本发明属于分离工程
技术领域：
：，具体涉及到一种快速高效提取发酵液中活性抗菌物质hsaf的方法。
背景技术：
：：生物农药是指利用生物活体、生物代谢产物或生物特定基因而制成的农药，目前研发和应用较多的有农用抗生素(井冈霉素、阿维菌素等)、微生物农药(苏云金杆菌、假单胞菌等)、植物源农药(苦参碱、除虫菊素等)等。其具有低毒、低残留、不易产生抗药性等优点，为农业可持续发展提供了非常重要的研究方向，具有广阔的前景。lysobacterenzymogenes是一种新型的生防细菌，可以分泌多种胞外酶以及各类次生代谢产物，对多种真菌均具有很好的防治效果，且对部分细菌、线虫等也具有抑制效果。其中一种重要的次生代谢产物-热稳定抗真菌因子(heatstableantifungalfactor,hsaf)，其具有热稳定性高(>300℃)、抗菌谱广(真菌、卵菌、细菌、单细胞藻类和线虫等)及毒性低(>5mg/ml才对人体肝脏细胞有毒性)等特点。其结构由一个独特的大环内酰胺体系、一个四胺酸结构单元和5,5,6-三环骨架组成这一新颖结构不同于目前市场上任何一种杀真菌剂。除此，hsaf对病原真菌的作用方式也与目前已报道的商用杀真菌剂截然不同，它主要是通过抑制病原菌神经酰胺合成酶活性，改变丝状真菌细胞膜中的鞘脂类化合物的组成，从而影响真菌菌丝的极性生长。综上所述，hsaf可以代表一类化学结构新颖、作用方式独特，对环境友好的生物杀菌剂或抗菌药物。目前，对于发酵液hsaf的提取主要采用有机溶剂萃取法。由于发酵液中各种代谢产物，如蛋白质、糖类的存在，使系统极易出现乳化现象，导致相分离困难，产品损失严重。一般采用多次反复萃取的策略，虽然能够回收更多的目的产物，但费时费力，而且增加了生产工序，使生产效率大大降低，给hsaf的实验室研究和工业化生产带来了极大的困难。因此，开发一种高效提取发酵液中hsaf的方法具有十分重要的现实意义。技术实现要素：本发明目的在于提供一种快速高效提取发酵液中活性抗菌物质hsaf的方法。为实现上述目的，本发明采取的技术方案为：一种快速高效提取发酵液中活性抗菌物质hsaf的方法，包括以下步骤：(1)发酵液酸化；(2)加入惰性物质；(3)加入乙酸乙酯，涡旋混合振荡萃取；(4)离心、吸取上清液提取hsaf。本发明步骤(1)所述的发酵液可以为任何hsaf生产菌株发酵产生的的发酵液，优选的，为产酶溶杆菌lysobacterenzymogenesoh11发酵得到的，优选的具体发酵过程为：将活化的菌株oh11接入到lb液体培养基中28℃、180rpm培养12-15h，按照1.0-2.5％接种量转入发酵培养基中，28℃、150-200rpm培养48-60h。所述的发酵培养基成分为：黄豆粉：8g/l、葡萄糖：8g/l、cacl2：0.7g/l。所述的发酵液中hsaf含量通过hplc检测，含量为250-400mg/l。本发明步骤(1)发酵液可以选用任意实验室中常用于调节ph的酸来进行酸化，如浓盐酸、浓硫酸等；本发明中步骤(1)发酵液酸化至ph2.0-5.0，优选酸化ph至3.0-4.5。本发明步骤(2)所述的惰性物质为溶于水而不溶于乙酸乙酯的无机盐，优选为nacl、cacl2、mgcl2或na2so4中的任意一种或者几种的组合；更优选的为cacl2或nacl或二者的组合；本发明通过惰性物质的加入，能显著降低乙酸乙酯在发酵液中的溶解度，使乙酸乙酯从发酵液中游离出来，并伴随着hsaf从发酵液中转移到乙酸乙酯中，实现hsaf的分离；在整个过程中，因不存在稳定、大量的传质界面，故破坏了乳化形成的基本条件，有效地克服了乳化问题。本发明步骤(2)所述的惰性物质的单位为g，发酵液体积的单位为ml，惰性物质添加量与发酵液体积的比为(0.1-0.3)g：1ml；优选(0.15-0.25)g：1ml；更优选的(0.15-0.20)g：1ml。