本发明属于生物检测医学分子
技术领域：
，涉及一种检测儿童钙吸收基因多态性的扩增引物及应用，具体涉及一种用于FokI(rs2228570)这个SNP位点核苷酸多态性的检测引物及应用。
背景技术：
：钙是人体所必需的矿物质营养素，所有的细胞都需要钙。人类的健康离不开钙。人体内99％以上的钙都分布于骨骼和牙齿中,其余的1％中一半与蛋白质结合，一半以离子状态存在于软组织、细胞外液及血液。这部分钙与骨骼钙维持动态平衡，是维持体内正常状态所必需的。体内有相当强大保留钙和维持细胞外液中钙浓度的机制，因为钙生理学功能对生命非常重要，即使当饮食钙严重缺乏或机体发生钙异常丢失时，可通过相同机制使骨脱矿化，以纠正甚至是轻微低钙血症，而保持血钙稳定。影响人体每日吸收的钙数量最决定性的器官就是小肠，维生素D所刺激产生的Ca运输蛋白(TRPV-5,TRPV-6)，会将在小肠内腔的Ca离子主动运输至小肠的绒毛细胞(enterocytecell)内，绒毛细胞再将钙离子经由钙泵运输到血液中。维生素D，又通称为可以帮助生物体吸收钙质的固醇类物质，在小肠对钙的吸收中扮演重要的角色，它可增加小肠细胞膜和细胞质的钙结合蛋白质的总量。维生素D缺乏的儿童会因为钙吸收不足而易患有软骨病。基因检测已被证明是预测儿童天赋的有效手段。通过对钙吸收相关某些基因的检测可以对钙吸收进行预测。帮助家长提早发现孩子可能存在的钙吸收高风险情况，从而引起足够的重视。VDR是维生素D受体(VitaminDreceptor)，其作用是结合在Ca运输蛋白基因的上游转录调控元件上，在肾脏中VDR会调节维生素D与Ca运输蛋白基因进一步结合，将其磷酸化，制造出Ca运输蛋白，帮助人体从小肠中吸收钙离子。因此VDR基因的多态性与钙吸收率有显著的相关性。CN103255211A公开了一种预测优秀冰雪运动员身高的分子生物学方法。通过检测维生素D受体基因遗传多态性，即对维生素D受体基因BsmI、ApaI和FokI三个单核苷酸多态性位点的基因型进行命名并检测相应基因型的概率来预测优秀冰雪运动员的最适身高，但其并没有公开可用于检测钙吸收的情况。目前检测单核苷酸多态性的常用方法有PCR-RFLP、基因芯片，sanger测序等方法。PCR-RFLP操作复杂耗时，并且结果可信度差。PCR-RFLP扩增条件要求严格，操作繁琐。基因芯片快速高效，但其造价高。Sanger测序费用较高，且杂合体不易分型。目前市场上儿童补钙的产品很多，但补充钙后儿童能不能很好的吸收钙也至关重要，因此检测VDR基因至关重要。技术实现要素：本发明为了克服上述方法的缺陷，提供一种检测儿童钙吸收基因多态性的扩增引物及应用，本申请方法采用限制性内切酶的方法检测VDR基因上的单核苷酸多态性，准确性高，特异性好，假阳性假阴性率低，操作简单方便，仪器设备要求低，适应性广。为达到此发明的目的，本发明采用以下技术方案：第一方面，本发明提供一种检测儿童钙吸收基因多态性的扩增引物，其特征在于，所述扩增引物包括根据FokI(rs2228570)位点的单核苷酸多态性设计的特异性引物。本发明中，VDR基因上的一个单核苷酸多态性位点rs2228570的多态性与钙吸收高度相关，采用限制性内酶切的方法检测VDR基因准确性高，特异性好，假阳性假阴性率低。根据本发明，所述FokI(rs2228570)位点的特异性引物的核酸序列如SEQIDNO.1-2所示；FokI(rs2228570)上游引物(SEQIDNO.1)：GCGGAACAGCTTGTCCACCC；FokI(rs2228570)下游引物(SEQIDNO.2)：GCTCAGAACTGCTGGAGTGG。