一种RHDV重组聚合酶等温扩增检测方法与流程

本发明涉及一种生物检测技术，具体涉及一种检测兔出血症病毒(RHDV)的特异性引物和重组聚合酶等温扩增检测方法，属于分子生物学技术领域。

背景技术：

兔出血症是由兔出血症病毒(Rabbit hemorrhagic disease virus，RHDV)引起的一种高度接触性、急性、致死性传染病，常呈暴发性流行，对家兔饲养行业造成毁灭性的损失。RHDV的基因组为一条单股正链的RNA分子，由约7437个核苷酸组成，基因组含有2个开放阅读框架，衣壳蛋白VP60是主要的结构蛋白。RHDV的常用检测方法有血凝试验(HA)、反向间接血凝(IHA)、免疫扩散法、荧光抗体法、酶联免疫吸附法(ELISA)、电镜观察法、RT-PCR法等。HA、IHA、免疫扩散法等方便快捷，但敏感性较低,不适宜于微量病毒的检测。ELISA、荧光抗体法较为成熟，但不及RT-PCR方法敏感。常规RT-PCR必须经过变性、退火、延伸三个步骤，需要特殊的基因扩增仪器。

重组酶聚合酶扩增(Recombinase Polymerase Amplification，RPA)，被称为是可以替代PCR的核酸检测技术。英国公司TwistDx Inc以此为基础开发的核酸扩增产品，能够在15分钟内进行常温下的单分子核酸检测。该技术对硬件设备的要求很低，特别适合用于体外诊断、兽医、食品安全、生物安全、农业等领域。RPA反应的最适温度在37℃～42℃，无需变性，在常温下即可进行，这无疑能大大加快基因扩增的速度。此外，由于不需要特殊的温控设备，RPA可以真正实现便携式的快速核酸检测。

技术实现要素：

针对上述现有技术，本发明提供了一种检测兔出血症病毒(RHDV)的特异性引物，以及重组聚合酶等温扩增检测方法，该方法具有简便、快速、敏感性高、特异性好等优势，完全能够满足快速检测RHDV的需要。

本发明是通过以下技术方案实现的：

一种检测兔出血症病毒(RHDV)的特异性引物，包括上游引物和下游引物，其核苷酸序列为：

上游引物F：5’-TgTTATggAgggCAAAACCCgCACAgCgCCgCAA-3’；如SEQ.ID.NO.1所示；

下游引物R：5’–CggCTgTgAATgggTTgTTCTgTggAgAgTgTT-3’；如SEQ.ID.NO.2所示。

所述引物所对应的特异性扩增片段位于RHDV参照基因(Genbank DQ205345)的第5301-5617位点之间，大小为317bp，其核苷酸序列为：

5’-TgTTATggAgggCAAAACCCgCACAgCgCCgCAAggCgAAgCAgCAggCACTgCTACCACAgCATCAgTTCCCggAACCACgACCgACggCATggATCCTggCgTggTggCCgCAACTAgTgTggTCACTgCAgAAAATTCATCCgCATCggTTgCAACggCggggATTggCggCCCACCCCAACAggTggACCAACAAgAAACATggAggACTAACTTTTACTACAATgATgTTTTCACTTggTCCgTCgCggATgCgCCCggCAgCATTCTCTACACTgTCCAACACTCTCCACAgAACAACCCATTCACAgCCg-3’，如SEQ.ID.NO.4所示。

一种兔出血症病毒(RHDV)重组聚合酶等温扩增检测方法，为：提取肝脏组织的RNA，利用上述特异性引物进行重组酶聚合酶等温扩增，并检测扩增产物，若能扩增出317bp的条带，则判断为RHDV阳性，反之则为阴性。

优选的，所述提取肝脏组织的RNA的具体方法如下：

将肝脏组织用PBS以1∶10(w/v)研磨成悬液,装入高压灭菌处理过的1.5mL EP管中，于-80℃反复冻融3次，冻融后以9000×g离心10min，取上清液300μL于2mL离心管中，加入900μL TRIZOL试剂，剧烈颠倒6～10次，室温静置10min；加入200μL氯仿，上下颠倒60～100次，室温静置5min；4℃10000×g离心10min；取上清移入1.5mL离心管中，加等体积的异丙醇，轻轻摇匀，-20℃放置30min，4℃10000×g离心10min，倒掉上清；加入1mL 75％乙醇溶液，4℃10000×g离心5min，去掉上清，在超净工作台中干燥5min，用适量0.1％DEPC水溶液溶解RNA，-20℃冻存。

