一种睾丸间质干细胞分离培养分化方法与流程

文档序号:12411402阅读:来源:国知局

技术特征:

1.一种睾丸间质干细胞分离培养分化方法,其特征在于,包括以下步骤:

步骤1,对取得的睾丸组织体外进行分离、培养、扩增;

步骤2,将P4代细胞进行培养,形成类胚体;

步骤3,将类胚体进行接种分化。

2.根据权利要求1所述的睾丸间质干细胞分离培养分化方法,其特征在于,所述步骤1对取得的睾丸组织体外进行分离的方法为:将取得的睾丸组织用胰蛋白酶和DNase进行消化,再用等体积的DMEM/F12和浓度为10%FBS溶液终止酶消化,在室温下300g*5min离心,弃上清;用5mL DMEM/F12和浓度为10%FBS溶液重悬细胞,室温300g*5min离心,弃上清。

3.根据权利要求1所述的睾丸间质干细胞分离培养分化方法,其特征在于,所述步骤1对取得的睾丸组织体外进行分离的方法为:将取得的睾丸组织用2mg/mL胶原酶、20μg/mL DNase和2mg/mL分解酶消化20min,之后用1mg/mL胰蛋白酶和10μg/mL DNase消化10min,再用等体积的DMEM/F12加10%FBS溶液终止酶消化,在室温下300g*5min离心,弃上清;用5mL DMEM/F12加10%FBS溶液重悬细胞,室温300g*5min离心,弃上清。

4.根据权利要求2或3所述的睾丸间质干细胞分离培养分化方法,其特征在于,步骤1中对取得的睾丸组织体外进行培养、扩增的方法为:用5mL DMEM/F12加10%FBS重悬细胞,调整细胞密度,按照100cells/60mm皿接种细胞,用DMEM/F12加10%FBS培养,6d后取间质干细胞,重新接种于新的24孔板上,进行培养扩增。

5.根据权利要求4所述的睾丸间质干细胞分离培养分化方法,其特征在于,步骤2,将步骤1中培养状态良好的P4代细胞经0.25%胰蛋白酶消化、300g*5min离心后,用PBS缓冲液重悬,300g*5min进行离心;用DMEM/F12加10%FBS重悬细胞,血细胞计数板计数,调整细胞密度,制成800~1000cells/25uL的小滴,倒置培养3天,形成类胚体。

6.根据权利要求5所述的睾丸间质干细胞分离培养分化方法,其特征在于,步骤3,将步骤2中制备好的类胚体接种于48孔板中,每孔中接种1个类胚体,用DMEM/F12加20%FBS使类胚体自发分化7d,之后检测三胚层分化效果。

7.根据权利要求5所述的睾丸间质干细胞分离培养分化方法,其特征在于,对步骤1中正在培养的细胞进行免疫荧光染色:用4%PFA室温固定15分钟,然后PBS洗三遍;用0.2%Triton X-100通透10分钟,PBS洗三遍;用1%BSA室温封闭30分钟,一抗4度过夜,PBS洗三遍;二抗室温1小时,PBS洗三遍;用5ug/mL Hoechst 33342室温染核5min,PBS洗三遍,直接荧光下照相记录。

8.根据权利要求5所述的睾丸间质干细胞分离培养分化方法,其特征在于,对步骤2中形成的类胚体进行成骨诱导分化或脂肪诱导。

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