多个开放阅读框组成的5553个碱基的基因簇。
其说明了从宏基因组文库分离出的宏基因组克隆的完整重叠群，示出了不同的开放阅读框(orf)的存在。
图2：该示意图示出了纤维素酶基因和含有该纤维素酶基因的重组载体。
其说明了具有n-端6x-his-标签的pet15(b)载体中新基因seqidno:1的克隆的示意。
图3：10％sds凝胶，显示通过ni-nta和superdex-75凝胶过滤层析，纤维素酶基因在大肠杆菌rosettade3细胞中的表达和纯化谱。
其说明了内切葡聚糖酶的表达和纯化谱。(a)显示表达的和ni-nta纯化的内切葡聚糖酶的10％sds-page。泳道1：蛋白质分子量标记物；泳道2：含有pet15(b)-cel5r的未诱导大肠杆菌bl21(de3)rosetta细胞的粗细胞裂解物；泳道3：经1mmiptg诱导的含有pet15(b)-cel5r的大肠杆菌bl21(de3)rosetta细胞的粗裂解物；泳道4：离心后来自细胞裂解物的上清液，加载在ni-nta珠上；泳道5：流通物(flowthrough)；泳道6：用30mm咪唑洗涤；泳道7：用在还原性条件下流动的300mm咪唑洗脱；染料；泳道8：用在非还原性条件下流动的300mm咪唑洗脱。(b)在superdex-75(16/60)上的凝胶过滤的10％sds-page谱。泳道1：ni+2-nta纯化蛋白质；泳道2：在还原性条件下的峰-1；泳道3：在还原性条件下的峰-2；泳道4：蛋白分子量标记物；泳道5：在非还原性条件下的峰-1；泳道6：在非还原性条件下的峰-2。(c)superdex-75凝胶过滤层析谱，以箭头显示峰1和峰2。(d)平板cmc酶谱(0.5％琼脂糖+0.5％cmc)，显示纤维素酶活性条带。
图4a：新型纤维素酶多肽的最适温度，在58℃下显示最大活性。
其说明了重组内切葡聚糖酶活性的最适温度的确定。在所示温度下于ph6.0(柠檬酸钠缓冲液)下测量活性15分钟。
图4b：纤维素酶活性的最适ph曲线，在ph-6柠檬酸钠缓冲液下显示最大活性。
其说明了重组内切葡聚糖酶活性的最适ph的确定。酶测定在所示ph下于58℃下进行15分钟。
图4c：描绘纤维素酶在不同温度(4、25、50、55℃)下的稳定性的图。其说明了重组内切葡聚糖酶的热稳定性。在于指定温度下将酶温育不同的时间间隔后在最适条件(ph6.0的柠檬酸钠缓冲液、58℃、15分钟)下测量活性。
图4d：曲线示出在25℃下温育7天后纤维素酶在不同ph下的稳定性。
其说明了重组内切葡聚糖酶的ph稳定性。在经纯化的酶在缓冲液(0.1m柠檬酸钠缓冲液，ph4.0-6.0；0.1mtris-hcl缓冲液，ph7.0-8.0；0.1m甘氨酸-naoh缓冲液，ph9-10.0)中于25℃下温育168小时后在最适条件(ph6.0的柠檬酸钠缓冲液、58℃、15分钟)下测量活性。
图4e：曲线示出当纤维素酶多肽在0.2％cmc底物的存在下温育时与不存在该底物相比在58℃下的稳定性。
其说明了在0.2％cmc的存在下与不存在底物相比在58℃下的相对热稳定性。在将酶温育不同的时间间隔后于最适条件(ph6.0的柠檬酸钠缓冲液、58℃、15分钟)下测量活性。
图5a：在不同的盐、有机溶剂和洗涤剂的存在下的纤维素酶活性。其说明了在反应中在1mm浓度的各种金属离子、5％浓度的有机溶剂和0.25％的洗涤剂的存在下重组内切葡聚糖酶的相对活性。在最适条件(ph6.0的柠檬酸钠缓冲液、58℃、15分钟)下测量活性。
图6a：示出酶在不同盐如nacl、kcl、licl的存在下的活化的图。
其示出了不同浓度的离子盐(nacl、licl、kcl)对重组内切葡聚糖酶活性的相对影响。
图6b：描绘纤维素酶在不同盐的存在下温育30天的稳定性的图。
其说明了内切葡聚糖酶在各种盐中温育的残余相对活性，指示出耐盐性。在于25℃下孵育30天后在最适条件(ph6.0的柠檬酸钠缓冲液、58℃、15分钟)下测量活性。
发明目的
本发明的主要目的在于提供一种具有纤维素酶活性的具有seqidno:3和seqidno:31-45的新型宏基因组衍生核苷酸序列。
本发明的另一个目的在于提供具有seqidno:2的氨基酸序列，该序列由具有上游疏水区的具有核苷酸seqidno:1的基因编码。
本发明的另一个方面在于提供一种与多核苷酸seqidno:1具有至少85％同一性的多核苷酸。
本发明的另一个方面在于提供一种与多肽seqidno:2具有至少85％同一性的多肽。
