用于生产具有高活性脂肪酶的基因的制作方法

本发明属于生物
技术领域：
，具体涉及一种用于生产具有高活性脂肪酶的基因。
背景技术：
：aprol(rhizopusoryzaelipase)，源于rhizopusoryzae，amazon有商品化的脂肪酶基因。minningetal.(2001)采用ppicαa/p.pastorisx-33表达系统对rhizopusoryzae来源的基因并对其进行表达，发酵103h后酶活为12888u/l·h(oliveoil，在30℃ph8.1下反应)，用ppiczac/p.pastoris表达系统对其进行表达,发酵48h后酶活为110u/ml,8571u/mg(triolein，30℃ph8.1)，nativeenzyme(10000u/mg,oliveoil,ph8.5,37℃)。但该酶活性不高，影响了其商业化推广或应用。技术实现要素：为了解决上述问题，本发明的目的之一在于提供了一种用于生产具有高活性脂肪酶的基因；本发明的目的之二在于提供一种由所述基因所表达的高活性脂肪酶。本发明是通过以下技术方案来实现的：一种用于生产具有高活性脂肪酶的基因，所述基因的序列如下：一种由上述基因所表达的高活性脂肪酶，所述高活性脂肪酶的比酶活为380～430u/mg。较佳地，所述高活性脂肪酶的比酶活为409u/mg。应用上，所述高活性脂肪酶可用于增白面制品与烘焙制品，如面条、馒头等。与现有技术相比，本发明具有以下有益效果：本发明的基因所表达的脂肪酶活性高、具有开发潜力，具有广泛和实际的应用价值，如可用于面制品与烘焙制品的增白。附图说明图1是本发明线性化质粒aprol-ppiczαa的琼脂糖电泳检测，其中，线m，dl15000bpmarker；线1，线性化aprol-ppiczαa。图2是bmmy-罗丹明b平板法筛选重组子的示意图。具体的实施方式下面结合具体实施方式对本发明作进一步的详细说明，以助于本领域技术人员理解本发明。本发明用于生产具有高活性脂肪酶的基因(用aprol-ppiczαa表示)的序列如下：一、基因的表达寄主：毕赤酵母菌株x-33和gs115。当然，可表达脂肪酶基因的其他寄主都可应用至本发明。基因合成：本发明用于生产具有高活性脂肪酶的基因由上海捷瑞公司合成。1.1表达菌株构建1.1.1质粒提取参照广州东盛质粒小提试剂盒使用说明书。1.1.2重组质粒aprol-ppiczαa的线性化和回收将所得的重组质粒aprol-ppiczαa用saci进行线性化处理，37℃下酶切反应1h，反应体系如下：将酶切反应溶液混匀后放置于37℃水浴，1h后取出，用凝胶纯化回收试剂盒进行回收(参见天根胶回收试剂盒使用说明书)。1.1.3毕赤酵母菌株感受态的制备及电转化参见invitrogen的ppiczαa,b,andc用户操作手册。1.1.4结果将经酶切验证和测序验证后正确的重组质粒aprol-ppiczαa用saci进行线性化处理，酶切产物回收后用1％琼脂糖凝聚电泳进行鉴定，结果如图1所示。1.2具脂肪酶活性的转化子的筛选1.2.1初筛挑取ypds平板上生长最快的单克隆子分别点接于ypd(用于保种)和bmmy-罗丹明b平板(用于诱导)平板上，30℃倒置恒温培养3～5d；每隔24h在bmmy-罗丹明b平板的盖子上添加100μl甲醇对重组子进行诱导表达，在培养过程中，根据水解圈的相对大小选出脂肪酶酶活性最强的10个转化子，依次编号为1#，2#，3#～10#，平板筛选结果如图2所示。1.2.2复筛将选定的10个转化子分别接种含10mlbmgy液体培养基中(100ml规格摇瓶)，30℃250rpm培养至od600＝6.0；3,000g离心5min收集菌体，用2mlbmmy液体培养基重悬细胞后转移至50mlbmmy液体培养基中，使其od600＝1.0；30℃250rpm继续诱导培养，每隔24h添加一次甲醇使其终浓度为0.5％，48h后开始取样测酶活性，取样时间点为48h、72h、96h、120h，所取样品在3,000g离心3min后收集上清，采用滴定法测脂肪酶酶活性，确定活性最高的转化子及其诱导条件。