用于鉴定番茄颈腐根腐病和枯萎病的病原菌的引物及试剂盒的制作方法

本发明涉及分子生物学技术领域，特别涉及一种用于鉴定番茄颈腐根腐病和枯萎病的病原菌的引物及试剂盒。

背景技术：

番茄(Solanum esculentum L.)是我国最主要的蔬菜之一，估计全国番茄种植面积每年在1000万亩以上，产值在400亿元以上。番茄的种植面积不断扩大，现已可以周年种植，并且产量越来越高，品种花色越来越多，用途广泛，深受种植者和消费者喜爱。目前制约番茄生产的因素除市场行情较难预测外，最主要的就是病虫害较重，番茄的产量和品质难有更大提高。其中，番茄颈腐根腐病(Fusarium crown and root rot，FCRR)和枯萎病(Tomato Fusarium wilt)是番茄生产中的2种重要的土传病害，广泛分布于全球热带、亚热带和温带地区，是世界性的重要病害，具有寄主范围广、防治困难等特点。番茄颈腐根腐病是由一种死体营养型病原真菌尖孢镰刀菌番茄颈腐根腐病专化型(Fusarium oxysporum f.sp.radicis-lycopersici，FORL)引起，近年来新上升的一种番茄病害，发病率逐年增加病情加重，误诊或防治不及时，番茄发病率达80％以上，致死率达30％以上，造成严重减产，给种植户造成严重的经济损失(程琳等，2016)。番茄枯萎病是由尖孢镰刀菌番茄专化型(Fusarium oxysporum f.sp.lycopersici，FOL)引起的真菌性维管束病害。近年来，随着设施番茄种植面积的扩大和种植年代的增加，由番茄颈腐根腐病菌、枯萎病菌引起的土传病害连作障碍日趋严重，对番茄的产量和品质造成严重威胁，已成为设施番茄安全产业化生产的瓶颈。

迄今为止，基于镰刀菌形态学方面的分类鉴定方法很难适用于极易发生突变的镰刀菌，操作复杂并且鉴定准确度低，很容易造成误诊，贻误防治时机、影响防治效果。随着分子生物学技术的不断发展，镰刀菌属的鉴定工作也引入了分子系统学方法，常用于鉴定的主要DNA序列包括：核糖体内转录间隔区(ITS)、基因间的间隔区(IGS)、多聚半乳糖醛酸内切酶(pg1、pg2、pg5)等。因此，找到能够区分尖孢镰刀菌番茄颈腐根腐病专化型(FORL)和尖孢镰刀菌番茄专化型(FOL)病原菌的基因序列，建立一套新的分子生物学鉴定体系，能够快速、准确地鉴定尖孢镰刀菌番茄颈腐根腐病专化型或/和尖孢镰刀菌番茄专化型，该体系的建立将对番茄颈腐根腐病和枯萎病病害早期快速检测、土壤病菌群体分布及病害的防治具有重要意义。不同种类镰刀菌生物学特性不同，明确不同地区致病性镰刀菌的种类、优势种群及致病力，建立高效、快速、准确的病菌检测技术，可为其防治措施的制定奠定基础。

技术实现要素：

本发明的目的在于提供一种用于鉴定番茄颈腐根腐病和枯萎病的病原菌的引物，特异性强，检测准确性高，对番茄颈腐根腐病和枯萎病病害早期快速检测、土壤病菌群体分布及病害的防治具有重要意义。

本发明还提供了包含上述引物的试剂盒。

本发明解决其技术问题所采用的技术方案是：

一种用于鉴定番茄颈腐根腐病的病原菌的引物，所述病原菌为尖孢镰刀菌番茄颈腐根腐病专化型，所述引物序列如下：

ForL-上游引物：5’-CCTTACTCGACATTTTTCAGA-3’；

ForL-下游引物：5’-CATCAAGGCATAGTAAGAT-3’。

一种用于鉴定番茄枯萎病的病原菌的引物，所述病原菌为尖孢镰刀菌番茄专化型1号生理小种，所述引物序列如下：

For-上游引物：5’-GTATGACTCCTCTTATCATA-3’；

For-下游引物：5’-GTGGAGTGAGCTTACCGTTA-3’。

一种用于鉴定番茄颈腐根腐病的病原菌的试剂盒，所述病原菌为尖孢镰刀菌番茄颈腐根腐病专化型，包括权利要求1所述引物。

一种用于鉴定番茄枯萎病的病原菌的试剂盒，所述病原菌为尖孢镰刀菌番茄专化型1号生理小种，包括权利要求2所述引物。

一种用于同时鉴定番茄颈腐根腐病和枯萎病的病原菌的试剂盒，番茄颈腐根腐病的病原菌为尖孢镰刀菌番茄颈腐根腐病专化型，番茄枯萎病的病原菌为尖孢镰刀菌番茄专化型1号生理小种，包括盒体和6支PCR管，在2支PCR管中分别装有2×Taq PCR MasterMix和ddH₂O；在另外4支PCR管中分别装有检测尖孢镰刀菌番茄颈腐根腐病专化型的ForL-上游引物、ForL-下游引物，以及检测尖孢镰刀菌番茄专化型1号生理小种的For-上游引物、For-下游引物。