本发明的一个目的在于提供含有来自宏基因组文库的新型基因的重组载体。
本发明的还一个方面提供了一种编码与多核苷酸序列seqidno:1具有至少85％同一性的多核苷酸的表达载体。
本发明的还一个方面提供了一种编码与多肽序列seqidno:2具有至少85％同一性的多肽的表达载体。
本发明的再一个目的在于提供含有表达具有seqidno:1的新型基因的重组载体的重组宿主。
本发明的另一个目的在于提供一种在大肠杆菌中从具有seqidno:1的宏基因组衍生基因表达多肽的方法。
本发明的另一个目的在于提供截短基因序列及分别通过删除具有seqidno:2的多肽的n-端区域所获得的具有seqidno:3和seqidno:4的相应多肽。
本发明的目的在于提供通过定点诱变获得的seqidno:3的功能性衍生物的核苷酸序列，命名为seqidno:31至seqidno:45。
本发明的目的在于提供通过定点诱变获得的具有seqidno:4的多肽序列的功能性衍生物，其表达活性且稳定的纤维素酶蛋白质且命名为seqidno5至seqidno19。
本发明的又一个目的在于提供一种从重组宿主制备活性酶的方法。
本发明的另一个目的在于提供从表达宿主纯化和重折叠生物活性纤维素酶蛋白质的方法。
本发明的另一个目的在于提供基因序列和具有一个或多个氨基酸突变的相应多肽及其表达活性酶形式的重组载体和宿主。
技术实现要素：
因此，本发明提供了具有纤维素酶活性的具有seqidno:1、seqidno:3和seqidno:31-45的新型宏基因组衍生核苷酸序列。
在一个实施方式中，本发明提供了相应的多肽序列，其选自seqidno:2、seqidno:4和seqidno:5-19。
在一个实施方式中，本发明提供了包含核苷酸序列idno.3的重组载体，其中所述载体选自大肠杆菌表达载体、酵母表达载体、丝状真菌表达载体和昆虫或动物细胞载体。
在一个实施方式中，本发明提供了多肽，其中所述多肽对选自羧甲基纤维素和大麦-β-葡聚糖的底物中的β-1,4键具有高比活性。
在另一个实施方式中，本发明提供了表达载体，其中所述表达载体包含与选自seqidno:1、seqidno:3和seqidno:31-45的多核苷酸序列具有至少85％同一性的多核苷酸。
在一个实施方式中，本发明提供了表达载体，其中所述表达载体编码与选自seqidno:4、seqidno:5、seqidno:6、seqidno:7、seqidno:8、seqidno:9、seqidno:10、seqidno:11、seqidno:12、seqidno:13、seqidno:14、seqidno:15、seqidno:16、seqidno:17、seqidno:18和seqidno:19的多肽序列具有至少85％同一性的多肽。
在一个实施方式中，本发明提供了表达重组载体的宿主细胞，其中所述宿主细胞选自大肠杆菌、酵母细胞、枯草芽孢杆菌、黑曲霉和昆虫或动物宿主。
在一个实施方式中，本发明提供了一种制备具有选自seqidno:2、4和5-19的氨基酸序列的宏基因组衍生多肽的方法，其包括以下步骤：
a.分离土壤宏基因组dna；
b.构建步骤(a)中获得的宏基因组dna的文库；
c.使用0.5％cmc作为底物筛选步骤(b)中获得的文库中具有内切葡聚糖酶活性的阳性克隆；
d.对步骤(c)中获得的阳性克隆测序以识别编码具有seqidno:1的纤维素酶基因的orf；
e.使用具有seqidno:20和seqidno:21的引物对步骤(d)中识别的编码纤维素酶基因的orf进行pcr以扩增所述基因片段；
f.将步骤(e)中获得的扩增的基因片段克隆到重组载体pet15b-cel5r中；
g.将步骤(f)的重组载体转化到表达宿主bl21-de3中；
h.使用具有seqidno:20、seqidno:22的引物重复步骤(e)至(g)以获得具有seqidno:3的截短基因序列和具有seqidno:4的相应的多肽；
i.使用具有seqidno:23至30的引物对具有seqidno:4的多肽进行半胱氨酸至丙氨酸的突变，以获得具有seqidno:31-45的扩增的突变dna片段；
j.通过测序确认步骤(i)中获得的突变dna的序列；
k.将步骤(i)的突变dna分离、克隆并转化到rosetta(bl21)细胞中；
l.在10％sds上检查含有突变多肽的克隆的表达；
