本发明属于医药技术领域，涉及一类二芳基嘧啶-二酮酸类杂合型HIV-1抑制剂及其制备方法。
背景技术：
艾滋病即获得性免缺陷综合症(AIDS)是由人体免疫缺陷病毒(HIV)所导致的全球流行性传染病。HIV分HIV-1和HIV-2两种亚型，世界和中国的绝大多数艾滋病患者均为HIV-1感染。在现有抗艾滋病药物研究中，非核苷类逆转录酶抑制剂(NNRTIs)因其高效低毒的优点被作为一线抗艾滋病药物。目前，经过美国FDA批准上市的NNRTIs共有五种化学实体：奈伟拉平(nevirapine)、依非韦伦(efavirenz)、地拉夫定(delavirdine)、依曲韦林(etravirine)和利匹韦林(rilpivirine)。其中，依曲韦林和利匹韦林均具有二芳基嘧啶结构，这类化合物被称为二芳基嘧啶类HIV-1抑制剂(DAPYs)。DAPYs对HIV-1耐药株具有优良的活性，吸引了各国药物化学家的广泛关注。本申请设计合成一类二芳基嘧啶-二酮酸类杂合型HIV-1抑制剂(DAPY-DKAs)，期待得到一类具有良好HIV-1活性的新药物。
技术实现要素：
本发明所要解决的技术问题是针对现有技术中存在的上述不足，提供一种新的二芳基嘧啶-二酮酸类杂合型HIV-1抑制剂及其制备方法。
为解决上述技术问题，本发明提供的技术方案是：
提供一类二芳基嘧啶-二酮酸类杂合型HIV-1抑制剂，其为式(1)化合物或其可药用盐：
其中R选自氢、C1-5饱和烷基、C3-5环烷基、C2-5烯基，所述二酮酸或二酮酸酯侧链位于醚键氧原子的邻位、间位或对位；
所述C1-5饱和烷基为甲基、乙基、丙基、正丁基、仲丁基、叔丁基、正戊基、异戊基、新戊基中的一种；
所述C3-5环烷基为环丙基、环丁基、环戊基中的一种；
所述C2-5烯基为乙烯基、丙烯基、烯丙基、丁烯基、正戊烯基、异戊烯基中的一种。
本发明还提供上述的二芳基嘧啶-二酮酸类杂合型HIV-1抑制剂的制备方法，其特征在于包括以下步骤：
1)将2-(对氰基苯胺基)-4-氯嘧啶与4-(羟基苯基)-2,4-二氧丁酸乙酯(4-(对羟基苯基)-2,4-二氧丁酸乙酯或4-(间羟基苯基)-2,4-二氧丁酸乙酯)以及碱按摩尔比2‐(对氰基苯胺基)‐4‐氯嘧啶：4‐(羟基苯基)‐2,4‐二氧丁酸乙酯：碱＝1.1:1:3混合，加入溶剂，在惰性气氛下搅拌均匀得到反应液；
2)将步骤1)所得反应液升温至110℃，进行亲核取代反应，TLC监测亲核取代反应进行完全后停止加热，对反应液进行分离、提纯得到酯类化合物，即二芳基嘧啶-二酮酸酯杂合型HIV-1抑制剂。
按上述方案，步骤1)所述溶剂为二甲基亚砜(DMSO)、N,N-二甲基甲酰胺(DMF)、N,N-二甲基乙酰胺(DMA)、1,4-二氧六环、四氢呋喃(THF)中的一种或几种。
按上述方案，步骤1)所述碱为碳酸钾、碳酸钠、碳酸铯、碳酸锂、氢氧化钠、氢氧化钾、氢化钠中的一种或几种。
按上述方案，步骤1)所述惰性气氛为氮气或氩气。
按上述方案，步骤2)所述亲核取代反应时间为40min。
按上述方案，步骤2)所述对反应液进行分离、提纯步骤具体为：待反应液冷却至室温后将其倒入水中，体积比反应液：水＝1:3，并用稀盐酸溶液调节水中pH值至3～4，随后将析出的固体进行抽滤，将所得滤饼溶解在乙酸乙酯中，用无水硫酸钠干燥后再次抽滤，将滤液旋干，得到粗产物，采用柱层析进一步纯化，以石油醚、乙酸乙酯按体积比2:1的混合溶剂为洗脱剂，收集目标化合物组分减压蒸干，最后真空干燥。
按上述方案，本发明所述制备方法还包括以下步骤：
3)将步骤2)所得酯类化合物溶于溶剂中，加入稀碱溶液进行水解反应得到二芳基嘧啶-二酮酸杂合型HIV-1抑制剂。
按上述方案，所述稀碱溶液为氢氧化钠、氢氧化钾、氢氧化锂中的一种或几种的水溶液，浓度为0.1～3mol/L。