1.2.3结果选取初筛获得的脂肪酶活性较高的10个转化子进一步进行筛选，观察其三角瓶水平的表达情况，采用碱性滴定法测定发酵液上清中的脂肪酶活性，aprol-ppiczαa的酶活测定结果见表1。表1摇床水平三角瓶中各转化子的脂肪酶酶活性诱导时间(h)aprol-ppiczαa酶活性(u/ml)487072759685120851.3脂肪酶活力测定本实验采用碱式滴定法测定脂肪酶活力。1.3.1原理脂肪酶在一定条件下，能使甘油三脂水解成脂肪酸、甘油二酯、甘油单脂和甘油，所释放的脂肪酸可用标准碱溶液进行中和滴定，用ph计或酚肽指示液指示反应终点，根据消耗的碱量，计算其酶活力。反应式为：rcooh+naoh→rcoona+h2o1.3.2操作步骤1)取两个50ml三角瓶，分别于空白管(a)和样品管(b)中各加入底物溶液4.00ml橄榄油乳化液(橄榄油：pva＝1:3，v/v)和5.00ml磷酸缓冲液(100mm,ph7.0),再于a管中加入95％乙醇15.00ml，于40℃水浴中预热5min，然后于a、b管中各加待测酶液1.00ml，立即混匀计时，于40℃水浴中准确反应10min，于b管中立即补加95％乙醇15.0ml终止反应，取出；2)于空白和样品溶液中各加酚肽指示液2滴，用50mmnaoh标准溶液滴定，直至微红色并保持30s不褪色为滴定终点，记录消耗50mmnaoh标准溶液的体积。1.3.3酶活计算酶活定义:1g固体酶粉(或1ml液体酶)，在40℃温度和ph7.0条件下，1min水解橄榄油(oliveoil)产生1μmol的可滴定的脂肪酸，即为1个酶活力单位，以u/g(u/ml)表示。计算方法：脂肪酶制剂的酶活力按下式计算x1＝(v1-v2)*c*50*n1/0.05*1/10式中：x1-----样品的酶活力，u/g(u/ml)v1----滴定样品时消耗氢氧化钠标准溶液的体积,单位为毫升(ml)；v2----滴定空白时消耗氢氧化钠标准溶液的体积,单位为毫升(ml)c----氢氧化钠标准溶液浓度，单位为摩尔每升(mol/l)；50---0.05mol/l氢氧化钠溶液1.00ml相当于脂肪酸50μmol；n1----样品的稀释倍数；0.05----氢氧化钠标准溶液浓度换算系数；1/10----反应时间10min,以1min计。所得结果表示至整数。1.3.4结果对比例：lbk-b4000(馒头专用脂肪酶，绿微康)：46.5mg蛋白/g粉末(蛋白含量4.65％)；cal-b(用于有机合成，novozymes)：9.24mg蛋白/ml原酶液(蛋白含量0.924％)。各脂肪酶酶学特性的比较如表2所示名称特性比酶活(u/mg)(oliveoil)lbk-b4000282.61cal-b1.84aprol-ppiczαa409由表2可知：aprol-ppiczαa的比酶活要高于lbk-b4000的1.7倍；cal-b的水解活力最低，只有1.84u/mg，主要用于有机合成反应。在比酶活方面，我们在研究的脂肪酶aprol-ppiczαa具有开发潜力。制得注意的是，脂肪酶的酶活测定采用的是naoh滴定法，不同的人对显色反应评判的尺度不一样，进行酶活测定时得到的结果会有一定的差别。如：馒头专用脂肪酶lbk-b4000，化验室所测酶活16346u/g粉末(比活为355.35u/mg蛋白)，本实验所测酶活为13000u/g粉末(比活为282.61u/mg蛋白)。二、应用通过将本发明的基因aprol-ppiczαa在酵母上高效表达后获得高活性的脂肪酶，再通过现有的配方优化获得了两个样品fnl-25000与fsl-20000，能分别被应用于面制品与烘焙制品的增白。