m.通过使用不同层析的组合纯化步骤(1)中获得的表达的变体多肽至均一以获得蛋白质产物。
在一个实施方式中，本发明提供了多肽用于减小烘焙工业中β-葡聚糖的量的用途。
在一个实施方式中，本发明提供了多肽用于提高食品和饲料工业中饲料的可消化性的用途。
在一个实施方式中，本发明提供了多肽用于降低纺织工业中织物的粗糙度的用途。
本发明提供了具有编码纤维素酶基因的核酸的seqidno:2的氨基酸序列，其中所述纤维素酶基因具有seqidno:1，属于糖基水解酶家族5，并具有内切葡聚糖酶活性。本发明还提供了具有seqidno:1的原始序列的截短和修饰衍生物，其获自原始序列但由seqidno:3表现出高的纤维素酶活性。
本发明提供了表达高活性内切葡聚糖酶基因的具有seqidno:4的截短纤维素酶基因的多肽序列。
另一个实施方式是提供具有seqidno:3的核苷酸序列及其具有seqidno:31至seqidno:45的突变衍生物。
本发明还提供了具有seqidno:5、seqidno:6、seqidno:7、seqidno:8、seqidno:9、seqidno:10、seqidno:11、seqidno:12、seqidno:13、seqidno:14、seqidno:15、seqidno:16、seqidno:17、seqidno:18、seqidno:19的多肽序列，其通过取代来自seqidno:4的一个或多个氨基酸获得。
本发明还提供了一种编码与多核苷酸序列seqidno:1和seqidno:3具有至少85％同一性的多核苷酸的表达载体。
本发明还提供了一种编码与多肽序列seqidno:2和seqidno:4具有至少85％同一性的多肽的表达载体。
本发明提供了表达具有seqidno:1、seqidno:3的纤维素酶基因的重组载体和重组微生物，其具有和不具有辅助纯化的n-端或c-端6x-his标签。
本发明还提供了一种增强携带具有基因seqidno:1、seqidno:3的纤维素酶基因的重组宿主表达纤维素酶基因的方法。
本发明还提供了一种优化含有基因seqidno:3的重组宿主表达的蛋白质的重折叠的方法。
本发明还提供了一种从表达具有多肽序列seqidno:4、seqidno:5、seqidno:6、seqidno:7、seqidno:8、seqidno:9、seqidno:10、seqidno:11、seqidno:12、seqidno:13、seqidno:14、seqidno:15、seqidno:16、seqidno:17、seqidno:18、seqidno:19的纤维素酶基因的重组微生物获得均质纤维素酶蛋白质的方法。
本发明还提供了一种表现出高最适温度、宽ph范围、极端温度和ph稳定性的新型纤维素酶基因及其功能性衍生物。
在一个方面，本发明的酶在盐的存在下也表现出增强的活性，并且在高浓度盐的存在下也非常稳定。在另一个方面，本发明的酶具有内切葡聚糖酶活性，其被用于从多糖如羧甲基纤维素中的1,4-β-和1,3-β-葡糖苷键及大麦-β-葡聚糖键产生葡聚糖。
在另一个方面，纤维素酶可用于烘焙工业中以减少β-葡聚糖的量，用于食品和饲料工业以提高饲料的可消化性，用于纺织工业中以降低织物的粗糙度，以及用于各种其他工业应用。
具体实施方式
本发明基于的是衍生自生态系统的最具多样性和多功能性的栖息地之一、更优选来自森林的土壤栖息地的具有seqidno:1的新型基因序列的发现。
在本发明中，使用市售ultracleantm和powermaxtm试剂盒(mobiolaboratoriesinc.,carlsbad,ca,usa)，遵循从从imtech森林土壤分离的dna构建质粒宏基因组文库的程序。在ecori和hindiii限制性位点之间将土壤dna克隆到pezseq载体中。在补充有0.5％羧甲基纤维素的luria-bertani琼脂平板上筛选克隆并使用刚果红染料染色。
在本发明中，对显示出纤维素酶活性的阳性克隆进行测序。然后对尺寸为1017bp的新型orf之一进行亚克隆。在本发明中，orf编码338个氨基酸的多肽，其如通过国家生物技术信息中心blastp搜索所见，与已经存在的纤维素酶仅具有约65％的同一性(ncbi；http://www.ncbi.nlm.nih.gov)。
本发明示出了具有改善的性质的新纤维素酶。因此，本发明在其第一个实施方式中涉及具有有着seqidno:2的氨基酸序列的多肽及其具有seqidno:4的功能性多肽，其通过从seqidno:2截短n-端疏水片获得。