酯类化合物在稀碱水溶液作用下发生水解反应得到相应的酸类化合物，反应如下式(2)所示：
本发明还包括一种药物组合物，所述组合物包含有效量的上述的二芳基嘧啶-二酮酸类杂合型HIV-1抑制剂(二芳基嘧啶-二酮酸酯杂合型HIV-1抑制剂及二芳基嘧啶-二酮酸杂合型HIV-1抑制剂)。
以及上述的二芳基嘧啶-二酮酸类杂合型HIV-1抑制剂在制备用来在有此需要的个体中预防或治疗HIV感染或者预防、治疗或延迟AIDS发作的药物中的用途。
本发明的有益效果在于：1、本发明提供一种具有新型结构的二芳基嘧啶-二酮酸类杂合型HIV-1抑制剂，其具有较好的HIV-1细胞水平抑制活性，可用于预防或治疗人免疫缺陷病毒(HIV)感染，和预防、治疗或延迟随后的病症例如AIDS的发作；2、本发明提供的制备方法步骤简单，收率较高，重复性好。
具体实施方式
为使本领域技术人员更好地理解本发明的技术方案，下面结合实施例对本发明作进一步详细描述。
实施例1
称取2.15g 2-(对氰基苯胺基)-4-氯嘧啶、2.00g 4-(对羟基苯基)-2,4-二氧丁酸乙酯和8.28g碳酸铯加入100mL二口烧瓶中，再加入45mL二甲基亚砜，搅拌。抽真空，氩气保护。将反应液升温到110℃反应40min后停止加热。待反应液冷却至室温后，将其倒入150mL水中，并用2mol/L的HCl溶液调节pH值至3～4，大量固体析出后抽滤，将滤饼溶解在乙酸乙酯中，用无水硫酸钠干燥。最后再次抽滤，将滤液旋干，得到粗品，柱层析纯化，洗脱剂为石油醚/乙酸乙酯混合溶剂(2:1，体积比)，收集目标化合物组分减压蒸干，真空干燥，得白色固体A-1，收率52％。
经测试，本实施例所得产物A-1熔点173～175℃；1H NMR谱图峰值(400MHz，DMSO-d6)：δ10.16(s，1H)，8.51-8.50(d，J＝4.8Hz，1H)，8.24-8.22(d，J＝7.6Hz，2H)，7.71-7.69(d，J＝8.0Hz，2H)，7.54-7.47(q，4H)，7.16(s，1H)，6.70-6.89(d，J＝4.4Hz，1H)，4.35-4.30(q，J＝6.8Hz，2H)，1.34-1.30(t，J＝6.8Hz,3H；MS(ESI)：431.95(M+1)+。本实施例所得产物A-1的结构式如下式(3)所示：
实施例2
称取2.15g 2-(对氰基苯胺基)-4-氯嘧啶、2.00g 4-(对羟基苯基)-2,4-二氧丁酸乙酯和2.69g碳酸钠加入100ml二口烧瓶中，再加入45mL N,N-二甲基甲酰胺，搅拌。抽真空，氮气保护。将反应液升温到110℃反应40min后停止加热。待反应液冷却至室温后，将其倒入150mL水中，并用2mol/L的HCl调节pH至3～4，大量固体析出。抽滤，将滤饼溶解在乙酸乙酯中，用无水硫酸钠干燥。最后，再次抽滤，将滤液旋干，得到粗品。柱层析纯化，洗脱剂为石油醚/乙酸乙酯混合溶剂(2:1，体积比)，收集目标化合物组分减压蒸干，真空干燥，得白色固体A-1，收率44％。熔点173～175℃；1H NMR(400MHz，DMSO-d6)：δ10.16(s，1H)，8.51-8.50(d，J＝4.8Hz，1H)，8.24-8.22(d，J＝7.6Hz，2H)，7.71-7.69(d，J＝8.0Hz，2H)，7.54-7.47(q，4H)，7.16(s，1H)，6.70-6.89(d，J＝4.4Hz，1H)，4.35-4.30(q，J＝6.8Hz，2H)，1.34-1.30(t，J＝6.8Hz,3H；MS(ESI)：431.95(M+1)+。
实施例3