第二方面，本发明提供了检测儿童钙吸收基因多态性的试剂盒，所述试剂盒包括第一方面所述的扩增引物。根据本发明，所述试剂盒还包括缓冲液、dNTPs、DNA聚合酶和限制性内切酶。本发明中，所述缓冲液、dNTPs、DNA聚合酶和限制性内切酶都是常规的PCR试剂，本领域技术人员可以根据需要对浓度进行调节，在此不做特殊限定。第三方面，本发明提供一种儿童钙吸收基因多态性的检测方法，所述检测方法包括使用如第一方面所述的扩增引物或如第二方面所述的试剂盒。根据本发明，包括如下步骤：(1)采集待检样本，提取样本DNA；(2)使用如权利要求1或2所述扩增引物进行PCR扩增反应；(3)使用限制性内切酶处理步骤(2)得到的扩增产物；(4)向步骤(3)处理后的扩增产物进行凝胶电泳分析。根据本发明，步骤(1)所述的提取样本DNA的具体步骤如下：取口腔黏膜样本，加入蛋白酶K，45-53℃水浴过夜，煮沸5-15min，置于冰上1-5min，1000-15000r/min离心1-5min，取上清液，即得所述待测样本DNA。所述的水浴温度例如可以是45℃、46℃、47℃、48℃、49℃、50℃、51℃、52℃或53℃，以及上述数值之间的具体点值，限于篇幅及出于简明的考虑，本发明不再穷尽列举所述范围包括的具体点值。所述煮沸时间例如可以是5min、6min、7min、8min、9min、10min、11min、12min、13min、14min或15min，以及上述数值之间的具体点值，限于篇幅及出于简明的考虑，本发明不再穷尽列举所述范围包括的具体点值。所述置于冰上的时间例如可以是1min、2min、3min、4min或5min，以及上述数值之间的具体点值，限于篇幅及出于简明的考虑，本发明不再穷尽列举所述范围包括的具体点值。所述离心的转速例如可以是10000r/min、11000r/min、12000r/min、13000r/min、14000r/min或15000r/min，以及上述数值之间的具体点值，限于篇幅及出于简明的考虑，本发明不再穷尽列举所述范围包括的具体点值。所述离心的时间例如可以是1min、2min、3min、4min或5min，以及上述数值之间的具体点值，限于篇幅及出于简明的考虑，本发明不再穷尽列举所述范围包括的具体点值。本发明中，所述蛋白酶K的浓度为10-30mg/mL，例如可以是10mg/mL、11mg/mL、12mg/mL、13mg/mL、15mg/mL、16mg/mL、18mg/mL、20mg/mL、22mg/mL、23mg/mL、25mg/mL、26mg/mL、28mg/mL或30mg/mL，优选为15-25mg/mL，进一步优选为20mg/mL，以及上述数值之间的具体点值，限于篇幅及出于简明的考虑，本发明不再穷尽列举所述范围包括的具体点值。在本发明一个具体实施例中，所述提取样本DNA的具体步骤如下：取口腔粘膜拭子，在口腔内侧反复擦拭二十下，取出拭子折下棉絮部分，置于Chelex100液150μl的1.5ml离心管中，使其浸没标本，加入20mg/mL蛋白酶K20μL，50℃水浴过夜，煮沸10min，置于冰上3min，12000r/min离心2min，取上清液，即得所述待测样本DNA。本发明中，所述Chelex100液，按照5％(w/v)的浓度配置。根据本发明，步骤(2)所述PCR扩增反应的条件为：(a)94℃预变性1min，1循环；(b)95℃变性30s、60℃退火30s、72℃延伸15s，30个循环；(c)72℃延伸4min，1循环；(d)4℃保存。在本发明一个具体实施例中，所述PCR扩增的具体反应步骤如下：具体反应体系如下；设置一组以水为样本的阴性对照。