惰性物质添加量低于此范围时，破乳效果不佳。本发明步骤(3)选用乙酸乙酯做萃取剂，萃取效率高，且易分层；优选乙酸乙酯与发酵液体积比为0.5-1.5:1，更优选0.8-1.2:1。乙酸乙酯与发酵液体积比在此范围内，可以提高萃取效率。本发明步骤(3)中选用涡旋混合振荡处理，有机溶剂和发酵液接触更充分，萃取时间大大缩短，可以将萃取时间缩短至2min以内，优选的振荡条件为1000-2500rpm，0.5-2min；更优选1500-2000rpm，1-1.5min。本发明步骤(4)中是在常温5000-8000rpm离心5-10min，使乙酸乙酯与水相分成两层，吸取上清液即得到hsaf的乙酸乙酯溶液，蒸干后可得hsaf产品；若为了获得高纯度的hsaf，可将蒸干后获得的hsaf产品溶于甲醇溶液，通过hplc制备柱收集馏分，干燥后即得hsaf高纯度产品。本发明还可以通过hplc对乙酸乙酯溶液中的hsaf含量进行检测，即可知萃取液中hsaf的含量及发酵液中hsaf产量。与现有技术相比，本发明具有如下显著优点：(1)本发明中添加的惰性物质能够有效破除萃取过程中产生的乳化问题，从而提高目的产物的萃取效率。(2)本发明操作方便、工艺简单，利用混合振荡处理，萃取时间可缩短至2min以内，甚至仅需1min，与一般工艺(2h)比较，大大缩短了萃取时间，提高了生产效率。(3)本发明选用乙酸乙酯做萃取剂，萃取效率高，且易分层。(4)本发明萃取效率高，可使第一次萃取效率达到86.8％以上。附图说明图1不同有机溶剂萃取发酵液中hsaf过程的现象；图2添加惰性物质时hsaf萃取过程的现象。具体实施方式根据下述实施例，可以更好地理解本发明。然而，本领域的技术人员容易理解，实施例所描述的内容仅用于说明本发明，而不应当也不会限制权利要求书中所详细描述的本发明。以下实施例所用的l.enzymogenesoh11发酵液的准备：种子液准备：划取一满环菌体于50mllb培养液中，28℃下200rpm振荡培养12h至od600＝1.5，即得到种子液。发酵培养：按照配方(黄豆粉8g/l、葡萄糖8g/l、cacl20.7g/l)配制1l培养基，以每瓶100ml分装于500ml三角瓶中，121℃灭菌15min，冷却备用。将准备好的种子液按照1.5％的接种量接入发酵培养基中，于28℃、180rpm下培养48h即得到所需的发酵液。以下实施例所使用的发酵液都是用本实施的方法发酵得到的。实施例1：不同有机溶剂对发酵液中hsaf萃取的影响吸取发酵液3ml至15ml离心管中，滴加浓盐酸至ph为3.0；向混合液中添加3ml有机溶剂(表1)；置于漩涡混合振荡器上2000rpm反应1min，使有机溶剂与发酵液充分接触；8000rpm下离心5min，使发酵液与有机溶剂分成两相，上清即为hsaf有机溶剂层，吸取1ml吹干加入500μl甲醇溶解后通过hplc对其含量进行检测。检测条件为：反相柱：intersustainswiftc185μm,250×4.6mm，流动相：溶液a(0.025％tfa水溶液)和溶液b(0.025％tfa乙腈溶液)，流速：1ml/min；进样量为20μl，紫外吸收值：318nm；进样程序：0-10min，将溶液b从5％至25％；25min，增长到80％b；26min，增长到100％；30min返回到5％，溶液a和b总比例为100％；记录峰面积，通过制定的hsaf浓度与峰面积间的线性方程为y＝4e-05x+12.46，r2＝0.9996来计算乙酸乙酯中hsaf的含量。由图1和表1可知，醇类溶剂与发酵液发酵互溶，不能分层；而使用密度较大的溶剂，如二氯甲烷使有机相在下层，不易吸取有机相，且二氯甲烷中hsaf浓度较低；添加乙酸丁酯，虽然乳化层较少，但萃取效率极低，而且很难吹干；而添加本发明所述的乙酸乙酯时，即使产生了乳化层，但乙酸乙酯中hsaf浓度能到达到322.8mg/l，由此可见，采用本发明所述的乙酸乙酯，可以大大提高萃取效率。