另一个实施方式是提供具有seqidno:3的核苷酸序列及其具有seqidno:31至seqidno:45的突变衍生物。
另一个实施方式是提供具有有着seqidno:4的氨基酸序列的生物活性多肽及其具有seqidno:5、seqidno:6、seqidno:7、seqidno:8、seqidno:9、seqidno:10、seqidno:11、seqidno:12、seqidno:13、seqidno:14、seqidno:15、seqidno:16、seqidno:17、seqidno:18、seqidno:19的功能性衍生物，并具有n-端和c-端6xhis-标签序列以辅助简便而高效的纯化。
另一个目的在于提供一种制备通过截短上游疏水区seqidno:4获得的多肽的功能形式的方法，所述功能形式比具有seqidno:2的多肽表现出更高的活性和稳定性。
本发明的还另一个目的在于提供制备半胱氨酸变体的方法，其通过对多肽seqidno:4中的非保守半胱氨酸和其他非保守氨基酸进行定点诱变获得。
本发明的还另一个目的在于提供一种生产纯净且生物活性形式的活性多肽及其半胱氨酸变体的方法。
还另一个目的在于提供突变体纤维素酶多肽，其中半胱氨酸在对应于具有seqidno:4的纤维素酶的截短多肽的位置处被丙氨酸或其他合适的氨基酸所替换。所述位置可以是cys64、cys89、cys230或cys272，其中所述突变体多肽也是生物活性的。
还另一个目的在于提供突变体纤维素酶多肽，其中至少两个半胱氨酸在对应于具有seqidno:4的纤维素酶的天然多肽的不同位置处被丙氨酸或其他合适的氨基酸所替换。所述位置可以是cys64、cys89、cys230或cys272的组合，其中所述突变体多肽具有活性和与具有seqidno:4的截短序列可比较的稳定性。
在另一个实施方式中，提供了突变体纤维素酶多肽，其中至少三个或全部四个半胱氨酸在对应于具有seqidno:4的纤维素酶的截短多肽的位置cys64、cys89、cys230和cys272处被丙氨酸或其他合适的氨基酸所替换，其中所述突变体多肽也是活性的。
还另一个目的在于提供一种制备多肽的方法，所述多肽具有由接头序列在具有seqidno:4的序列中的n-端或c-端区域处连接到所述多肽的新的纤维素结合结构域(cbd)序列。
在另一个实施方式中，任何氨基酸均可被任何其他氨基酸替换以产生多肽的更具活性且稳定的形式。
在另一个实施方式中，可通过随机或定向诱变在任何位置处添加另外的氨基酸残基以获得活性多肽。
作为本发明的一个优选实施方式，通过重组措施表达的纤维素酶可在允许硫醇反应性基团如聚乙二醇(peg)连接到纤维素酶中存在的天然半胱氨酸的条件下与期望的硫醇反应性基团试剂反应以增强其稳定性。
因此，在本发明的优选实施方式中，功能性多肽具有5-7.5的宽活性范围并在ph-6下具有最佳活性，并且还在宽的ph范围下、更具体地在ph4-9下表现出高稳定性，另外也较不易聚集。
优选实施方式中的功能性多肽提供了一种纤维素酶，其在30-70℃的宽温度范围内显示出活性，最适温度为58℃，并且在高温下也非常稳定，在58℃下保持其最大活性的至少一半达几乎10小时。
在本发明的一个方面，当在58℃下在0.2％底物cmc的存在下温育时，多肽的稳定性增加。
在本发明的另一个方面，本发明的多肽在离子盐如nacl、kcl、licl等盐的存在下显示出增强的活性。
在另一个方面，本发明的功能性活性多肽是在高浓度离子盐、更优选4nnacl、3mlicl等的存在下也高度稳定的纤维素酶。本发明中的纤维素酶在这种高盐浓度下长时间温育30天时保留70％-100％的活性。
大多数纤维素酶的活性需要一种或多种一价或二价阳离子。但本发明的多肽在未添加阳离子的情况下显示出活性并且不因edta的存在而被抑制。此外，该活性在1mmcocl2、feso4、mncl2的存在下显示出增强。
本发明公开了在0.25％的非离子型洗涤剂如triton-x-100、tween-20、tween-80等的存在下具有活性的多肽及其功能性衍生物。
根据优选的实施方式，本发明提供了一种功能性多肽，其对含有多糖的1,4-β-和1,3-β-葡糖苷键的各种底物具有高比活性，如表5中所示。
本发明提供了一种新型酶及其功能性衍生物，它们对发色底物对硝基苯酚纤维二糖苷中存在的1,4-β-键也具有活性。