反应条件如下：根据本发明，步骤(3)所述限制性内切酶为RsaI内切酶和/或NcoI内切酶。优选地，步骤(3)所述限制性内切酶处理的反应的条件为：35-40℃反应2-6h，优选为36-28℃反应2-5h，进一步优选为37℃反应3h。所述反应的温度例如可以是35℃、36℃、37℃、38℃、39℃或40℃，以及上述数值之间的具体点值，限于篇幅及出于简明的考虑，本发明不再穷尽列举所述范围包括的具体点值。所述反应的时间例如可以是2h、3h、4h、5h或6h，以及上述数值之间的具体点值，限于篇幅及出于简明的考虑，本发明不再穷尽列举所述范围包括的具体点值。在本发明一个具体实施例中，所述限制性内切酶处理步骤(2)得到的扩增产物的具体步骤如下：具体反应体系如下；设置一组以水为样本的阴性对照。反应条件如下：在37℃恒温箱中反应3小时。作为优选技术方案，所述儿童钙吸收基因多态性的检测方法，包括如下步骤：(1)采集待检样本，提取样本DNA：取口腔黏膜样本，加入蛋白酶K，45-53℃水浴过夜，煮沸5-15min，置于冰上1-5min，1000-15000r/min离心1-5min，取上清液，即得所述待测样本DNA；(2)使用如权利要求1或2所述扩增引物进行PCR扩增反应：(a)94℃预变性1min，1循环；(b)95℃变性30s、60℃退火30s、72℃延伸15s，30个循环；(c)72℃延伸4min，1循环；(d)4℃保存；(3)使用RsaI内切酶处理步骤(2)得到的扩增产物：35-40℃反应2-6h；(4)向步骤(3)处理后的扩增产物进行凝胶电泳分析。对于本领域技术人员来说，即使不明了本发明的检测原理，同样能够实施、再现本发明，即本发明的检测原理是否清楚明了，都不影响本发明的实施和再现。本发明的儿童钙吸收基因多态性的检测，其检测结果判断如下：若FokI(rs2228570)位点的凝胶电泳结果显示为1条带，303bp，则基因型为AA，则判定为具有儿童钙吸收低风险；若FokI(rs2228570)位点的凝胶电泳结果显示为2条带，205pb、123bp，则基因型为GG，则判定为具有儿童钙吸收高风险；若FokI(rs2228570)位点的凝胶电泳结果显示为3条带，303bp、205bp、123bp，则基因型为AG，则判定为具有儿童钙吸收中度风险。具体结果如下：与现有技术相比，本发明具有如下有益效果：(1)本发明方法对VDR基因的钙吸收相关单核苷酸多态性进行检测，验证了VDR基因突变与儿童钙吸收的风险有关，反映了遗传方面因素带来的钙吸收分析；(2)本发明方法采用限制性内酶切的方法检测VDR基因准确性高，结果直观，特异性好，假阳性假阴性率低，是一种判断儿童钙吸收的简单准备的新方法；(3)本发明检测试剂盒可用于钙吸收相关基因检测，对钙吸收情况进行预测，提早发现存在的钙吸收风险，尽早为治疗和防治做出准备；(4)本发明所提供的用于检测儿童钙吸收基因型多态性的PCR扩增引物、检测试剂盒及其检测方法具有很高的应用价值，操作简单方便，一起设备要求低，适应性广，特别适合推广应用。附图说明图1是本发明实施例1检测FokI基因rs2228570位点凝胶电泳图，其中，从左到右分别为第1-6泳道，第1-5泳道为检测样品，第6泳道为DNAMarker。具体实施方式为更进一步阐述本发明所采取的技术手段及其效果，以下结合本发明的优选实施例来进一步说明本发明的技术方案，但本发明并非局限在实施例范围内。实施例中未注明具体技术或条件者，按照本领域内的文献所描述的技术或条件，或者按照产品说明书进行。所用试剂或仪器未注明生产厂商者，均为可通过正规渠道商购获得的常规产品。