其中，将脂肪酶优化以适用于面制品或烘焙制品中属于现有技术，在此不再赘述。2.1脂肪酶fnl-25000面条增白效果实验2.1.1、实验目的测试脂肪酶fnl-25000在白盐面条中的增白效果2.1.2实验主要原料面粉：山东中筋基础粉脂肪酶：fnl-250002.1.3实验配方及工艺表3、面条配方原料用量/g面粉100食盐1水33面条工艺：加水和面；松弛；压面机压面；整型，制成面条和面片。2.1.4实验结果表4、fnl-25000测试结果从上表可知，随着fnl-25000浓度的增加，面条和面片白度依次递增。2.1.5实验结论以山东中筋基础粉为面粉原料，添加脂肪酶fnl-25000，面条白度明显增加，添加量越大，面条白度越大。2.2脂肪酶fsl-20000馒头增白效果实验2.2.1、实验目的测试脂肪酶fsl-20000在北方馒头中增白效果2.2.2实验主要原料面粉：山东中筋基础粉；河北中筋基础粉脂肪酶：fsl-200002.2.3实验配方及工艺表5、馒头配方原料用量/g面粉100酵母0.8水462.2.4馒头工艺加水和面→压面机压面→手工搓圆→醒发→蒸煮2.2.5实验结果表6、fsl-20000测试结果山东中筋基础粉及河北中筋基础粉随着fsl-20000添加浓度的增加，馒头表皮白度依次增加。2.2.6结论以山东中筋基础粉和河北中筋基础粉为面粉原料，添加了脂肪酶fsl-20000，馒头表皮白度明显增加，随着添加量的增加，馒头表皮白度呈上升趋势。申请人：东莞泛亚太生物科技有限公司发明名称：用于生产具有高活性脂肪酶的基因序列特征：用于生产具有高活性脂肪酶的基因的基因全序列序列描述：gaattcgacgacaatttggtcggtggaatgaccttggacttgccttctgatgcccctcctatttctttgtctggttctacaaattctgcttctgacggaggaaaggttgttgctgctactactgcccagatccaggagttcactaaatacgctggtattgcagccacagcctattgtagatctgttgtcccaggaaataagtgggactgcgtccagtgccagaagtgggttccagacggtaagatcattaccacattcacctctttgttgtctgacaccaatggatacgtcttgagatctgacaagcaaaaaactatttacttggtcttcagaggaactaactcttttagatctgcaatcaccgacatcgttttcaacttttctgactataagccagtcaaaggagccaaggttcatgctggattcttgtcttcttacgaacaagtcgtcaacgactactttccagtcgttcaggagcagttgaccgcaaacccaacatacaaggttattgtcaccggacactctttgggaggtgctcaggcattgttggcaggtatggatttgtatcaaagagagcctagattgtctcctaagaacttgtctatcttcaccgttggaggtcctagagtcggaaaccctaccttcgcatactatgttgagtctacaggaatcccattccagagaaccgtccacaaaagagacattgttccacacgttcctccacagtctttcggatttttgcacccaggtgtcgaatcttggatcaagtctggtacttctaacgtccaaatctgcacctctgagatcgaaaccaaggattgctctaattctatcgttcctttcacatctttgttggaccatttgtcttactttgacatcaacgaaggttcttgcttgtaagcggccgc。当前第1页12