本发明还提供了通过在不同位置处删除或取代一个或多个氨基酸所获得的功能活性多肽的功能性衍生物。这些功能性衍生物保留了纤维素酶活性的特征。这样的多肽也可优于天然多肽，例如提高的最适ph和提高的温度稳定性、较小的聚集倾向等。
本发明中的多肽可与在n-端或c-端处由接头肽连接的其他多肽部分融合以进一步改善有用的性质，如高活性及功能和结构稳定性。
功能性多肽可通过使用不同层析如离子交换、基于亲和力的层析、疏水相互作用层析、凝胶过滤等的组合来纯化至均一。功能性多肽也可与某些标签如6x-his、hsv-标签等融合以辅助纯化过程，如果期望，所述标签可以在之后切除。
本发明还提供了含有编码功能性多肽或其功能性衍生物的本发明的核酸的重组载体。所述载体可以是基于大肠杆菌的、酵母载体或任何合适的真核或原核载体。
本发明还提供了表达具有编码各种功能性多肽或其功能性衍生物的核酸的重组载体的重组宿主。所述宿主可以是任何细菌、真菌、昆虫或哺乳动物细胞。
本发明提供了一种生产功能性多肽以及其功能性衍生物的方法，所述方法包括培养宿主和通过合适的方法分离多肽使得可获得高产量的程序。
实施例中使用的一般方法：
新型纤维素酶基因的克隆在基于t7启动子的表达载体pet-15(b)中进行，大肠杆菌菌株被用作表达宿主，购自novageninc.(madison,wis.)。dna扩增和修饰酶如pfudna聚合酶、限制性内切核酸酶、t4dna连接酶、dpni得自newenglandbiolabs(neb,usa)。
phusion聚合酶购自thermoscientific,usa。寡核苷酸由integrateddnatechnologies(idtusa)合成。使用来自qiagentm的市售试剂盒和制造商建议的程序进行dna的凝胶提取以及质粒dna分离。通过使用ultracleantm和powermaxtm(mobiolaboratoriesinc.,carlsbad,ca,usa)进行土壤dna分离。在载体pezseqtm(lucigencorporation,middleton,usa)中构建文库。用来辅助纯化携带his-标签的蛋白质的ni-nta珠来自qiagen。使用abi测序仪进行自动化dna测序。用于检测纤维素酶活性的底物如羧甲基纤维素(cmc)、对硝基苯酚纤维二糖苷(pnpc)、大麦-β-葡聚糖、微晶纤维素、昆布多糖等购自sigma-aldrich(usa)。实验中使用的所有试剂均具有可得到的最高质量等级。
1.重组dna方法：通常，用于重组dna制备的方法和技术与分子生物学中最常用的相同，参考教科书如sambrook,molecularcloning:alaboratorymanual(sambrookandrussell,2001)。然而，在本发明的上下文中，无论它们被引入到实施例部分的什么地方，提到了修改。
2.用于检测纤维素酶活性的酶谱法按choi(choi等,2009)开发的方案进行。跑10％sds凝胶以基于各自的分子量分离蛋白质。电泳后，用2.5％triton-x洗涤凝胶30分钟以除去sds，然后用50mmtris-cl(ph-7.4)充分洗涤2-3次。此程序在温育半小时后去除triton-x-100。然后将凝胶覆盖在含有0.5％cmc底物的0.5％琼脂糖平板上并于37℃下温育至少2小时。温育后，除去凝胶，将板用0.2％刚果红溶液染色，并然后用1mnacl脱色。活性条带显现为板上的黄色间隙区。
3.按laemmli(laemmli,1970)开发的方案跑sds-page。将大约10μg蛋白质样品与5x样品缓冲液(0.25mtris-hclph6.8、15％sds、50％甘油、25％β-巯基乙醇、0.01％溴酚蓝)混合。通过煮沸使蛋白质样品变性，并在12,000rpm下各离心5分钟。使用不连续凝胶体系，其具有分离和堆叠组分的不同浓度和ph。根据蛋白质的尺寸，在1.5mtris-clph-8.8和不同的聚丙烯酰胺浓度下浇铸分离凝胶。
4.较小尺寸的蛋白质需要高浓度的丙烯酰胺，反之亦然。在0.5mtris-clph-6.8中制备5％的堆叠凝胶。在缓冲液槽中填充1xsds电泳缓冲液，提供20ma的恒定电流直至蛋白质染料穿过堆叠凝胶，并在当蛋白质染料进入分离凝胶中时将电流增至30ma。在轻轻振摇下用考马斯亮蓝r250染料溶液(250mg染料在甲醇:水:冰醋酸的4.5:4.5:1混合物中)对凝胶染色，并使用脱色溶液(30％甲醇和10％冰醋酸)除去背景吸收的染料。
