天山堇菜中具有二聚哌啶类Ⅲ和Ⅳ型骨架的生物碱化合物及制备方法与流程

本发明涉及一种天山堇菜中具有二聚哌啶类ⅲ型和ⅳ型骨架的生物碱化合物及制备方法。

背景技术：

天山堇菜为堇菜科(violaceae)堇菜属(viola)植物天山堇菜(violatianshanica)的干燥全草。《保健药园》中也称比乃非谢吉。分布于我国新疆天山、昆仑山、帕米尔高原，云南、四川、西藏，中亚地区亦有分布，是维吾医药中常用药物。天山堇菜为多年生草本；其形态特征：根茎多粗短，主根圆柱状或倒长圆锥形，黄白或淡棕色；叶基生，叶片卵状或长圆状卵形，先端钝，全缘或具圆齿，具短腺毛；花单生于花梗顶端，花梗稍超出根生叶或等长，花瓣5枚，倒卵形，白色具淡紫色条纹。干燥药材多皱缩；粗短根茎(2-4mm)具环纹及叶柄残基；粗壮主根(0.5-2cm)灰白色至浅黄褐色；花灰蓝色。天山堇菜收录于：《中华本草》、《维吾尔药志》、《中华人民共和国卫生部药品标准·维吾尔药分册》、《维吾尔药材标准》。《中华本草》中记载的功能与主治：生湿生寒，清热解毒，消炎退烧，润肺消肿，润喉止咳，通利二便；主治干热性或胆液质性疾病，如发热发烧，干热性头痛及急性胸膜炎，肺炎，咽干咳嗽，二便不利等。《白色宫殿》中记载用于治疗血液性质头痛、眼病，热性咳嗽，胸膜炎、肺炎，尿少便秘等。《拜地依药书》中记载用于治疗体外热性炎肿，热性胃炎、肝炎，白喉，小儿癫痫，热性头痛，皮肤瘙痒等。

天山堇菜的药理学研究较少，现代药理学研究表明天山堇菜具有抗炎作用，抗氧化活性，抗菌活性。同属的其他植物研究比较多，有抗乙型肝炎活性，免疫抑制活性，抗炎活性，抑制哮喘作用，细胞毒活性，抗饮食性肥胖，抗凝血活性，抗疟原虫活性，杀菌活性，降压降脂活性，肌松弛及镇静催眠活性，胶原酶抑制活性，促胃肠运动及泻下作用，退烧及抗惊厥活性，抗氧化活性，改善慢性失眠作用，酪氨酸酶及胆碱酯酶抑制活性等。

天山堇菜的化学成分研究较少，已报道了4个苯丙素类化合物；同属其他植物的化学成分报道较多，有三萜及其皂苷，倍半萜，香豆素，双香豆素，黄酮，水杨酸衍生物，苯丙素类，醌类，环多肽等。

本发明对天山堇菜的生物碱成分进行的充分的分析分离研究，从中获得了全新的二聚哌啶类的新骨架(ⅲ)及其对应的生物碱化合物1天山堇宁a，化合物2天山堇宁b，以及二聚哌啶类的新骨架(ⅳ)其对应的生物碱化合物3天山堇啶。

技术实现要素：

本发明目的在于，提供一种天山堇菜中具有二聚哌啶类ⅲ和ⅳ型骨架的生物碱化合物及制备方法，该化合物1为天山堇宁a，化合物2为天山堇宁b，化合物3为天山堇啶；该方法采用甲醇溶剂进行提取，通过酸溶碱沉法制得总碱，通过两相溶剂分配法得到上相部位，再利用葡聚糖凝胶色谱法以及正反相色谱法分离得到ⅲ和ⅳ型新骨架生物碱化合物1为天山堇宁a，化合物2为天山堇宁b，化合物3为天山堇啶。

本发明所述的一种天山堇菜中具有二聚哌啶类ⅲ和ⅳ型骨架的化合物，该化合物为天山堇宁a、天山堇宁b和天山堇啶，结构式为：

其中式ⅲ为二聚哌啶类ⅲ型骨架；1为二聚哌啶类骨架ⅲ型所对应的化合物天山堇宁a；2为二聚哌啶类骨架ⅲ型所对应的化合物天山堇宁b；式ⅳ为二聚哌啶类ⅳ型骨架；3为二聚哌啶类骨架ⅳ型所对应的化合物天山堇啶。