称取2.15g 2-(对氰基苯胺基)-4-氯嘧啶、2.00g 4-(对羟基苯基)-2,4-二氧丁酸乙酯和3.51g碳酸钾加入100ml二口烧瓶中，再加入45mL N,N-二甲基乙酰胺，搅拌。抽真空，氮气保护。将反应液升温到110℃反应40min后停止加热。待反应液冷却至室温后，将其倒入150mL水中，并用2mol/L的HCl调节pH至3～4，大量固体析出。抽滤，将滤饼溶解在乙酸乙酯中，用无水硫酸钠干燥。最后，再次抽滤，将滤液旋干，得到粗品。柱层析纯化，洗脱剂为石油醚/乙酸乙酯混合溶剂(2:1，体积比)，收集目标化合物组分减压蒸干，真空干燥，得白色固体A-1，收率42％。熔点173～175℃；1H NMR(400MHz，DMSO-d6)：δ10.16(s，1H)，8.51-8.50(d，J＝4.8Hz，1H)，8.24-8.22(d，J＝7.6Hz，2H)，7.71-7.69(d，J＝8.0Hz，2H)，7.54-7.47(q，4H)，7.16(s，1H)，6.70-6.89(d，J＝4.4Hz，1H)，4.35-4.30(q，J＝6.8Hz，2H)，1.34-1.30(t，J＝6.8Hz,3H；MS(ESI)：431.95(M+1)+。
实施例4
称取2.15g 2-(对氰基苯胺基)-4-氯嘧啶、2.00g 4-(对羟基苯基)-2,4-二氧丁酸乙酯和1.88g碳酸锂加入100ml二口烧瓶中，再加入45mL 1,4-二氧六环，搅拌。抽真空，氮气保护。将反应液升温到110℃反应40min后停止加热。待反应液冷却至室温后，将其倒入150mL水中，并用2mol/L的HCl调节pH至3～4，大量固体析出。抽滤，将滤饼溶解在乙酸乙酯中，用无水硫酸钠干燥。最后，再次抽滤，将滤液旋干，得到粗品。柱层析纯化，洗脱剂为石油醚/乙酸乙酯混合溶剂(2:1，体积比)，收集目标化合物组分减压蒸干，真空干燥，得白色固体A-1，收率38％。熔点173～175℃；1H NMR(400MHz，DMSO-d6)：δ10.16(s，1H)，8.51-8.50(d，J＝4.8Hz，1H)，8.24-8.22(d，J＝7.6Hz，2H)，7.71-7.69(d，J＝8.0Hz，2H)，7.54-7.47(q，4H)，7.16(s，1H)，6.70-6.89(d，J＝4.4Hz，1H)，4.35-4.30(q，J＝6.8Hz，2H)，1.34-1.30(t，J＝6.8Hz,3H；MS(ESI)：431.95(M+1)+。
实施例5
称取2.15g 2-(对氰基苯胺基)-4-氯嘧啶、2.00g 4-(对羟基苯基)-2,4-二氧丁酸乙酯和1.02g氢氧化钠加入100ml二口烧瓶中，再加入45mL 1,4-二氧六环，搅拌。抽真空，氮气保护。将反应液升温到110℃反应40min后停止加热。待反应液冷却至室温后，将其倒入150mL水中，并用2mol/L的HCl调节pH至3～4，大量固体析出。抽滤，将滤饼溶解在乙酸乙酯中，用无水硫酸钠干燥。最后，再次抽滤，将滤液旋干，得到粗品。柱层析纯化，洗脱剂为石油醚/乙酸乙酯混合溶剂(2:1，体积比)，收集目标化合物组分减压蒸干，真空干燥，得白色固体A-1，收率40％。熔点173～175℃；1H NMR(400MHz，DMSO-d6)：δ10.16(s，1H)，8.51-8.50(d，J＝4.8Hz，1H)，8.24-8.22(d，J＝7.6Hz，2H)，7.71-7.69(d，J＝8.0Hz，2H)，7.54-7.47(q，4H)，7.16(s，1H)，6.70-6.89(d，J＝4.4Hz，1H)，4.35-4.30(q，J＝6.8Hz，2H)，1.34-1.30(t，J＝6.8Hz,3H；MS(ESI)：431.95(M+1)+。
实施例6