5.cmc测定：使用dns(二硝基水杨酸)测定进行还原糖的检测。通过将5克二硝基水杨酸(1％)和5克naoh(1％)溶解于水中来制备dnsa。然后加入19.2％的罗谢尔盐(酒石酸钾钠)并溶解。随后加入0.05％的亚硫酸钠和0.2％的苯酚。最后用水补充体积并然后将dns试剂于4℃下贮存在琥珀色瓶中(miller,1959)。
6.葡萄糖标准曲线：在水中制备葡萄糖一水合物(1mg/ml)，将不同体积(至多60μl)置入96-孔pcr板中，并加入60μldns试剂(xiao等,2005)。所有实验一式三份进行。用塑料垫盖住板并使反应在95℃下加热5分钟，然后将其中的100μl转移至96-孔微板并在540nm下测量吸光度(miller,1959)。使用方程(y＝mx+c)从标准曲线计算还原糖浓度。
7.在含有30μl适当稀释的酶和30μl2％cmc(溶解于水中)的60μl反应中测量纤维素酶活性。小心使柠檬酸钠缓冲液(ph-6)的最终浓度在反应中保持100mm。如上所述，将反应在其最适温度下温育指定的时间并用60μldns试剂终止。还包括适当的空白，一个没有酶(酶空白)，另一个没有底物(底物空白)。
实施例
以下实施例为示意本发明而给出并因此不应理解为限制本发明的范围。
实施例1：
土壤dna分离和文库制备及纤维素酶筛选：
使用来自mo-biolaboratoriesinc.,carlsbad,ca,usa的市售试剂盒(ultracleantm和powermaxtm试剂盒)分离土壤dna。将来自imtech(30.7478°n，76.7337°e)的10g土壤置于无菌的50ml管中，随后加入15ml珠溶液并涡旋。然后将溶液匀化20秒，随后加入试剂盒中提供的1.2ml溶液s1和6mlirs溶液(抑制剂去除溶液)。匀化重复60秒，将内容物转移至30ml离心管中并在70℃下温育1小时。以最大速度离心10分钟。然后向上清液中加入2ml溶液s2，在4℃下温育20分钟。再次以10,000rpm离心5分钟，将上清液转移至干净的离心管中并加入30ml溶液s3。通过翻转管两次使内容物适当混合。然后将样品上样到旋转过滤器并在2500×g下旋转5分钟。弃去流通物。旋转过滤器用70％乙醇洗涤6次。给予另外的空转以除去残留的乙醇。然后将旋转过滤器置于新的收集管中，加入8ml溶液s5进行洗脱并在2500×g下旋转10分钟。在经洗脱的样品中加入0.32ml5mnacl和16.6ml冷乙醇并在-20℃下温育过夜。将管于10,000rpm下离心10分钟，团块用70％乙醇洗涤两次，然后干燥并重新悬浮于水或te缓冲液中。dna样品在0.8％琼脂糖凝胶上跑胶以查看平均尺寸并确定分离出的dna的等级。
分离出的土壤宏基因组dna用sau3a1部分消化并通过琼脂糖凝胶电泳进行分离。使用qiagen凝胶提取试剂盒从凝胶洗脱1-10kb的dna片段并对洗脱的片段进行末端修复。按pezseqblunt克隆试剂盒推荐，使用2.5μlpezseq载体(100ng/μl)与500ng基因组末端修复dna的预混合物进行钝端克隆。使连接混合物在水浴上于16℃下保持过夜。将连接混合物转化到电感受态大肠杆菌中。转化后，将混合物铺展在铺有x-gal&iptg的lb氨苄青霉素平板上以选择重组克隆。重组体显示白色菌落，而非重组体显示蓝色菌落(蓝白筛选或α-互补)。在含有0.5％cmc(sigma)作为底物的lb平板上筛选获得的克隆。温育过夜后，将平板用0.2％的刚果红(sigma)染色15分钟，并用1mnacl脱色(teatherandwood,1982)。从含有内切葡聚糖酶活性的克隆中提取质粒并进行限制性消化(ecori和hindiii,neb)以查看插入片段的尺寸。如通过0.8％琼脂糖凝胶电泳所见，具有纤维素酶活性的阳性克隆具有5-5.5kb的插入片段尺寸。
实施例2：
氨基酸序列分析：
通过引物步移对来自文库的阳性克隆测序。序列长5553bp。克隆显示出5-6个新型orf的存在。搜索编码1017bp长的纤维素酶基因的orf的序列相似性，并通过ncbiblastp程序发现新颖性。编码由1017个碱基对组成的纤维素酶的本发明的orf和blastp揭示，与江西稻杆堆腐物(paludibacterjiangxiensis)的纤维素酶的同一性＝209/332(65％)，阳性＝254/332(76％)。该orf还编码通过使用signalp4.1server预测的上游疏水片(petersen等,2011)。使用expasy翻译软件推导了氨基酸序列(http://web.expasy.org/translate/)。
