基因测序芯片、基因测序设备及基因测序方法与流程

本发明涉及基因测序领域，尤其是涉及一种基因测序芯片、基因测序设备及基因测序方法。

背景技术：

基因测序技术是现代分子生物学研究中最常用的技术，从1977第一代基因测序发展至今，基因测序技术已经取得了相当大的发展，主要包括第一代sanger测序技术、第二代高通量测序技术、第三代单分子测序技术和第四代纳米孔测序技术。而目前市场主流的测序技术仍以第二代高通量测序为主。

第二代高通量测序技术主要包括Illumina的边合成边测序技术、Thermo Fisher的离子半导体测序技术、连接法测序技术和Roche的焦磷酸测序技术等。其中，离子半导体基因测序方法包括以下步骤：首先进行文库制备，利用喷雾法将待测DNA打断成小链，并在小链的两端加上不同的接头，构建单链DNA文库；其次进行乳液扩增，将这些单链DNA结合在水油包被的直径约20um的磁珠上，并在其上面孵育、退火。经过扩增，每个小链都将被扩增约100万倍，从而达到下一步测序所要求的DNA量。最后进行测序，将磁珠放入微孔中，测序时一个个核苷酸分子连续流过芯片微孔，如果脱氧核苷酸与特定微孔中的DNA分子互补，则该脱氧核苷酸被合成到DNA分子中，并且释放氢离子，该孔溶液的PH值发生变化。离子传感器检测到PH值变化后，即刻便从化学信息转变为数字电子信息。

然而，上述检测方法需要在微孔下方制作离子传感器，离子传感器采用CMOS工艺，包括2个金属-氧化物半导体场效应晶体管(Metal-Oxide-Semiconductor Field-Effect Transistor，MOSFET)和1个离子敏场效晶体管(Ion-Sensitive Field-Effect Transistor，ISFET)。现有的基因测序芯片在制造过程中需要进行多次掩膜、曝光、显影和刻蚀，制造工艺复杂，成本较高。

技术实现要素：

发明要解决的技术问题

为了解决现有技术的上述问题，本发明提供一种基因测序芯片，该基因测序芯片不需要任何场效应管，制造工艺简单，能够大大降低制造难度和成本。本发明还涉及包括该基因测序芯片的基因测序设备。

此外，本发明还提供一种基因测序方法，该基因测序方法应用本发明的基因测序芯片，能够简单方便地进行基因测序。

发明的技术方案

本发明提供一种基因测序芯片，包括基板，形成在所述基板上的电极，与所述电极连接的信号引线，所述信号引线用于向所述电极发送信号并将所述电极感测的信号输出至信号发送端，设置在形成有所述电极和所述信号引线的所述基板上的第一绝缘层，在所述第一绝缘层上与所述电极对应的位置设置有微孔，所述微孔设置在所述电极的远离所述基板的一侧，所述微孔与所述电极之间通过第二绝缘层间隔开。

优选地，所述微孔中设置有与所述第二绝缘层接触的离子敏感膜，所述离子敏感膜可使所述电极感测的信号变化更加明显。

优选地，所述离子敏感膜由四氮化三硅制成，由四氮化三硅制成的离子敏感膜对氢离子更加敏感。

优选地，所述第二绝缘层形成为整层，所述第一绝缘层设置于所述第二绝缘层上。

优选地，所述第二绝缘层设置在所述微孔内，所述第二绝缘层的厚度小于所述第一绝缘层的厚度。

优选地，所述第二绝缘层和第一绝缘层由相同材料一体化制成，有助于进一步降低制造难度和成本。

优选地，所述微孔在所述基板上的投影与所述电极在所述基板上的投影相互重合。

优选地，所述信号引线与所述电极同层设置，有助于进一步降低制造难度和成本。

优选地，所述信号引线与所述电极之间设置有第三绝缘层，所述信号引线与所述电极通过所述第三绝缘层上的过孔连接。

优选地，所述电极和所述信号引线由钼、铝、铜等金属制成，所述第一绝缘层、所述第二绝缘层和所述第三绝缘层由氮化硅或氧化硅制成。所述信号引线可以在所述基板的一侧或者两侧排布，当在所述基板的两侧排布时，可以进一步减小信号引线所占的空间。

本发明还提供一种基因测序设备，包括一种基因测序芯片，所述基因测序芯片包括：基板；电极，所述电极形成在所述基板上；信号引线，所述信号引线与所述电极连接，用于向所述电极发送信号并将所述电极感测的信号输出至信号发送端；第一绝缘层，所述第一绝缘层设置在形成有所述电极和所述信号引线的所述基板上，在所述第一绝缘层上与所述电极对应的位置设置有微孔，所述微孔设置在所述电极的远离所述基板的一侧；所述微孔与所述电极之间通过第二绝缘层间隔开。