称取2.15g 2-(对氰基苯胺基)-4-氯嘧啶、2.00g 4-(对羟基苯基)-2,4-二氧丁酸乙酯和1.42g氢氧化钾加入100ml二口烧瓶中，再加入45mL四氢呋喃，搅拌。抽真空，氩气保护。将反应液升温到110℃反应40min后停止加热。待反应液冷却至室温后，将其倒入150mL水中，并用2mol/L的HCl调节pH至3～4，大量固体析出。抽滤，将滤饼溶解在乙酸乙酯中，用无水硫酸钠干燥。最后，再次抽滤，将滤液旋干，得到粗品。柱层析纯化，洗脱剂为石油醚/乙酸乙酯混合溶剂(2:1，体积比)，收集目标化合物组分减压蒸干，真空干燥，得白色固体A-1，收率42％。熔点173～175℃；1H NMR(400MHz，DMSO-d6)：δ10.16(s，1H)，8.51-8.50(d，J＝4.8Hz，1H)，8.24-8.22(d，J＝7.6Hz，2H)，7.71-7.69(d，J＝8.0Hz，2H)，7.54-7.47(q，4H)，7.16(s，1H)，6.70-6.89(d，J＝4.4Hz，1H)，4.35-4.30(q，J＝6.8Hz，2H)，1.34-1.30(t，J＝6.8Hz,3H；MS(ESI)：431.95(M+1)+。
实施例7
称取2.15g 2-(对氰基苯胺基)-4-氯嘧啶、2.00g 4-(对羟基苯基)-2,4-二氧丁酸乙酯和0.61g钠氢加入100ml二口烧瓶中，再加入40mL四氢呋喃，搅拌。抽真空，氮气保护。将反应液升温到110℃反应40min后停止加热。待反应液冷却至室温后，将其倒入150mL水中，并用2mol/L的HCl调节pH至3～4，大量固体析出。抽滤，将滤饼溶解在乙酸乙酯中，用无水硫酸钠干燥。最后，再次抽滤，将滤液旋干，得到粗品。柱层析纯化，洗脱剂为石油醚/乙酸乙酯混合溶剂(2:1，体积比)，收集目标化合物组分减压蒸干，真空干燥，得白色固体A-1，收率45％。熔点173～175℃；1H NMR(400MHz，DMSO-d6)：δ10.16(s，1H)，8.51-8.50(d，J＝4.8Hz，1H)，8.24-8.22(d，J＝7.6Hz，2H)，7.71-7.69(d，J＝8.0Hz，2H)，7.54-7.47(q，4H)，7.16(s，1H)，6.70-6.89(d，J＝4.4Hz，1H)，4.35-4.30(q，J＝6.8Hz，2H)，1.34-1.30(t，J＝6.8Hz,3H；MS(ESI)：431.95(M+1)+。
实施例8
称取2.15g 2-(对氰基苯胺基)-4-氯嘧啶、2.00g 4-(间羟基苯基)-2,4-二氧丁酸乙酯和8.28g碳酸铯加入100ml二口烧瓶中，再加入45mL二甲基亚砜，搅拌。抽真空，氮气保护。将反应液升温到110℃反应40min后停止加热。待反应液冷却至室温后，将其倒入150mL水中，并用2mol/L的HCl调节pH至3～4，大量固体析出。抽滤，将滤饼溶解在乙酸乙酯中，用无水硫酸钠干燥。最后，再次抽滤，将滤液旋干，得到粗品。柱层析纯化，洗脱剂为石油醚/乙酸乙酯混合溶剂(2:1，体积比)，收集目标化合物组分减压蒸干，真空干燥，得白色固体A-2，收率47％。熔点170～172℃；1H NMR(400MHz，DMSO-d6)：δ10.14(s，1H)，8.48-8.47(d，J＝5.2Hz，1H)，8.08-8.06(d，J＝7.2Hz，1H)，7.98(s，1H)，7.74-7.70(t，J＝7.6Hz，1H),7.64-7.42(d，J＝7.6Hz，3H)，7.48-7.46(d，J＝8.0Hz，2H)，7.16(s，1H)，6.68-6.66(d，J＝5.2Hz，1H)，4.32-4.27(m，J＝6.8Hz，2H)，1.31-1.27(t，J＝6.8Hz，3H)；MS(ESI)：431.86(M+1)+。本实施例所得产物A-2的结构式如下式(4)所示：