实施例3：
编码纤维素酶活性的全长orf的克隆：
为了克隆并然后表达编码纤维素酶的天然如全长orf，使用含有独特基因片段作为模板的pezseq载体对基因进行pcr扩增。设计pcr引物使得在基因中包含独特的限制性位点(bamhi和ndei)以克隆到编码辅助蛋白质纯化的n-端his-标签的pet15(b)载体中。对于在100μl反应中的基因扩增，使用以下pcr条件：50ng模板dna，200μmdntp混合物，10μl标准10x缓冲液，0.5μm各引物cel5r_f和cel5r_r及2.5upfudna聚合酶。对于扩增，使用以下循环参数：在95℃下初始变性5分钟，在95℃下最终变性30秒，在55℃下引物退火1分钟，在72℃下延伸1分钟，总共30个循环，最后在72℃下最终延伸5分钟。pcr扩增产物在0.8％琼脂糖凝胶上进行电泳并如预期的那样获得对应于1kb的单一条带。
为了在pet15(b)中克隆扩增的基因片段，使用newenglandbiolabs,inc.供应的缓冲液neb4在50μl反应中用ndei和bamhi限制酶消化500ng载体和扩增产物，并将反应在37℃下温育3小时。将消化产物在0.8％琼脂糖凝胶上跑胶并使用来自qiagen的凝胶提取试剂盒进行凝胶纯化。在10ul反应中使用newenglandbiolabs供应的t4dna连接酶在标准连接条件下于16℃下以3:1的摩尔比将双重消化的插入片段与线性化载体连接12小时。温育后，将酶在65℃下热灭活10分钟。将连接混合物转化到xl1-blue感受态细胞中，挑取获得的转化体并通过琼脂糖凝胶电泳检查感兴趣的基因的存在。将重组载体per15b-cel5r的dna转化到表达宿主bl21-de3中以检查表达。
来自大肠杆菌的纤维素酶的表达谱：
含有重组载体pet15b-cel5r的阳性克隆在10ml含有100μg/ml氨苄青霉素的luria肉汤中于37℃下及200rpm的振摇下生长过夜。然后将1％的原代培养物接种到补充有100μg/ml氨苄青霉素的50mlluria肉汤中并在37℃下及200rpm的振摇下温育直至600nm下的od达到0.6。然后向培养物中加入1mm的iptg以诱导纤维素酶基因的表达并再继续温育4小时。通过在6000g下离心来收集细胞并弃去上清液。将细胞团块重新悬浮于裂解缓冲液(20mm磷酸盐缓冲液ph7.4、300mmnacl、1mmpmsf、10mm咪唑)中，并以30秒的开停循环超声处理30分钟。通过在18000g下离心30分钟使粗裂解物变澄清，分离团块和上清液并上样到10％sds聚丙烯酰胺凝胶上以观察表达谱。与未诱导的细胞相比，该表达谱显示了包含体中重组多肽的存在。将包含体纯化并通过各种重折叠方法进行重折叠，如通过ni-nta珠进行的柱上重折叠、透析、稀释重折叠、使用不同缓冲液组合的96-孔基质重折叠。
实施例4：
删除疏水片后的重新克隆：
通过signalp4.1预测软件进行的基因序列分析显示在氨基酸残基27处的切割位点的上游疏水区的存在。合成了新的引物(cel5r_δ27_f)以删除该上游肽区，反向引物(cel5r_r)与之前的相同。如上所述对orf进行pcr扩增并与n-端6xhis-标签在bamhi和ndei位点之间克隆到pet15(b)载体中。将含有纤维素酶基因的重组载体pet15(b)转化到大肠杆菌rosetta(de3)细胞中，在10％sdspage上检查表达。
实施例5：
活性蛋白质的过表达、重折叠和纯化：
为了纯化蛋白质，收集细胞，然后在超声缓冲液(20mm磷酸盐缓冲液ph7.4、300mmnacl、1mmpmsf、10mm咪唑)中以30秒的开停循环裂解30分钟(heatsystem,newyork)。通过在18000g下离心30分钟使粗裂解物变澄清并将上清液上样到流速为1ml/分钟的预平衡镍亲和柱(gehealthcare)上。使用(20mm磷酸盐缓冲液ph7.4、300mmnacl、30mm咪唑)进行柱子洗涤并用(20mm磷酸盐缓冲液ph7.4、300mmnacl、300mm咪唑)洗脱酶。洗脱的蛋白质在含有20mm磷酸盐缓冲液ph7.4、10％甘油和300mmnacl的缓冲液中透析，三次更换缓冲液。将透析过的蛋白质浓缩，在sds-page上跑胶以查看是否存在聚集，并注射到用20mm磷酸盐缓冲液ph7.4和300mmnacl在0.8ml/分钟的流速下预平衡的120mlsuperdex-75(gehealthcare)上的凝胶过滤层析。收集峰级分并通过10％sds聚丙烯酰胺凝胶分析。通过sds-page分析估计蛋白质的纯度并使用得自expasyprotparamtool的多肽的摩尔消光系数通过od280nm进行定量。在sds-page上，获得约40kda的单一条带。整个程序过程中蛋白质保持未降解。