优选的，进行重组酶聚合酶等温扩增时，按照TwistAmp DNA Amplification Kits试剂盒操作说明进行，反应体系为：上、下游引物(20μmol/μL)各1.2μL，RT Buffer 29.5μL，Template 10μL，ddH2O 5.6μL；漩涡混匀，离心；加入2.5μL 280mM MgAc，混匀。

优选的，进行重组酶聚合酶等温扩增时，扩增参数为：40℃15min后取出，冷却至室温；混匀后，离心，40℃35min。

优选的，所述检测扩增产物的方法为电泳：取5μL PCR产物加入2℅琼脂糖凝胶中进行电泳观察。

本发明的检测RHDV的特异性引物，是根据RHDV的VP60基因序列设计的引物，并基于该特异性引物的性质，本发明进一步优化建立了适宜于快速准确进行RHDV检测的等温扩增基因方法，最低检出病毒量为0.1LD₅₀，灵敏度与传统RT-PCR一致。该方法操作简单、快速，适用于临床生产和实验室的快速诊断。

附图说明

图1：兔出血症病毒重组酶聚合酶扩增引物的优化；其中，M-标准DNA分子量2000；1-EQ.ID.NO.1/SEQ.ID.NO.3；2-EQ.ID.NO.1/SEQ.ID.NO.2。

图2：兔出血症病毒重组酶聚合酶等温检测特异性结果；其中，M-标准DNA分子量2000；1-兔出血症病毒；2-巴氏杆菌；3-波氏杆菌；4-大肠杆菌；5-葡萄球菌；6-魏氏梭菌；7-兔肝脏。

图3：兔出血症病毒重组酶聚合酶等温检测灵敏度结果；其中，M-标准DNA分子量2000；1-10³LD₅₀；2-10²LD₅₀；3-10LD₅₀；4-1LD₅₀；5-0.1LD₅₀；6-0.01LD₅₀。

图4：兔出血症病毒RT-PCR检测灵敏度结果；其中，M-标准DNA分子量2000；1-10³LD₅₀；2-10²LD₅₀；3-10LD₅₀；4-1LD₅₀；5-0.1LD₅₀；6-0.01LD₅₀。

具体实施方式

下面结合实施例对本发明作进一步的说明。

下述实施例中所涉及的仪器、试剂、材料等，若无特别说明，均为现有技术中已有的常规仪器、试剂、材料等，可通过正规商业途径获得。下述实施例中所涉及的实验方法，检测方法等，若无特别说明，均为现有技术中已有的常规实验方法，检测方法等。

实施例一

1、引物设计

常规RT-PCR所用引物长度一般18-25个，而RP引物的长度一般为30-35个核苷酸，引物过短会严重影响重组酶的活性，依据重组酶聚合酶的扩增特性。通过对已有的大量RHDV基因序列进行比对，参照RHDV基因序列(Genbank DQ205345)设计了3条保守引物，如下：

SEQ.ID.NO.1：5’-TgTTATggAgggCAAAACCCgCACAgCgCCgCAA-3’(34nt)；

SEQ.ID.NO.2:5’-CggCTgTgAATgggTTgTTCTgTggAgAgTgTT-3’(位于33nt)；

SEQ.ID.NO.3:5’-AACTgCATgCCACCAgCCCAgCCAgCgTACAT-3’(32nt)。

其中，SEQ.ID.NO.1和SEQ.ID.NO.2的扩增片段长度为317bp(第5301-5617位)。

5’-TgTTATggAgggCAAAACCCgCACAgCgCCgCAAggCgAAgCAgCAggCACTgCTACCACAgCATCAgTTCCCggAACCACgACCgACggCATggATCCTggCgTggTggCCgCAACTAgTgTggTCACTgCAgAAAATTCATCCgCATCggTTgCAACggCggggATTggCggCCCACCCCAACAggTggACCAACAAgAAACATggAggACTAACTTTTACTACAATgATgTTTTCACTTggTCCgTCgCggATgCgCCCggCAgCATTCTCTACACTgTCCAACACTCTCCACAgAACAACCCATTCACAgCCg-3’，如SEQ.ID.NO.4所示。