试剂：RsaI限制性内切酶：浓度为10U/μl，货号R0167L，产品包装5000U，购自NEB公司，附带10×CutSmart缓冲液；NcoI限制性内切酶：浓度为10U/μl，货号R0193L，产品包装5000U，购自NEB公司，附带10×CutSmart缓冲液；100Resin：货号1422822，产品包装500g，购自BIO-RAD公司。实施例1根据本发明的儿童钙吸收基因型多态性检测试剂盒的组装具体地，根据本发明的儿童钙吸收基因型多态性检测试剂盒中的主要试剂包括：(1)PCR扩增试剂：10×缓冲液、dNTPs、DNA聚合酶、纯水和包含用于检测FokI(rs2228570)位点的PCR扩增引物，其中，FokI(rs2228570)上游引物(SEQIDNO.1)：GCGGAACAGCTTGTCCACCC；FokI(rs2228570)下游引物(SEQIDNO.2)：GCTCAGAACTGCTGGAGTGG。(2)酶切试剂：RsaI限制性内切酶和纯水。实施例2：根据本发明的儿童钙吸收基因型多态性检测试剂盒的检测实例(1)获取检测样本：分别选取5个样本，样本来源为3-5岁的幼儿园小朋友，取口腔粘膜拭子，在口腔内侧反复擦拭二十下，取出拭子折下棉絮部分，置于Chelex100液150μl的1.5ml离心管中，使其浸没标本，加入20mg/mL蛋白酶K20μL，50℃水浴过夜，煮沸10min，置于冰上3min，12000r/min离心2min，取上清液，即得所述待测样本DNA。(2)检测程序：PCR扩增：以步骤(1)获得的DNA为模板，以实施例1所提供试剂盒中的针对FokI(rs2228570)位点多态性的PCR扩增引物对进行PCR扩增，反应体系如下，设置一组以水为样本的阴性对照。反应条件如下：(3)酶切：将步骤(3)得到的PCR产物进行酶切，酶切体系如下：设置一组以水为样本的阴性对照。反应条件如下：在37℃恒温箱中反应3小时。(4)向步骤(3)处理后的扩增产物进行凝胶电泳分析。分析结果如图1所示，其中，从左到右分别为第1-6泳道，第1-5泳道为检测样品，第6泳道为DNAMarker，从图1可以看出：根据下表1判断结果对电泳结果进行判读：表1结果如下表2所示：表2VDR检测结果样品1中度风险样品2高风险样品3中度风险样品4低风险样品5低风险可见，第1、3泳道均有3条带，相应样品基因型为AG，风险居中；第2泳道均有2条带，相应样品基因型为GG，风险较高；第4、5泳道均有1条带，相应样品基因型为AA，风险较低。综上所述，本发明方法对VDR基因的钙吸收相关单核苷酸多态性进行检测，验证了VDR基因突变与儿童钙吸收的风险有关，反映了遗传方面因素带来的钙吸收分析，且本发明检测方法具有很高的应用价值，操作简单方便，一起设备要求低，适应性广，特别适合推广应用。申请人声明，本发明通过上述实施例来说明本发明的详细方法，但本发明并不局限于上述详细方法，即不意味着本发明必须依赖上述详细方法才能实施。所属
技术领域：
的技术人员应该明了，对本发明的任何改进，对本发明产品各原料的等效替换及辅助成分的添加、具体方式的选择等，均落在本发明的保护范围和公开范围之内。SEQUENCELISTING<110>天津脉络医学检验有限公司<120>一种检测儿童钙吸收基因多态性的的扩增引物及应用<130>2017<160>2<170>PatentInversion3.3<210>1<211>20<212>DNA<213>人工合成序列<400>1gcggaacagcttgtccaccc20<210>2<211>20<212>DNA<213>人工合成序列<400>2gctcagaactgctggagtgg20当前第1页1 2 3