实施例9
称取2.15g 2-(对氰基苯胺基)-4-氯嘧啶、2.00g 4-(间羟基苯基)-2,4-二氧丁酸乙酯和8.28g碳酸铯加入100ml二口烧瓶中，再加入45mL四氢呋喃，搅拌。抽真空，氮气保护。将反应液升温到110℃反应40min后停止加热。待反应液冷却至室温后，将其倒入150mL水中，并用2mol/L的HCl调节pH至3～4，大量固体析出。抽滤，将滤饼溶解在乙酸乙酯中，用无水硫酸钠干燥。最后，再次抽滤，将滤液旋干，得到粗品。柱层析纯化，洗脱剂为石油醚/乙酸乙酯混合溶剂(2:1，体积比)，收集目标化合物组分减压蒸干，真空干燥，得白色固体A-2，收率43％。熔点170～172℃；1H NMR(400MHz，DMSO-d6)：δ10.14(s，1H)，8.48-8.47(d，J＝5.2Hz，1H)，8.08-8.06(d，J＝7.2Hz，1H)，7.98(s，1H)，7.74-7.70(t，J＝7.6Hz，1H),7.64-7.42(d，J＝7.6Hz，3H)，7.48-7.46(d，J＝8.0Hz，2H)，7.16(s，1H)，6.68-6.66(d，J＝5.2Hz，1H)，4.32-4.27(m，J＝6.8Hz，2H)，1.31-1.27(t，J＝6.8Hz，3H)；MS(ESI)：431.86(M+1)+。
实施例10
称取1.00g酯A-1加入到50mL的单口烧瓶中，再加入12mL四氢呋喃，最后再加入13mL 1mol/L的氢氧化锂。室温下搅拌2.5h，TLC监测显示酯A-1消失，停止搅拌。随后，用2mol/L的HCl调节反应液的pH至2～3，大量固体析出。抽滤，滤饼用分别用甲醇和乙酸乙酯洗2～3遍，真空干燥，得到白色固体A-3，收率51％。熔点198～200℃；1H NMR(400MHz，DMSO-d6)：δ10.14(s，1H)，8.51-8.50(d，J＝5.6Hz，1H)，8.23-8.20(d，J＝8.4Hz，2H)，7.73-7.70(d，J＝8.8Hz，2H)，7.54-7.52(d，J＝8.8Hz，2H)，7.48-7.46(d，J＝8.4Hz，2H)，7.15(s，1H)，6.70-6.68(d，J＝5.6Hz，1H)；MS(ESI)：403.65(M+1)+。本实施例所得产物A-3的结构式如式(5)所示：
实施例11
称取1.00g酯A-1加入到50mL的单口烧瓶中，再加入12mL甲醇，最后再加入13mL 1mol/L的氢氧化钾。室温下搅拌2.5h，TLC监测显示酯A-1消失，停止搅拌。随后，用2mol/L的HCl调节反应液的pH至2～3，大量固体析出。抽滤，滤饼用分别用甲醇和乙酸乙酯洗2～3遍，真空干燥，得到白色固体A-3，收率44％。熔点198～200℃；1H NMR(400MHz，DMSO-d6)：δ10.14(s，1H)，8.51-8.50(d，J＝5.6Hz，1H)，8.23-8.20(d，J＝8.4Hz，2H)，7.73-7.70(d，J＝8.8Hz，2H)，7.54-7.52(d，J＝8.8Hz，2H)，7.48-7.46(d，J＝8.4Hz，2H)，7.15(s，1H)，6.70-6.68(d，J＝5.6Hz，1H)；MS(ESI)：403.65(M+1)+。
实施例12
