本发明属于病毒检测领域，具体涉及病毒性传染病的检测方法，特别是涉及一种牛传染性鼻气管炎病毒的检测方法及应用领域。
背景技术：
牛传染性鼻气管炎(infectiousbovinerhinotracheitisvirus，ibr)是牛的一种急性、热性、接触性传染病，其病原为牛传染性鼻气管炎病毒(infectiousbovinerhinotracheitisvirus，ibrv)，又名牛疱疹病毒i型(bhv-i)，该病在临床上表现多种病型，如上呼吸道粘膜炎症、脓疱性外阴阴道炎、龟头炎、结膜炎、幼牛脑膜脑炎、乳房炎、流产等。该病早在20世纪50年代初在美国首次发现并于1956年首次被madin从患牛中分离出来。1958年kendrick从患有传染性脓疱性外阴-阴道炎的病牛中分离病毒，经研究证明，该病毒为ibrv。我国1980年首次从新西兰进口奶牛检测到病毒并分离出来。世界动物卫生组织(oie)将ibr列为b类动物疫病，我国动植物检疫法中也明确规定，进出口牛必须检测ibr，以便控制本病的发生与流行。随后经血清学调查证明，我国大部分地区的牛群中均有ibrv感染，给我国养牛业造成了严重的影响。
本研究以ibr的ge和gb基因为靶序列，建立了检测ibrv和区分ge基因缺失疫苗株和野毒株的实时荧光定量pcr方法。为该病检验检疫提供有效实用的检测方法。
技术实现要素：
根据genbank中登录的ibrvge和gb基因序列，设计2对特异性引物及taqman探针。建立了检测ibrvge、gb基因实时荧光定量pcr方法，从而实现对ibrv的灵敏、高效、快速、准确检测。
本发明的目的在于除通过双重实时荧光pcr方法可用于ibrv野毒感染与ge基因缺失疫苗免疫动物的鉴别，还能同时鉴别检测2个基因或进行gb、ge单基因鉴定。
本发明的目的在于提供一种荧光定量pcr检测牛传染性鼻气管炎病毒(ibrv)的引物，所述引物如seqidno：1和seqidno：2所示。
本发明的目的在于提供一种荧光定量pcr检测牛传染性鼻气管炎病毒(ibrv)的引物，所述引物如seqidno：3和seqidno：4所示。
本发明的目的在于提供一种荧光定量pcr检测牛传染性鼻气管炎病毒(ibrv)的探针，所述探针如seqidno：5所示。
本发明的目的在于提供一种荧光定量pcr检测牛传染性鼻气管炎病毒(ibrv)的探针，所述探针如seqidno：6所示。
本发明的目的在于提供一种荧光定量pcr检测牛传染性鼻气管炎病毒(ibrv)的探针，所述探针的5’端分别标记有rox和fam，探针的3’端分别标记有bhq2和tamra。
本发明的目的还在于提供将引物或探针用于制备检测牛传染性鼻气管炎病毒(ibrv)的试剂盒中。
本发明的目的在于提供一种荧光定量pcr检测牛传染性鼻气管炎病毒(ibrv)的试剂盒，所述试剂盒包括检测牛传染性鼻气管炎病毒(ibrv)的引物、以及检测牛传染性鼻气管炎病毒(ibrv)的探针。
本发明具体提供了一种牛传染性鼻气管炎病毒检测方法，具体步骤如下：
1.引物和探针的设计与合成：
根据genbank上发表的ibrvge、gb基因序列(登录号：nc001847.1)，用dnastar进行同源性分析，用oligo6.24设计引物和探针，由上海生工合成。扩增长度分别为：112bp、78bp。探针的5’端分别以荧光基团rox和fam标记；3’端以荧光淬灭基团bhq2和tamra标记。
2.目标dna模板的制备
取毒液200μl，根据takara病毒dna/rna提取试剂盒的说明书提取。
25μl体系中加入12.5μlmix，9.5μlddh2o，模板，上下游引物各1μl。循环参数为：94℃预变性5min；94℃45s，59.7℃45s，72℃30s，共30个循环，最后72℃延伸8min；目的片段长度分别为112bp、78bp，pcr产物回收经试剂盒纯化后连接入pmd19-t载体，转化至dh5a大肠埃希菌，选取经双酶切鉴定和通过序列测定分析验证的阳性克隆质粒作为标准阳性。