作为优选，

ForL-上游引物序列为：5’-CCTTACTCGACATTTTTCAGA-3’；

ForL-下游引物序列为：5’-CATCAAGGCATAGTAAGAT-3’；

For-上游引物序列为：5’-GTATGACTCCTCTTATCATA-3’；

For-下游引物序列为：5’-GTGGAGTGAGCTTACCGTTA-3’。

本发明的有益效果是：引物特异性强，检测准确性高，可用于尖孢镰刀菌番茄颈腐根腐病专化型、尖孢镰刀菌番茄专化型1号生理小种的检测，对番茄颈腐根腐病和枯萎病病害早期快速检测、土壤病菌群体分布及病害的防治具有重要意义。

附图说明

图1为本发明引物特异性检测样品DNA扩增后的凝胶电泳图，图中：1：尖孢镰刀菌番茄颈腐根腐病专化型；2：尖孢镰刀菌番茄专化型1号生理小种。

图2为本发明田间病株上分离菌株DNA扩增后的凝胶电泳图，图中：a：尖孢镰刀菌番茄颈腐根腐病专化型检测；b：尖孢镰刀菌番茄专化型1号生理小种检测；c：尖孢镰刀菌番茄颈腐根腐病专化型和尖孢镰刀菌番茄专化型1号生理小种同时检测。

具体实施方式

下面通过具体实施例，对本发明的技术方案作进一步的具体说明。

本发明中，若非特指，所采用的原料和设备等均可从市场购得或是本领域常用的。下述实施例中的方法，如无特别说明，均为本领域的常规方法。

本发明中所用引物均由大连宝生物技术公司合成，所有序列测定工作均由上海生物技术有限公司完成。

实施例：

一、引物设计

根据GenBank中pgx4的保守序列(GenBank编号AB256820.1、AB256830.1、AB256818.1、AB256798.1、AB256796.1、AB256797.1、AB256795.1、GU169176.1、AB256825.1)，设计简并引物FL-F(5’-GATGGTGGAACGGTATGACYC-3’，SEQ ID NO：5所示)与FL-R(5’-GATATCCTTRACACCATCACA-3’，SEQ ID NO：6所示)，扩增长度为960bp，对其片段进行克隆、测序和分析，并在960bp序列内部设计尖孢镰刀菌番茄颈腐根腐病专化型和尖孢镰刀菌番茄专化型1号生理小种特异性引物。

尖孢镰刀菌番茄颈腐根腐病专化型特异性引物序列如下：

ForL-上游引物：5’-CCTTACTCGACATTTTTCAGA-3’(SEQ ID NO：1所示)；

ForL-下游引物：5’-CATCAAGGCATAGTAAGAT-3’(SEQ ID NO：2所示)；

SEQ ID NO：1由21个碱基组成，SEQ ID NO：2由19个碱基组成，扩增片段长度为210bp。上述引物适用于尖孢镰刀菌番茄颈腐根腐病专化型PCR检测。用上述引物对待测样品进行PCR扩增，扩增产物有210bp大小的条带，则样品中含有尖孢镰刀菌番茄颈腐根腐病专化型病原菌。

尖孢镰孢刀番茄专化型1号生理小种特异性引物序列如下：

For-上游引物：5’-GTATGACTCCTCTTATCATA-3’(序列表中SEQ ID NO：3)；

For-下游引物：5’-GTGGAGTGAGCTTACCGTTA-3’(序列表中SEQ ID NO：4)。

SEQ ID NO：3由20个碱基组成，SEQ ID NO：4由20个碱基组成，扩增片段长度为455bp。上述引物适用于尖孢镰刀菌番茄专化型1号生理小种PCR检测。用上述引物对待测样品进行PCR扩增，扩增产物有455bp大小的条带，则样品中含有尖孢镰刀菌番茄专化型1号生理小种病原菌。

二、PCR检测

本步所用菌株由浙江省农科院植微所提供：尖孢镰刀菌番茄颈腐根腐病专化型和尖孢镰孢菌番茄专化型1号生理小种。

检测方法按以下步骤进行：

1、菌丝DNA的提取：用灭菌牙签从平板上刮取菌丝约0.1克，置于2.0mL离心管中，按常规CTAB法提取DNA后，分别保存，备用。

2、PCR扩增：在各PCR管中分别加入步骤1提取的各样品DNA 1μL后，再依次加入2×Taq PCR MasterMix(市售，天根生化)5μL，上下游引物各0.25μL(终浓度0.25μM)，加ddH₂O至10μL后，按PCR反应程序：94℃预变性3min，94℃50seconds，56℃退火50seconds，72℃60seconds，35个循环进行扩增，72℃延伸10min，产物4℃保存。

检测尖孢镰刀菌番茄颈腐根腐病专化型的上游引物序列为SEQ ID NO：1，下游引物序列为SEQ ID NO：2；检测尖孢镰刀菌番茄专化型1号生理小种的上游引物序列为SEQ ID NO：3，下游引物序列为SEQ ID NO：4。