称取1.00g酯A-1加入到50mL的单口烧瓶中，再加入12mL四氢呋喃/甲醇(1:1,体积比)，最后再加入13mL 1mol/L的氢氧化钠溶液。室温下搅拌2.5h，TLC监测显示酯A-1消失，停止搅拌。随后，用2mol/L的HCl调节反应液的pH至2～3，大量固体析出。抽滤，滤饼用分别用甲醇和乙酸乙酯洗2～3遍，真空干燥，得到白色固体Ⅰ-3，收率77％。熔点198～200℃；1H NMR(400MHz，DMSO-d6)：δ10.14(s，1H)，8.51-8.50(d，J＝5.6Hz，1H)，8.23-8.20(d，J＝8.4Hz，2H)，7.73-7.70(d，J＝8.8Hz，2H)，7.54-7.52(d，J＝8.8Hz，2H)，7.48-7.46(d，J＝8.4Hz，2H)，7.15(s，1H)，6.70-6.68(d，J＝5.6Hz，1H)；MS(ESI)：403.65(M+1)+。
实施例13
称取1.00g酯A-2加入到50mL的单口烧瓶中，再加入12mL四氢呋喃/甲醇(1:1,体积比)，最后再加入13mL 1mol/L的KOH。室温下搅拌2.5h，TLC监测显示酯Ⅰ-2消失，停止搅拌。随后，用1mol/L的HCl调节反应液的pH至2～3，大量固体析出。抽滤，滤饼用分别用甲醇和乙酸乙酯洗2～3遍，真空干燥。得到白色固体A-4，收率66％。熔点194～196℃；1H NMR(400MHz，DMSO-d6)：δ10.14(s，1H)，8.48-8.47(d，J＝5.6Hz，1H)，8.07-8.05(d，J＝7.6Hz，1H)，7.98(s，1H)，7.74-7.70(t，1H)，7.65-7.61(m，3H)，7.49-7.47(d，J＝8.8Hz，2H)，7.15(s，1H)，6.68-6.66(d，J＝5.6Hz，1H)；MS(ESI)：403.58(M+1)+。
本实施例所得产物A-4的结构式如式(6)所示：
实施例14
称取1.00g酯A-1加入到50mL的单口烧瓶中，再加入12mL四氢呋喃/甲醇(1:1,体积比)，最后再加入130mL 0.1mol/L的NaOH。室温下搅拌2.5h，TLC监测显示酯A-1消失，停止搅拌。随后，用1mol/L的HCl调节反应液的pH至2～3，大量固体析出。抽滤，滤饼用分别用甲醇和乙酸乙酯洗2～3遍，真空干燥，得到白色固体A-3，收率48％。熔点198～200℃,1H NMR和MS(ESI)与实施例10数据一致。
实施例15
称取1.00g酯A-1加入到50mL的单口烧瓶中，再加入12mL四氢呋喃/甲醇(1:1,体积比)，最后再加入5mL 3mol/L的NaOH。室温下搅拌2.5h，TLC监测显示酯A-1消失，停止搅拌。随后，用1mol/L的HCl调节反应液的pH至2～3，大量固体析出。抽滤，滤饼用分别用甲醇和乙酸乙酯洗2～3遍，真空干燥，得到白色固体A-3，收率45％。熔点197～200℃；1H NMR和MS(ESI)与实施例10数据一致。
实施例16
称取1.00g酯A-2加入到50mL的单口烧瓶中，再加入12mL四氢呋喃/甲醇(1:1,体积比)，最后再加入130mL 0.1％的KOH。室温下搅拌2.5h，TLC监测显示酯A-2消失，停止搅拌。随后，用1mol/L的HCl调节反应液的pH至2～3，大量固体析出。抽滤，滤饼用分别用甲醇和乙酸乙酯洗2～3遍，真空干燥。得到白色固体A-4，收率52％。熔点194～196℃；1H NMR和MS(ESI)与实施例13数据一致。
实施例17
称取1.00g酯A-2加入到50mL的单口烧瓶中，再加入12mL四氢呋喃/甲醇(1:1,体积比)，最后再加入5mL 3mol/L的KOH。室温下搅拌2.5h，TLC监测显示酯A-2消失，停止搅拌。随后，用1mol/L的HCl调节反应液的pH至2～3，大量固体析出。抽滤，滤饼用分别用甲醇和乙酸乙酯洗2～3遍，真空干燥。得到白色固体A-4，收率43％。熔点195～196℃；1H NMR和MS(ESI)与实施例13数据一致。
实施例18
对本发明实施例所得的产物进行抗HIV生物活性测试：