3.ibrv实时荧光定量pcr反应体系及参数：
采用20μl反应体系，premixextaqtm(probeqpcr)10μl，dna模板2μl，taqman探针(10μmol/l)0.5μl，上下游引物各0.6μl，其余用超纯水补齐至20μl。双重荧光定量pcr体系则按照1∶1的比例配制。反应参数为：95℃预变性30s；95℃变性5s；60℃退火和延伸30s，共45个循环。
本发明中，参照基因库中编号为nc001847.1的bhv-1ge、gb基因序列设计引物和荧光探针，该bhv-1基因序列长135305bp，本领域普通技术人员可以通过公众的渠道获知。
本发明中，以bhv-1基因为模板，用引物ge扩增出长度为112bp的片段，该片段克隆至pmd-19t载体，得到目标模板。
本发明中，以bhv-1基因为模板，用引物gb扩增出长度为78bp的片段，该片段克隆至pmd-19t载体，得到目标模板。
同时，本发明充分考虑到，当ge和gb两模板同时扩增时，会竞争酶、引物和探针，对扩增产生影响，对共扩增体系的反应条件和检测低限进行了优化研究。双重荧光定量pcr体系则按照1∶1的比例配制。反应参数为：95℃预变性30s；95℃变性5s；60℃退火和延伸30s，共45个循环。
进一步本发明对牛传染性鼻气管炎病毒检测方法的特异性和可重复进行了确证，并建立了标准曲线。
用本发明提供的扩增体系分别扩增了牛支原体、牛副流感病毒3型、牛病毒性腹泻病毒、巴氏杆菌、牛、羊布鲁氏菌等核酸样品，被测样品均没有阳性扩增曲线，表明该方法具有较好的特异性。
选取稀释度为1×107copies/μl的dna模板，进行3次10倍倍比稀释，以1×104～1×106copies/μl三个稀释度为模板分别进行4次重复扩增，建立组内重复性试验。变异系数均小于2％，表明该方法具有良好的重复性。
取1×100～1×109copies/μl10个稀释度作为dna模板进行实时荧光定量pcr，每个稀释度做3次重复。观察taqman实时荧光定量pcr最低检出模板拷贝浓度，并与普通pcr比较分析。
通过实施本发明具体的发明内容，可以达到以下有益效果。
本方法检测时间短，传统的病毒分离法对ibrv的检测时间至少要在7d以上，该发明检测时间包括样品前处理到获得检测结果在2h之内，比常规的pcr检测方法至少也要缩短30min。检测灵敏度高，该方法可检测到2个拷贝的重组质粒，灵敏度比常规100-1000倍。特异性好，通过对ibrv、牛支原体、牛副流感病毒3型、牛病毒性腹泻病毒、巴氏杆菌、牛、羊布鲁氏菌等核酸样品检测，只有ibrv检测为阳性。重复性好，通过对不同浓度进行三次重复性检测，不同试验获得的ct值，变异系数均在2％之内。稳定性高，通过对样品的重复性检测，均得到一致性结果。本方法可进行实时监测和定量检测，通过仪器对每个扩增反应中产生荧光信号的接收，实现对整个反应过程的实时监测和结果的定量检测。本方法流程简单，操作性强，易于掌握，只要具备分子生物学基础知识，无需良特别的训练便能很好完成。通过该方法的使用可实现对试验过程实施监测，有效的解决了传统检测方法中存在的假阴性结果，可以对实验室进行质量监控，确保检测结果的准确性。用该发明方法对临床收集的27份牛肺和5份羊肺用该体系进行检测，均得到预期结果。
本方法能同时鉴别检测2个基因或进行gb、ge单基因鉴定。该方法的建立为相关病毒检验检疫技术的研究提供了较好的借鉴意义，并为规范检测试剂向标准化水平的发展具有指导借鉴意义。该方法能够广泛应用于出入境检验检疫部门、畜牧兽医部门和养殖单位，为疫病的有效防控具有重要意义。
附图说明