本发明还提供一种基因测序方法，所述基因测序方法包括以下步骤：

将包含DNA链的DNA微珠加入所述微孔中进行PCR扩增；

依次向所述微孔中加入四种脱氧核糖核苷三磷酸，通过所述信号引线向所述电极施加信号，并检测所述电极感测的信号值是否发生变化；

根据所述信号值发生变化时加入的脱氧核糖核苷三磷酸确定DNA链上的碱基类型。

优选地，所述脱氧核糖核苷三磷酸为可逆终止脱氧核糖核苷三磷酸，所述基因测序方法还包括：清洗掉向所述微孔中加入的可逆终止脱氧核糖核苷三磷酸，并加入疏基试剂。

发明的有益效果

本发明中的基因测序芯片不需要任何场效应管，制造工艺简单，能够大大降低制造难度和成本。本发明还涉及包括该基因测序芯片的基因测序设备。

本发明中的基因测序方法应用本发明的基因测序芯片，能够简单方便地进行基因测序。

附图说明

图1示出实施例1的基因测序芯片的俯视图；

图2是实施例1的基因测序芯片的沿图1中A-A’线截取的剖视图；

图3是根据实施例1一变型实施例的沿图1中A-A’线截取的剖视图；

图4是根据实施例1又一变型实施例的沿图1中A-A’线截取的剖视图；

图5示出实施例2的基因测序芯片的俯视图；

图6是实施例2的基因测序芯片的沿图5中A-A’线截取的剖视图；

图7是根据实施例2一变型实施例的沿图5中A-A’线截取的剖视图；

图8是根据实施例2又一变型实施例的沿图5中A-A’线截取的剖视图。

附图标记说明

1 基板，2 第一绝缘层，3 第二绝缘层，4 第三绝缘层，5 微孔，6 离子敏感膜，7 电极，8 信号引线，9 过孔，10 侦测芯片(信号发送端)

具体实施方式

为使本发明实施例的目的、技术方案和优点更加清楚，下面将结合本发明实施例的附图，对本发明实施例的技术方案进行清楚、完整地描述。显然，所描述的实施例是本发明的一部分实施例，而不是全部的实施例。基于所描述的本发明的实施例，本领域普通技术人员所获得的所有其他实施例，都属于本发明保护的范围。

除非另作定义，此处使用的技术术语或者科学术语应当为本发明所属领域内具有一般技能的人士所理解的通常意义。本发明专利申请说明书以及权利要求书中使用的“第一”、“第二”以及类似的词语并不表示任何顺序、数量或者重要性，而只是用来区分不同的组成部分。同样，“一个”或者“一”等类似词语也不表示数量限制，而是表示存在至少一个。“连接”或者“相连”等类似的词语并非限定于物理的或者机械的连接，而是可以包括电性的连接，不管是直接的还是间接的。“上”、“下”、“左”、“右”等仅用于表示相对位置关系，当被描述对象的绝对位置改变后，则该相对位置关系也相应地改变。

实施例1

图1示出实施例1的基因测序芯片的俯视图。图2是实施例1的基因测序芯片的沿图1中A-A’线截取的剖视图。

如图1所示，基因测序芯片包括基板1，基板1上设置有电极7和信号引线8，信号引线8的一端与电极7连接，另一端与作为信号发送端的侦测芯片10连接，侦测芯片10设置在由测序单元组成的阵列的一侧或两侧，该侦测芯片10通过信号引线8向电极7发送电压脉冲信号，并检测电极7感测的信号值是否发生变化。在图1中，电极7与信号引线8不同层设置，并通过第三绝缘层4上的过孔9连接。电极7与信号引线8由钼、铝、铜等金属制成。

如图2所示，本发明的一个实施例包括基板1，信号引线8设置与基板1上，电极7通过第三绝缘层4上的过孔与信号引线8连接，第二绝缘层3形成为整层，第一绝缘层2设置于第二绝缘层3上，并且与电极7相对应的位置设置有微孔5，微孔5在基板方向上的投影和电极7在基板方向上的投影相互重合。微孔5中还设置有离子敏感膜6，离子敏感膜6与第二绝缘层3相接触，离子敏感膜6在基板方向上的投影和电极7在基板方向上的投影相互重合。优选地，离子敏感膜6由四氮化三硅制成。当微孔5中发生碱基互补配对时，会释放氢离子，这样就会在离子敏感膜表面感应出能斯特电位，进而对电极7上的电压脉冲信号产生影响。第一绝缘层2、第二绝缘层3和第三绝缘层4由氮化硅或氧化硅制成。

下面说明使用实施例1的基因测序芯片的基因测序方法。该基因测序方法包括以下步骤：

将包含DNA链的DNA微珠加入微孔5中进行PCR扩增；

依次向微孔5中加入四种脱氧核糖核苷三磷酸，通过信号引线8向电极7施加信号，并检测电极7感测的信号值是否发生变化；

根据信号值发生变化时加入的脱氧核糖核苷三磷酸确定DNA链上的碱基类型。

优选地，上述脱氧核糖核苷三磷酸为可逆终止脱氧核糖核苷三磷酸，具体包括可逆终止三磷酸腺嘌呤脱氧核糖核苷酸、可逆终止三磷酸胸腺嘧啶脱氧核糖核苷酸、可逆终止三磷酸胞嘧啶脱氧核糖核苷酸和可逆终止三磷酸鸟嘌呤脱氧核糖核苷酸。