表1有机溶剂对hsaf萃取效率的影响实施例2：添加cacl2破除乳化提取发酵液中hsaf吸取发酵液3ml至15ml离心管中，滴加浓盐酸至ph为3.5；投放0.5gcacl2后，轻轻摇晃使其充分溶解；向混合液中添加3ml乙酸乙酯溶剂；置于漩涡混合振荡器上2000rpm反应1min，使萃取剂与发酵液充分接触；8000rpm下离心5min，使有机相与水相分层，吸取上清即为hsaf萃取液，通过hplc对其含量进行检测，其他条件同实施例1。由图2和表2可知，cacl2可有效破除萃取过程中产生的乳化现象，并且能够提高萃取液中hsaf的含量(336.8mg/l)。同时，以充分萃取后得到的hsaf含量为发酵液中hsaf总量(通过三次萃取至发酵液中不再产生hsaf为止，每次萃取液中hsaf含量为336.8mg/l，36.3mg/l，5.7mg/l，对应的体积分别为2.8ml，3ml，3ml。与此，计算出发酵液中hsaf总含量为356.3mg/l)，通过计算发现添加cacl2能够使第一次萃取效率达到88.2％，比对照提高了1.83倍。而商业化破乳剂(ppb)对本研究中乳化问题效果不明显。实施例3：添加nacl破除乳化提取发酵液中hsaf吸取发酵液3ml至15ml离心管中，滴加浓盐酸至ph为4.0；投放0.6gnacl后，轻轻摇晃使其充分溶解；向混合液中添加3ml乙酸乙酯溶剂；置于漩涡混合振荡器上2000rpm反应1min，使萃取剂与发酵液充分接触；8000rpm下离心5min，使发酵液与有机溶剂分成两相，上清即为hsaf萃取液，吸取1ml吹干加入500μl甲醇溶解后按照实施例1中方案对其含量进行检测。由图2和表2可知，nacl可有效破除萃取过程中产生的乳化现象，并且能够提高萃取液中hsaf的含量(343.6mg/l)。同时，以充分萃取后得到的hsaf含量为发酵液中hsaf总量(通过三次萃取至发酵液中不再产生hsaf为止，每次萃取液中hsaf含量为343.6mg/l，40.5mg/l，6.6mg/l，对应的体积分别为2.7ml，3ml，3ml。与此，计算出发酵液中hsaf总含量为356.3mg/l)，通过计算发现添加nacl能够使第一次萃取效率达到86.8％，比对照提高了1.79倍。而商业化破乳剂(ppb)对本研究中乳化问题效果不明显。实施例4：添加nacl和cacl2组合破除乳化提取发酵液中hsaf吸取发酵液3ml至15ml离心管中，滴加浓盐酸至ph为3.0；投放0.3gnacl和0.2gcacl2后，轻轻摇晃使其充分溶解；向混合液中添加3ml乙酸乙酯溶剂；置于漩涡混合振荡器上1500rpm反应1min，使萃取剂与发酵液充分接触；8000rpm下离心5min，使有机相与水相分层，吸取上清即为hsaf萃取液，通过hplc对其含量进行检测，其他条件同实施例1。由图2和表2可知，添加nacl和cacl2可有效破除萃取过程中产生的乳化现象，并且能够提高萃取液中hsaf的含量(331.5mg/l)。同时，以充分萃取后得到的hsaf含量为发酵液中hsaf总量(通过三次萃取至发酵液中不再产生hsaf为止，每次萃取液中hsaf含量为331.5mg/l，38.9mg/l，8mg/l，对应的体积分别为2.8ml，3ml，3ml。与此，计算出发酵液中hsaf总含量为356.3mg/l)，通过计算发现添加nacl和cacl2能够使第一次萃取效率达到86.8％，比对照提高了1.79倍。而商业化破乳剂(ppb)对本研究中乳化问题效果不明显。表2添加不同无机盐对hsaf萃取效率的影响当前第1页12当前第1页12