3、PCR扩增产物的凝胶电泳分析：各样品分别取扩增产物10μL和由0.25％溴酚兰加40％蔗糖配制而成的上样缓冲液2μL，混匀，将混合物在1.5％琼脂糖凝胶上进行电泳分离，至溴酚兰到达凝胶的2/3位置处停止电泳，凝胶经EB染色后用凝胶成像系统进行观察、照相。

4、尖孢镰刀菌番茄颈腐根腐病专化型和尖孢镰刀菌番茄专化型1号生理小种的检测：根据凝胶电泳结果，分析判断被检测样品(见图1)：尖孢镰刀菌番茄颈腐根腐病专化型扩增出210bp条带，尖孢镰刀菌番茄专化型1号生理小种扩增出455bp条带，与预期结果相符，表明本发明的引物可用于尖孢镰刀菌番茄颈腐根腐病专化型和尖孢镰刀菌番茄专化型1号生理小种的常规PCR检测。

三、实际样品检测

本步所用菌株由浙江番茄主栽区番茄颈腐根腐病病株和枯萎病病株上分离获得的菌株。

检测方法按以下步骤进行：

1、菌丝DNA的提取：用灭菌牙签从平板上刮取菌丝约0.1克，置于2.0mL离心管中，按常规CTAB法提取DNA后，分别保存，备用；

2、PCR扩增：在各PCR管中分别加入步骤1提取的各样品DNA 1μL后，再依次加入2×Taq PCR MasterMix(市售，天根生化)5μL，上下游引物各0.25μL(终浓度0.25μM)，加ddH₂O至10μL后，按PCR反应程序：94℃预变性3min，94℃50seconds，56℃退火50seconds，72℃60seconds，35个循环进行扩增，72℃延伸10min，产物4℃保存。

检测尖孢镰刀菌番茄颈腐根腐病专化型的上游引物序列为SEQ ID NO：1，下游引物序列为SEQ ID NO：2；检测尖孢镰刀菌番茄专化型1号生理小种的上游引物序列为SEQ ID NO：3，下游引物序列为SEQ ID NO：4。

3、PCR扩增产物的凝胶电泳分析：各样品分别取扩增产物10μL和由0.25％溴酚兰加40％蔗糖配制而成的上样缓冲液2μL，混匀，将混合物在1.5％琼脂糖凝胶上进行电泳分离，至溴酚兰到达凝胶的2/3位置处停止电泳，凝胶经EB染色后用凝胶成像系统进行观察、照相。

4、尖孢镰刀菌番茄颈腐根腐病专化型和尖孢镰刀菌番茄专化型1号生理小种的检测：根据凝胶电泳结果，分析判断被检测样品(见图2)：尖孢镰刀菌番茄颈腐根腐病专化型扩增出210bp条带，尖孢镰刀菌番茄专化型1号生理小种扩增出455bp条带，与预期结果相符，表明本发明的引物可用于尖孢镰刀菌番茄颈腐根腐病专化型和尖孢镰刀菌番茄专化型1号生理小种的常规PCR检测。

也可进行多重PCR检测，同时检测尖孢镰刀菌番茄颈腐根腐病专化型和尖孢镰刀菌番茄专化型1号生理小种。

一种用于同时鉴定番茄颈腐根腐病和枯萎病的病原菌的试剂盒，番茄颈腐根腐病的病原菌为尖孢镰刀菌番茄颈腐根腐病专化型，番茄枯萎病的病原菌为尖孢镰刀菌番茄专化型1号生理小种，包括盒体和6支PCR管，在2支PCR管中分别装有2×Taq PCR MasterMix和ddH₂O；在另外4支PCR管中分别装有检测尖孢镰刀菌番茄颈腐根腐病专化型的ForL-上游引物(SEQ ID NO：1)、ForL-下游引物(SEQ ID NO：2)，以及检测尖孢镰刀菌番茄专化型1号生理小种的For-上游引物(SEQ ID NO：3)、For-下游引物(SEQ ID NO：4)。

以上所述的实施例只是本发明的一种较佳的方案，并非对本发明作任何形式上的限制，在不超出权利要求所记载的技术方案的前提下还有其它的变体及改型。

SEQUENCE LISTING

<110> 浙江省农业科学院

<120> 用于鉴定番茄颈腐根腐病和枯萎病的病原菌的引物及试剂盒

<130> 2017.02

<160> 6

<170> PatentIn version 3.3

<210> 1

<211> 21

<212> DNA

<213> 人工序列

<400> 1

ccttactcga catttttcag a 21

<210> 2

<211> 19

<212> DNA

<213> 人工序列

<400> 2

catcaaggca tagtaagat 19

<210> 3

<211> 20

<212> DNA

<213> 人工序列

<400> 3

gtatgactcc tcttatcata 20

<210> 4

<211> 20

<212> DNA

<213> 人工序列

<400> 4

gtggagtgag cttaccgtta 20

<210> 5

<211> 21

<212> DNA

<213> 人工序列

<400> 5

gatggtggaa cggtatgacy c 21

<210> 6

<211> 21

<212> DNA

<213> 人工序列

<400> 6

gatatccttr acaccatcac a 21