通过侦测芯片10分时地向电极7发送电压脉冲信号和接收电极感测的信号，即先通过信号引线8向电极7发送电压脉冲信号，然后同样通过信号引线8接收电极7感测的信号。当微孔5中的脱氧核糖核苷三磷酸被合成到DNA分子中时，会释放氢离子，氢离子会对电压脉冲信号产生影响，根据信号值发生变化时加入的脱氧核糖核苷三磷酸可以确定DNA链上的碱基类型。

如果微孔5中设置有离子敏感膜6，那么氢离子会在离子敏感膜6的表面感应出能斯特电位，该电位同样会对电压脉冲信号产生影响，根据信号值发生变化时加入的脱氧核糖核苷三磷酸可以确定DNA链上的碱基类型。

具体的，当电极7感测的信号值发生变化时，如果向微孔5中加入的脱氧核糖核苷三磷酸为三磷酸腺嘌呤脱氧核糖核苷酸，则此时待测DNA链上的碱基为胸腺嘧啶；如果向微孔5中加入的脱氧核糖核苷三磷酸为三磷酸胸腺嘧啶脱氧核糖核苷酸，则此时待测DNA链上的碱基为腺嘌呤；如果向微孔5中加入的脱氧核糖核苷三磷酸为三磷酸胞嘧啶脱氧核糖核苷酸，则此时待测DNA链上的碱基为鸟嘌呤；如果向微孔5中加入的脱氧核糖核苷三磷酸为三磷酸鸟嘌呤脱氧核糖核苷酸，则此时待测DNA链上的碱基为胞嘧啶。

在完成DNA一个位置的碱基类型检测后，需要清洗掉向微孔5中加入的可逆终止脱氧核糖核苷三磷酸，并加入疏基试剂。与普通的脱氧核糖核苷三磷酸不同，可逆终止脱氧核糖核苷三磷酸的3′端连接一个叠氮基团，在DNA合成过程中不能形成磷酸二酯键，因而会中断DNA的合成，如果加入疏基试剂，叠氮基团就会断裂，并在原来位置形成一个羟基。在加入疏基试剂后可继续进行后续位置的碱基类型检测，检测方法与上述方法相同，在此不再赘述。

当然，第一绝缘层2、第二绝缘层3的设置方式不限于实施例1中的设置方式。

例如，图3是根据实施例1一变型实施例的沿图1中A-A’线截取的剖视图。如图3所示，第二绝缘层3设置在微孔5内并且完全覆盖电极7，第二绝缘层3的厚度小于第一绝缘层4的厚度。

图4是根据实施例1又一变型实施例的沿图1中A-A’线截取的剖视图。如图4所示，第一绝缘层2和第二绝缘层3由相同的材料一体成型，有助于进一步降低制造难度和成本。

另外需要说明的是，图2至图4中的离子敏感膜6并不是必需的。在不包含离子敏感膜的情况下，当微孔5中发生碱基互补配对时，会释放氢离子，释放出的氢离子会对电极7上的电压脉冲信号产生影响，根据信号值发生变化时加入的脱氧核糖核苷三磷酸可以确定DNA链上的碱基类型。

实施例2

下面主要说明本实施例的基因测序芯片与实施例1中的基因测序芯片的不同之处，为简洁起见将略去对相同之处的说明，其中相同的附图标记表示相同的部件。

图5示出实施例2的基因测序芯片的俯视图。图6是实施例2的基因测序芯片的沿图5中A-A’线截取的剖视图。

如图5所示，信号引线8和电极7同层设置。如图6所示，电极7直接形成于基板1上，并与同层的信号引线8连接。

当然，第一绝缘层2、第二绝缘层3的设置方式不限于实施例1中的设置方式。

例如，图7是根据实施例2一变型实施例的沿图5中A-A’线截取的剖视图。如图7所示，第二绝缘层3设置在微孔5内并且完全覆盖电极7，第二绝缘层3的厚度小于第一绝缘层4的厚度。

图8是根据实施例2又一变型实施例的沿图5中A-A’线截取的剖视图。如图8所示，第一绝缘层2和第二绝缘层3由相同的材料一体成型，有助于进一步降低制造难度和成本。

另外需要说明的是，图6至图8中的离子敏感膜6并不是必需的。在不包含离子敏感膜的情况下，当微孔5中发生碱基互补配对时，会释放氢离子，释放出的氢离子会对电极7上的电压脉冲信号产生影响，根据信号值发生变化时加入的脱氧核糖核苷三磷酸可以确定DNA链上的碱基类型。

使用实施例2的基因测序芯片的基因测序方法与实施例1中相同，在此不再赘述。

以上所述是本发明的优选实施方式，应当指出，对于本技术领域的普通技术人员来说，在不脱离本发明所述原理的前提下，还可以作出若干改进和润饰。本发明的保护范围以权利要求书为准。