所述天山堇菜中具二聚哌啶ⅲ和ⅳ型骨架的化合物的制备方法，按下列步骤进行：

a、将天山堇菜全草粉碎，用无水甲醇溶剂冷浸回流、渗漉、超声或微波提取2-10次，合并提取液并干燥，得到总提取物；

b、将步骤a中的总提取物用氯仿溶解，用水进行萃取，收集氯仿层并干燥得氯仿部位，再将氯仿部位用0.5n的硫酸溶解过滤，收集滤液，滤液用乙酸乙酯萃取以去除非生物碱杂质，去杂质的滤液用饱和碳酸氢钠水溶液调ph至10-14，得到碱化液；

c、将步骤b中的碱化液用二氯甲烷充分萃取并干燥，得到总生物碱；

d、将步骤c中的总生物碱用体积比5:5:5:5-1:5:1:5的正己烷:乙酸乙酯:甲醇:水的两相溶剂系统进行分配，收集上相有机相，干燥得到上相部位，再将上相部位进行正相硅胶柱层析分段分离，以体积比100:0，85:15，70:30，55:45的环己烷:乙酸乙酯为洗脱溶剂进行梯度洗脱，得到4个部位为v100，v85，v70和v55；

e、将步骤d中的v70部位以无水甲醇为溶剂，经葡聚糖凝胶lh-20分离得到v70-1组分，将v70-1组分利用反相色谱柱：ymcpydrospherec185μm10×250mm；溶剂：浓度为34％的乙腈水溶液；流速：4.0ml/min进行分离，分别收集并干燥2.5分钟至6.5分钟的流份(v70-1-1)，18.5分钟至19.5分钟的流份(v70-1-6)，以及20分钟至21分钟的流份(v70-1-7)，再将流份v70-1-1继续用反相色谱柱：ymcpydrospherec185μm10×250mm；溶剂：浓度为37％的甲醇水溶液；流速：3.1ml/min进行纯化，收集50至53分钟的流份，干燥即得化合物3天山堇啶；将流份v70-1-6继续用反相色谱柱：ymcpydrospherec185μm10×250mm；溶剂：浓度为59％的甲醇水溶液；流速：2.8ml/min进行纯化，收集21.5至23分钟的流份，干燥即得化合物2天山堇宁b，将流份v70-1-7继续用反相色谱柱：ymcpydrospherec185μm10×250mm；溶剂：浓度为52.8％的甲醇水溶液；流速：4.0ml/min进行纯化，收集31.5至33.5分钟的流份，干燥即得化合物1天山堇宁a。

本发明所述的天山堇菜中具有二聚哌啶类ⅲ和ⅳ型骨架的生物碱化合物及制备方法，其中具有二聚哌啶类ⅲ型骨架的生物碱化合物1和化合物2的结构鉴定：

化合物1：命名为天山堇宁a；白色无定形粉末，uv(meoh)λmax(logε)305(2.08)nm，200(3.95)nm；hr-esi(+)ms：[m+h]⁺331.2038；分子式：c19h26n2o3；¹h和¹³c核磁数据见表1；经hmbc相关谱解析确定化合物结构如图1所示。

化合物2：命名为天山堇宁b；白色无定形粉末，uv(meoh)λmax(logε)295(4.28)nm；hr-esi(+)ms：[m+h]⁺315.2084；分子式：c19h26n2o2；¹h和¹³c核磁数据见表1；经hmbc相关谱解析确定化合物结构如图1所示。

具有二聚哌啶类ⅳ型骨架的生物碱化合物3的结构鉴定：

化合物3：命名为天山堇啶；黄色无定形粉末，uv(meoh)λmax(logε)461(2.20)nm，255(3.56)nm；hr-esi(+)ms：[m+h]⁺356.2344；分子式：c21h29n3o2；¹h和¹³c核磁数据见表1；经hmbc相关谱解析确定化合物结构如图1所示。