图1：ibrvpcr扩增结果：其中1、2为ge和gb的扩增产物(112bp、78bp)，m为dl500marker。
图2：重组质粒pcr扩增结果：其中1、2为ge和gb的扩增产物(112bp、78bp)，m为dl500marker。
图3：ibrvge基因实时荧光定量pcr标准曲线：其中ge相关系数r2＝1，扩增效率e＝106.955，起始拷贝数的对数与ct值的表达式为y＝-3.166x+39.77。
图4：ibrvgb基因实时荧光定量pcr标准曲线：其中相关系数r2＝0.999，扩增效率e＝92.658，起始拷贝数的对数与ct值的表达式为y＝-3.511x+37.969。
图5：ibrvge基因实时荧光定量pcr敏感性扩增曲线：其中曲线1～10分别为2×109～2×100copies/μl为模板进行的实时荧光定量pcr扩增，11为阴性对照。
图6：ibrvgb基因实时荧光定量pcr敏感性扩增曲线：其中曲线1～10分别为2×109～2×100copies/μl为模板进行的实时荧光定量pcr扩增，11为阴性对照。
图7：ibrvgb基因荧光定量pcr特异性扩增曲线：其中曲线1～8分别为2×109～2×102copies/μl为模板进行的实时荧光定量pcr扩增，9～14分别为牛支原体、牛副流感病毒3型、牛病毒性腹泻病毒、巴氏杆菌、牛羊布鲁氏菌扩增曲线，15为阴性对照。
图8：ibrvge基因荧光定量pcr特异性扩增曲线：其中1～6分别为2×109～2×104copies/μl为模板行的实时荧光定量pcr，7～11分别为牛支原体、牛副流感病毒3型、牛病毒性腹泻病毒、巴氏杆菌、牛羊布鲁氏菌，12为阴性对照。
图9：ibrv双重实施荧光定量pcr标准曲线：其中ge、gb相关系数均为0.999，效率分别是94.626、96.779均在90％～110％并有良好的线性关系。其回归方程分别为，ge：y＝-3.402x+39.878；gb：y＝-3.458x+42.319。
具体实施方式
实施例一.牛传染性鼻气管炎病毒检测方法
1.引物和探针的设计与合成：
根据genbank上发表的ibrvge、gb基因序列(登录号：nc001847.1)，用dnastar进行同源性分析，用oligo6.24设计引物和探针，由上海生工合成。扩增长度分别为：112bp、78bp。探针的5’端分别以荧光基团rox和fam标记；3’端以荧光淬灭基团bhq2和tamra标记。
2.目标dna模板的制备
取毒液200μl，根据takara病毒dna/rna提取试剂盒的说明书提取。
25μl体系中加入12.5μlmix，9.5μlddh2o，模板，上下游引物各1μl。循环参数为：94℃预变性5min；94℃45s，59.7℃45s，72℃30s，共30个循环，最后72℃延伸8min；目的片段长度分别为112bp、78bp，pcr产物回收经试剂盒纯化后连接入pmd19-t载体，转化至dh5a大肠埃希菌，选取经双酶切鉴定和通过序列测定分析验证的阳性克隆质粒作为标准阳性。
3.ibrv实时荧光定量pcr反应体系及参数：
采用20μl反应体系，premixextaqtm(probeqpcr)10μl，dna模板2μl，taqman探针(10μmol/l)0.5μl，上下游引物各0.6μl，其余用超纯水补齐至20μl。双重荧光定量pcr体系则按照1∶1的比例配制。反应参数为：95℃预变性30s；95℃变性5s；60℃退火和延伸30s，共45个循环。
本发明中的引物代号序列见表1，其中参照基因库中编号为nc001847.1的bhv-1ge、gb基因序列设计引物和荧光探针，该bhv-1基因序列长135305bp，本领域普通技术人员可以通过公众的渠道获知。
表1：引物代号、序列表一所示为ge和gb引物和探针的序列。
实施例二：目标模板的获得
取毒液200μl，根据takara病毒dna/rna提取试剂盒的说明书提取。