SEQ.ID.NO.1SEQ.ID.NO.3的扩增片段长度为360bp(第5301-5660位)。

5’-TgTTATggAgggCAAAACCCgCACAgCgCCgCAAggCgAAgCAgCAggCACTgCTACCACAgCATCAgTTCCCggAACCACgACCgACggCATggATCCTggCgTggTggCCgCAACTAgTgTggTCACTgCAgAAAATTCATCCgCATCggTTgCAACggCggggATTggCggCCCACCCCAACAggTggACCAACAAgAAACATggAggACTAACTTTTACTACAATgATgTTTTCACTTggTCCgTCgCggATgCgCCCggCAgCATTCTCTACACTgTCCAACACTCTCCACAgAACAACCCATTCACAgCCgTgCTgAgCCAgATgTACgCTggCTgggCTggTggCATgCAgTT-3’，如SEQ.ID.NO.5所示。

2、核酸提取

将肝脏组织用PBS以1∶10(w/v)研磨成悬液,装入高压灭菌处理过的1.5mL EP管中，于-80℃反复冻融3次，冻融后以9000×g离心10min，取上清液300μL于2mL离心管中，加入900μL TRIZOL试剂，剧烈颠倒6～10次，室温静置10min；加入200μL氯仿，上下颠倒60～100次，室温静置5min；4℃10000×g离心10min；取上清移入1.5mL离心管中，加等体积的异丙醇，轻轻摇匀，-20℃放置30min，4℃10000×g离心10min，倒掉上清；加入1mL 75％乙醇溶液，4℃10000×离心5min，去掉上清，在超净工作台中干燥5min，用适量0.1％DEPC水溶液溶解RNA，-20℃冻存。

3、重组酶聚合酶等温扩增

按照Twistamp DNA AmplifiCATion KiTs试剂盒操作说明进行,PCR反应体系：上、下游引物(20μmol/μL)各1.2μL,Rehydration Buffer 29.5μL,模板RNA 10μL,ddH2O 5.6μL。漩涡混匀，离心。加入2.5μL 280mM MgAC,混匀。放入PCR仪，40℃15min后取出，冷却至室温，混匀后，离心，放入PCR仪，40℃35min。

常规RT-PCR按照HiscripIIOne Step RT-PCR Kit说明书进行，50μl反应体系如下：2×onestep RT-PCR Mix 25μl，上、下游引物(20μmol/μL)各1.2μL,模板RNA 10μL，ddH2O 12.6μl。扩增参数如下：50℃30min，95℃5min。然后95℃20s，50℃20s，72℃30s，黄35个遁环；最后72℃延伸10min。

反应结束后于2％琼脂糖凝胶电泳,120V，30min，观察结果。

本实施例所用RT-PCR反应体系是通过常规商品化试剂盒进行组装，DNA MArker DL-2000、TRIZOL,DEPC,均购自TAKARA公司(大连)；HisCripIIOne STep RT-PCR KiT购自VAzyme公司；TwisTAmp DNA AmplifiCATion KiTs购自TwisTDX公司。

4、结果

电泳结果表明，仅SEQ.ID.NO.1和SEQ.ID.NO.2这对引物扩增到了约317bp特异片段，而SEQ.ID.NO.1和SEQ.ID.NO.3这对引物含有多个条带，结果如图1所示。因此，应用SEQ.ID.NO.1和SEQ.ID.NO.2这对引物建立了重组酶聚合酶等温核酸检测方法。

7、特异性验证

分别用兔出血症病毒、兔巴氏杆菌、兔波氏杆菌、大肠杆菌、葡萄球菌、魏氏梭菌、健康兔肝脏样品提取DNA或RNA作为模板进行RT-PCR，通过凝胶电泳检测。实验结果如图2所示，只有兔出血症病毒为阳性，其他的均为阴性，说明检测体系特异性良好。

8、灵敏度验证

选择标准RHDV毒株肝脏样品以10倍系列稀释，用上述建立的重组酶聚合酶等温扩增方法进行检测。与传统的RT-PCR方法的均为0.1LD₅₀，结果如图3和图4所示。

9、临床样品检测

收集家兔鼻腔拭子，加入0.8mL PBS(0.01mol/L pH7.2)，充分震荡，取上清提取核酸，用上述建立的方法进行检测，同时与传统的RT-PCR方法进行比较。结果两种方法的符合率为100％。

SEQUENCE LISTING

<110> 申请人名称

<120> 一种RHDV重组聚合酶等温扩增检测方法

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<170> PatentIn version 3.5

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tgttatggag ggcaaaaccc gcacagcgcc gcaa 34

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<212> DNA

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<212> DNA

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aactgcatgc caccagccca gccagcgtac at 32

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ttggtccgtc gcggatgcgc ccggcagcat tctctacact gtccaacact ctccacagaa 300

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