表1.生物碱化合物1，2和3的氢碳核磁数据

附图说明

图1为本发明生物碱化合物1，2和3的hmbc相关解析图；

图2为本发明生物碱化合物1的¹h-nmr图；

图3为本发明生物碱化合物1的¹³c-nmr图；

图4为本发明生物碱化合物1的hmbc核磁图；

图5为本发明生物碱化合物1的高分辨质谱图；

图6为本发明生物碱化合物2的¹h-nmr图；

图7为本发明生物碱化合物2的¹³c-nmr图；

图8为本发明生物碱化合物2的hmbc核磁图；

图9为本发明生物碱化合物2的高分辨质谱图；

图10为本发明生物碱化合物3的¹h-nmr图；

图11为本发明生物碱化合物3的¹³c-nmr图。

图12为本发明生物碱化合物3的hmbc核磁图；

图13为本发明生物碱化合物3的高分辨质谱图。

具体实施方式

实施例1

a、将粉碎的天山堇菜全草粉末9.5kg，加入20升无水甲醇溶液室温浸泡24小时，重复提取10次，合并提取液并干燥，得到总提物1.5kg；

b、将步骤a中的总提物用4升氯仿溶解，加入4升水萃取，收集氯仿层并干燥得到氯仿部位，再将氯仿部位用2升0.5n的硫酸溶解，过滤，收集滤液，滤液用乙酸乙酯萃取去除非生物碱杂质，去杂质后的酸水液用饱和碳酸氢钠水溶液调ph10，得到碱化液；

c、将步骤b中的碱化液用二氯甲烷充分萃取并干燥得到总生物碱70克；

d、将步骤c中的总生物碱用体积比3:5:3:5的正己烷:乙酸乙酯:甲醇:水的两相溶剂系统进行分配，收集上相有机相，干燥得到上相部位47克，再将上相部位进行正相硅胶(100-200目)柱层析分段分离，以体积比100:0，85:15，70:30，55:45的环己烷:乙酸乙酯为洗脱溶剂进行梯度洗脱，得到4个部位为v100，v85，v70和v55；

e、将步骤d中的v70部位以无水甲醇为溶剂，经葡聚糖凝胶lh-20分离得到v70-1组分，将v70-1组分利用反相色谱柱：ymcpydrospherec185μm10×250mm；溶剂：浓度为34％的乙腈水溶液；流速：4.0ml/min进行分离，分别收集并干燥2.5分钟至6.5分钟的流份(v70-1-1)，18.5分钟至19.5分钟的流份(v70-1-6)，以及20分钟至21分钟的流份(v70-1-7)，将流份v70-1-1继续用反相色谱柱：ymcpydrospherec185μm10×250mm；溶剂：浓度为37％的甲醇水溶液；流速：3.1ml/min进行纯化，收集50至53分钟的流份，干燥即得化合物3天山堇啶；将流份v70-1-6继续用反相色谱柱：ymcpydrospherec185μm10×250mm；溶剂：浓度为59％的甲醇水溶液；流速：2.8ml/min进行纯化，收集21.5至23分钟的流份，干燥既得化合物2天山堇宁b；再将流份v70-1-7继续用反相色谱柱：ymcpydrospherec185μm10×250mm；溶剂：浓度为52.8％的甲醇水溶液；流速：4.0ml/min进行纯化，收集31.5至33.5分钟的流份，干燥既得化合物1天山堇宁a。

实施例2

a、将粉碎的天山堇菜全草粉末9.5kg，加入20升无水甲醇回流4小时，重复提取6次，合并提取液并干燥，得到总提物2.0kg；

b、将步骤a中的总提物用4升氯仿溶解，加入4升水萃取，收集氯仿层并干燥得到氯仿部位，再将氯仿部位用2升0.5n的硫酸溶解，过滤，收集滤液，滤液用乙酸乙酯萃取去除非生物碱杂质，去杂质后的酸水液用饱和碳酸氢钠水溶液调ph至11，得到碱化液；

c、将步骤b中的碱化液用二氯甲烷充分萃取并干燥得到总生物碱77克；

d、将步骤c中的总生物碱用体积比5:5:5:5的正己烷:乙酸乙酯:甲醇:水的两相溶剂系统进行分配，收集上相有机相，干燥得到上相部位32克，再将上相部位进行正相硅胶(100-200目)柱层析分段分离，以体积比100:0，85:15，70:30，55:45的环己烷:乙酸乙酯为洗脱溶剂进行梯度洗脱，得到4个部位为v100，v85，v70和v55；