体外细胞水平的抗HIV病毒活性测定，主要包括对HIV感染的MT-4细胞的抑制活性及细胞毒性两方面。方法描述如下：使化合物在HIV感染的MT-4细胞中，于感染HIV不同时间，用MTT法测定药物对HIV诱变的细胞病变的保护作用，计算使50％的细胞免于HIV诱导的细胞病变所需的浓度半数有效浓度EC50，毒性测定与抗HIV活性实验平行进行，也是在MT-4细胞培养中，用MTT法测定使50％的未感染细胞发生细胞病变的浓度(CC50)。
材料与方法：各化合物的抗HIV活性由药物对HIV在细胞中引起的细胞病变的抑制作用效率来监控。采用MT-4细胞进行细胞培养。采用的病毒株为HIV-1病毒株IIIB。
具体操作如下：将化合物用DMSO或水溶解后用磷酸盐缓冲食盐水溶液稀释，将3×105MT-4细胞用100μL各化合物不同浓度此溶液在37℃预培养lh，然后向该化合物中加入100μL适当的病毒稀释液，将细胞于37℃培养lh。洗涤三次后，将细胞再次分别悬浮于含有或不含有化合物的培养介质中。接着将细胞在5％二氧化碳氛围中，于37℃下再培养7天，并于感染后第三天用含有或不含有化合物的培养介质替换补充培养液。每种培养液条件都重复操作两次。对病毒的细胞病变作用每天都用反向光学显微镜监控。典型来讲，本实验中所用的病毒稀释液常常会在病毒感染后第五天导致细胞病变。药物抑制浓度以药物对病毒细胞病变作用产生50％抑制作用而同时对细胞无直接毒性的浓度(CC50)表示。需要强调的是，当化合物水溶性较差，需要用DMSO才能溶解时，DMSO比浓度相对于水来讲，一般低于10％(DMSO在MT-4细胞培养介质中最终浓度小于2％)。因为DMSO能影响测试化合物的抗病毒活性，对含有相同浓度DMSO溶液抗病毒活性对比空白实验也应该平行进行。另外，DMSO最终浓度(1/1000)远远低于影响HIV-1在T细胞中复制所需的浓度。
对实施例所得的目标产物进行HIV-1RT抑制活性测试：采用一种非放射性的类似于ELISA的方法：供体DNA是由人工合成的两条单链寡核苷酸链(VU5BR:5'-Biotin-GTGTGGAAAATCTCTAGCAGT-3',VU5:5'-ACTGCTAGAGATTTTCCACAC-3')退火而成。VU5BR/VU5按1：1.2混合于TEN缓冲液(10mM Tris-HCI pH 8.0、1mM EDTA pH 8.0和0.1M NaCl)中，80℃加热3min，慢慢降至室温，存放在4℃冰箱。将包被好的96孔板用蒸馏水洗三次，2.5％BSA 37℃封闭3h，0.1％PBST洗三次。每孔加目标分子20mM HEPES pH 7.5、10mM MnCl2、10mM MgCl2、30mM NaCl、10mM DTT、0.05％NP-40、100μg/mL BSA、5nM VU5/VU5BR、2.5-80nM不同浓度的RT 100μL，37℃孵育1h。0.1％PBST洗三次，每孔加100μL链亲和素标记的辣根过氧化物酶1：3000，0.1％BSA+0.025％PBST稀释溶液，37℃孵育1h。0.1％PBST洗三次，加TMB 1μL，37℃放置20～30min，加50μL/孔2M H2SO4，450nm波长下检测吸光度。
表1中列出了目标化合物抑制HIV-1IIIB的EC50、CC50。上市药物奈韦拉平(Nevirapine)也被同时测试作为参考。此外，我们还测试了目标化合物对HIV-1逆转录酶(HIV-1RT)的抑制活性IC50(IC50指的是抑制50％HIV-1RT所需的化合物浓度)，见表1。
表1目标化合物的抗HIV-1活性与细胞毒性
由表1可知，所测试的4个化合物均具有良好的HIV-1细胞水平抑制活性，较小的细胞毒性，具有进一步开发为抗艾滋病药物的潜力。酶水平的活性测试表明了该类化合物确实具有HIV-1逆转录酶抑制活性，属HIV-1逆转录酶抑制剂。