25μl体系中加入12.5μlmix，9.5μlddh2o，模板，上下游引物各1μl。循环参数为：94℃预变性5min；94℃45s，59.7℃45s，72℃30s，共30个循环，最后72℃延伸8min；目的片段长度分别为112bp、78bp，pcr产物回收经试剂盒纯化后连接入pmd19-t载体，转化至dh5a大肠埃希菌，选取经双酶切鉴定和通过序列测定分析验证的阳性克隆质粒作为标准阳性。
1.重组质粒的pcr扩增鉴定：
取1μl为模板，加入premix12.5μl，上、下游引物(10pmol)各1μl，补水至25μl，进行pcr扩增，2％琼脂糖凝胶电泳检测。
2.重组质粒的酶切鉴定：在200μl管中加入8μl质粒，2μlbuffer，1μlecori，1μlhindiii，补超纯是至20μl，离心混合均匀，置37℃水浴消化2h，2％琼脂糖凝胶电泳检测。
3.重组质粒的测序：将酶切鉴定为阳性质粒的菌液过夜培养，送去测序。
琼脂糖凝胶电泳表明，以bhv-1全基因dna为模板，ge和gb为引物，扩增出大小相符的112bp和78bp片段，重组质粒pcr扩增和酶切鉴定均得到112bp和78bp片段，测序鉴定均正确，经鉴定正确的重组质粒即为目标模板(附图1、2)。
实施例三：实时荧光定量pcr扩增体系的建立
分别以ge和gb为模板进行扩增，25pl反应体系，其中premixextaqtm(probeqpcr)10μl，dna模板2μl，taqman探针(10μmol/l)0.5μl，上下游引物各0.6μl，其余用超纯水补齐至20μl。双重荧光定量pcr体系则按照1：1的比例配制。反应参数为：95℃预变性30s；95℃变性5s；60℃退火和延伸30s，共45个循环。结果表明，探针针对各自模板具有较好的特异性，扩增曲线参见附图7、8。
实施例四：标准曲线的绘制
取制备的标准品dna模板，进行10倍倍比稀释，共1×109～1×100copies/μl10个梯度，将其作为已知浓度标准品绘制标准曲线。按优化后的反应体系和反应参数，同时设立阴性对照(以超纯水代替模板)。评价标准曲线的相关系数r2值、扩增效率e值、标准曲线斜率k值以及构建标准曲线回归方程(附图3、4、9)。
实施例五：重复性试验、敏感性试验和特异性试验
选取稀释度为1×107copies/μl的dna模板，进行3次10倍倍比稀释，以1×104～1×106copies/μl三个稀释度为模板分别进行4次重复扩增，建立组内重复性试验，同时设立阴性对照(结果见表2和表3)。
表2：ge基因重复性试验结果
表3：gb基因重复性试验结果
取1×100～1×109copies/μl10个稀释度作为dna模板进行实时荧光定量pcr，每个稀释度做3次重复。观察taqman实时荧光定量pcr最低检出模板拷贝浓度，并与普通pcr比较分析，同时设立阴性对照(图5，6)。
用牛支原体、牛副流感病毒3型、牛病毒性腹泻病毒、巴氏杆菌、牛、羊布鲁氏菌按优化后的反应体系和反应参数，进行特异性试验。取制备的标准品dna模板5个稀释度作为阳性对照，同时设立阴性对照。
实施例六：多重实时荧光定量pcr标准曲线的制备
将已制备好的ge、gb的标准阳性质粒模板作10倍倍比稀释，采用已建立的多重实时荧光定量pcr(模板为2种标准阳性质粒混合模板)的反应体系和反应参数进行实时荧光定量pcr检测
实施例七：对样品的检测
对27份牛肺、5份羊肺进行定量检测。由图可知，阳性对照出现扩增曲线，阴性对照未出现扩增曲线。牛肺9份可能为gb基因阳性反应，其中4份为gb、ge双基因阳性反应，其余样品均呈阴性反应。
以上实施例进一步说明了本发明的内容，但不应理解为对本发明的限制。在不背离本发明精神和实质的情况下，对本发明方法、步骤或条件所做的修改或替换，均属于本发明的范畴。