e、将步骤d中的v70部位以无水甲醇为溶剂，经葡聚糖凝胶lh-20分离得到v70-1组分，将v70-1组分利用反相色谱柱：ymcpydrospherec185μm10×250mm；溶剂：浓度为34％的乙腈水溶液；流速：4.0ml/min进行分离，分别收集并干燥2.5分钟至6.5分钟的流份(v70-1-1)，18.5分钟至19.5分钟的流份(v70-1-6)，以及20分钟至21分钟的流份(v70-1-7)，将流份v70-1-1继续用反相色谱柱：ymcpydrospherec185μm10×250mm；溶剂：浓度为37％的甲醇水溶液；流速：3.1ml/min进行纯化，收集50至53分钟的流份，干燥即得化合物3天山堇啶；将流份v70-1-6继续用反相色谱柱：ymcpydrospherec185μm10×250mm；溶剂：浓度为59％的甲醇水溶液；流速：2.8ml/min进行纯化，收集21.5至23分钟的流份，干燥既得化合物2天山堇宁b；再将流份v70-1-7继续用反相色谱柱：ymcpydrospherec185μm10×250mm；溶剂：浓度为52.8％的甲醇水溶液；流速：4.0ml/min进行纯化，收集31.5至33.5分钟的流份，干燥既得化合物1天山堇宁a。

实施例3

a、将粉碎的天山堇菜全草粉末9.5kg，加入20升无水甲醇溶液渗漉24小时，重复提取8次，合并提取液并干燥，得到总提物1.7kg；

b、将步骤a中的总提取物用4升氯仿溶解，加入4升水进行萃取，收集氯仿层并干燥得氯仿部位，再将氯仿部位用0.5n的硫酸溶解，过滤，收集滤液，滤液用乙酸乙酯萃取以去除非生物碱杂质，去杂质的滤液用饱和碳酸氢钠水溶液调ph至12，得到碱化液；

c、将步骤b中的碱化液用二氯甲烷充分萃取并干燥，得到总生物碱72克；

d、将步骤c中的总生物碱用体积比1:5:1:5的正己烷:乙酸乙酯:甲醇:水的两相溶剂系统进行分配，收集上相有机相，干燥得到上相部位55克，再将上相部位进行正相硅胶(100-200目)柱层析分段分离，以体积比100:0，85:15，70:30，55:45的环己烷:乙酸乙酯为洗脱溶剂进行梯度洗脱，得到4个部位为v100，v85，v70和v55；

e、将步骤d中的v70部位以无水甲醇为溶剂，经葡聚糖凝胶lh-20分离得到v70-1组分，将v70-1组分利用反相色谱柱：ymcpydrospherec185μm10×250mm；溶剂：浓度为34％的乙腈水溶液；流速：4.0ml/min进行分离，分别收集并干燥2.5分钟至6.5分钟的流份(v70-1-1)，18.5分钟至19.5分钟的流份(v70-1-6)，以及20分钟至21分钟的流份(v70-1-7)，将流份v70-1-1继续用反相色谱柱：ymcpydrospherec185μm10×250mm；溶剂：浓度为37％的甲醇水溶液；流速：3.1ml/min进行纯化，收集50至53分钟的流份，干燥即得化合物3天山堇啶；将流份v70-1-6继续用反相色谱柱：ymcpydrospherec185μm10×250mm；溶剂：浓度为59％的甲醇水溶液；流速：2.8ml/min进行纯化，收集21.5至23分钟的流份，干燥既得化合物2天山堇宁b；再将流份v70-1-7继续用反相色谱柱：ymcpydrospherec185μm10×250mm；溶剂：浓度为52.8％的甲醇水溶液；流速：4.0ml/min进行纯化，收集31.5至33.5分钟的流份，干燥既得化合物1天山堇宁a。