实施例6：
半胱氨酸突变体的构建及其生物活性：
使用高保真phusion聚合酶试剂盒tm(thermoscientific)进行单一位点半胱氨酸至丙氨酸的突变。设计在中间具有期望突变的互补引物，并在温度循环仪中通过phusion聚合酶延伸。用于诱变的引物列表在表2中示出为从seqidno:23到seqidno:30。25μlpcr反应包含50ng模板dna、200μmdntp混合物、2.5μl标准10x缓冲液、0.5μm各引物、2uphusion聚合酶(thermoscientific)。对于扩增，使用以下循环参数：在98℃下初始变性5分钟，在98℃下最终变性30秒，在55℃下引物退火30秒，在72℃下延伸3.5分钟，总共20个循环，最后在72℃下最终延伸5分钟。5μlpcr扩增产物在0.8％琼脂糖凝胶上进行电泳以查看预期尺寸下的扩增。剩余的pcr产物在pcr反应中使用20u的酶用dpni(neb)酶消化并在37℃下温育1小时以除去甲基化模板dna。将经dpni消化的dna转化到xl1b细胞中。挑取获得的转化体并分离质粒dna。通过测序进行突变dna的确认。测序确认后，将克隆的质粒转化到rosetta(bl21)细胞中。表3和表4分别示出了突变体以及不同位置处的具体突变以及它们分别具有seqidno:5至seqidno:19的蛋白质序列和具有seqidno:31至seqidno:45的核苷酸序列的列表。通过与上述相同的方法纯化多肽。
实施例7：
酶表征和纤维素酶活性
通过3,5-二硝基水杨酸(sigma)测定法(miller,1959)检查酶的活性，其测定由多糖的水解产生的还原糖。一个单位(u)被定义为每分钟释放1μmol还原糖所需的酶的量。在含有1％(w/v)cmc的100mm不同缓冲液(ph3-10)中测定最适ph15分钟。使用的缓冲液为柠檬酸钠(ph-3-6)、tris-cl(ph7-8)和甘氨酸/naoh(ph9-10)。为了确定最适温度，使反应在最适缓冲液ph下于30-70℃的温度下进行15分钟。通过测量在各种温度(4℃、25℃、50℃、55℃、58℃、60℃)下温育不同时间间隔后的残余活性来测定热稳定性。也检查58℃下在存在底物(0.2％cmc)的情况下的热稳定性。通过在25℃下于100mm不同的缓冲液中温育酶来检查ph稳定性，然后在最适条件下检查不同时间间隔后的残余活性。根据描述的方案进行酶谱分析(choi等,2009)。
通过使用1％的不同底物(微晶纤维素、大麦-β-葡聚糖、刺槐豆胶、昆布多糖、木聚糖、na-cmc、微晶纤维素)在标准测定条件下检查底物特异性。通过将50μl10mm底物与50μl经稀释的酶于58℃下温育15分钟，用100μl1mna2co3停止反应并测量405nm下的吸光度来检查对pnpc和pnpg(sigma)的活性。一个单位定义为每分钟释放1μmol对硝基苯酚所需的酶的量。在1mm浓度下检查各种金属离子的影响。有机溶剂和洗涤剂的影响分别在5％和0.25％浓度下测试。
实施例8：
耐盐性和盐活化
通过检查在1m-3mnacl、licl和kcl的存在下的活性来检查盐活化。通过在存在盐的情况下将酶温育不同的时间间隔并然后检查残余活性来检查耐盐性。
本发明的优点
1.通过土壤宏基因组学方法识别的属于gh5家族的新型内切葡聚糖酶耐受高盐条件、温度和ph。
2.该新型内切葡聚糖酶显示出高达58℃的热稳定性和5至9之间的ph稳定性。
3.该内切葡聚糖酶在4mnacl、3mlicl和2mkcl中显示出耐盐性和极高的盐稳定性，其高于其他已知的盐稳定性纤维素酶。
4.极高的盐稳定性与中等的热和ph稳定性的组合使其成为工业应用的潜在候选者。
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