实施例4

a、将粉碎的天山堇菜全草粉末9.5kg，加入20升无水甲醇超声3小时，重复提取4次，合并提取液并干燥，得到总提物1.55kg；

b、将步骤a中的总提取物用4升氯仿溶解，加入4升水进行萃取，收集氯仿层并干燥得氯仿部位，再将氯仿部位用0.5n的硫酸溶解过滤，收集滤液，滤液用乙酸乙酯萃取以去除非生物碱杂质，去杂质的滤液用饱和碳酸氢钠水溶液调ph至13，得到碱化液；

c、将步骤b中的碱化液用二氯甲烷充分萃取并干燥，得到总生物碱64克；

d、将步骤c中的总生物碱用体积比2:5:2:5的正己烷:乙酸乙酯:甲醇:水的两相溶剂系统进行分配，收集上相有机相，干燥得到上相部位49克，再将上相部位进行正相硅胶(100-200目)柱层析分段分离，以体积比100:0，85:15，70:30，55:45的环己烷:乙酸乙酯为洗脱溶剂进行梯度洗脱，得到4个部位为v100，v85，v70和v55；

e、将步骤d中的v70部位以无水甲醇为溶剂，经葡聚糖凝胶lh-20分离得到v70-1组分，将v70-1组分利用反相色谱柱：ymcpydrospherec185μm10×250mm；溶剂：浓度为34％的乙腈水溶液；流速：4.0ml/min进行分离，分别收集并干燥2.5分钟至6.5分钟的流份(v70-1-1)，18.5分钟至19.5分钟的流份(v70-1-6)，以及20分钟至21分钟的流份(v70-1-7)，将流份v70-1-1继续用反相色谱柱：ymcpydrospherec185μm10×250mm；溶剂：浓度为37％的甲醇水溶液；流速：3.1ml/min进行纯化，收集50至53分钟的流份，干燥即得化合物3天山堇啶；将流份v70-1-6继续用反相色谱柱：ymcpydrospherec185μm10×250mm；溶剂：浓度为59％的甲醇水溶液；流速：2.8ml/min进行纯化，收集21.5至23分钟的流份，干燥既得化合物2天山堇宁b；再将流份v70-1-7继续用反相色谱柱：ymcpydrospherec185μm10×250mm；溶剂：浓度为52.8％的甲醇水溶液；流速：4.0ml/min进行纯化，收集31.5至33.5分钟的流份，干燥既得化合物1天山堇宁a。

实施例5

a、将粉碎的天山堇菜全草粉末9.5kg，加入20升无水甲醇微波1小时，重复提取2次，合并提取液并干燥，得到总提物1.1kg；

b、将步骤a中的总提取物用4升氯仿溶解，加入4升水进行萃取，收集氯仿层并干燥得氯仿部位，再将氯仿部位用0.5n的硫酸溶解过滤，收集滤液，滤液用乙酸乙酯萃取以去除非生物碱杂质，去杂质的滤液用饱和碳酸氢钠水溶液调ph至14，得到碱化液；

c、将步骤b中的碱化液用二氯甲烷充分萃取并干燥，得到总生物碱48克；

d、将步骤c中的总生物碱用体积比4:5:4:5的正己烷:乙酸乙酯:甲醇:水的两相溶剂系统进行分配，收集上相有机相，干燥得到上相部位25克，再将上相部位进行正相硅胶(100-200目)柱层析分段分离，以体积比100:0，85:15，70:30，55:45的环己烷:乙酸乙酯为洗脱溶剂进行梯度洗脱，得到4个部位为v100，v85，v70和v55；

e、将步骤d中的v70部位以无水甲醇为溶剂，经葡聚糖凝胶lh-20分离得到v70-1组分，将v70-1组分利用反相色谱柱：ymcpydrospherec185μm10×250mm；溶剂：浓度为34％的乙腈水溶液；流速：4.0ml/min进行分离，分别收集并干燥2.5分钟至6.5分钟的流份(v70-1-1)，18.5分钟至19.5分钟的流份(v70-1-6)，以及20分钟至21分钟的流份(v70-1-7)，将流份v70-1-1继续用反相色谱柱：ymcpydrospherec185μm10×250mm；溶剂：浓度为37％的甲醇水溶液；流速：3.1ml/min进行纯化，收集50至53分钟的流份，干燥即得化合物3天山堇啶；将流份v70-1-6继续用反相色谱柱：ymcpydrospherec185μm10×250mm；溶剂：浓度为59％的甲醇水溶液；流速：2.8ml/min进行纯化，收集21.5至23分钟的流份，干燥既得化合物2天山堇宁b；再将流份v70-1-7继续用反相色谱柱：ymcpydrospherec185μm10×250mm；溶剂：浓度为52.8％的甲醇水溶液；流速：4.0ml/min进行纯化，收集31.5至33.5分钟的流份，干燥既得化合物1天山堇宁a。