一种双模板抗原决定基磁性印迹聚合物的制备方法与流程

本发明属于纳米材料的制备领域，特别是一种双模板抗原决定基磁性印迹聚合物的快速制备方法。

背景技术：

分子印迹技术是指制备可特异性识别目标物分子的聚合物的技术。在制备分子印迹聚合物的过程中，模板分子、功能单体、交联剂及引发剂发生聚合反应，将模板分子镶嵌在聚合物网络结构中，通过洗脱除去模板分子，在聚合物网络结构中留下与模板分子大小、尺寸以及官能团相匹配的空穴，即印迹位点，因此，得到的印迹聚合物可以特异性识别该模板分子。参见：g.wulff,a.sarhan,k.zabrocki.tetrahedronlett.1973,14(44):4329–4332；g.valtakis,l.andersson,r.muller,k.mosbach,nature,1993,361(6413):645-647。分子印迹技术具有预定性、识别性、实用性三大特点，是一种可以特异性识别目标分子的分离技术。目前，分子印迹聚合物已被广泛地应用于小分子的特异性识别，然而，分子印迹聚合物对生物大分子比如多肽或者蛋白的识别依然存在着挑战，主要是因为生物大分子通常有着复杂的空间构象、较大的分子量、对高温及有机溶剂等易敏感变性。尽管存在种种困难，通过金属螯合印迹、表面印迹和抗原决定基印迹等方法已经成功地合成了大分子印迹聚合物，参见：l.qin,x.w.he,w.zhang,w.y.li,y.k.zhang,anal.chem.,2009,81(17):7206-7216；z.a.lin,l.x.sun,w.liu,z.w.xia,h.h.yang,g.n.chen.j.mater.chem.b,2014,2(6):637–643；j.x.liu,k.g.yang,q.l.deng,q.r.li,l.h.zhang,z.liang,y.k.zhang,chemcommun.,2011,47(13):3969-3971；a.rachkov，n.j.chromatogr.a,2000,889(1–2):111-118；h.nishino,c.huang,k.j.shea.angew.chem.2006,45(15):2392-2396；a.nematollahzadeh,w.sun,c.s.a.aureliano,d.lutkemeyer,j.stute,m.j.abdekhodaie,a.shojaei,b.sellergren,angew.chem.int.ed.,2011,50(2):495-498。

磁性碳纳米管是一种新型纳米材料，同时兼具磁性以及高比表面积，被广泛研究与应用。参见：m.y.zhu,g.w.diao,nanoscale，2011,42(45):2748-2767；m.s.cao,j.yang,w.l.song,d.q.zhang,b.wen,h.b.jin,z.l.hou,j.yuan,acsappl.mater.interfaces,2012,4(12),6949-6956。基于磁性碳纳米管的磁性以及高比表面积的特性，近些年磁性碳纳米管也逐步应用于分子印迹技术，作为印迹聚合物的载体，可以有效提高印迹聚合物对目标物的吸附量，同时在外加磁场下，分子印迹聚合物可以快速分离，使整个处理过程更加简便、省时。参见：l.gao,l.chen,x.li,microchimicaacta,2015,182(3):781-787；d,xiao,p,dramou,n,xiong,h.he,d.yuan,h.dai,h.li,x.m.he,j.peng,n.li,analyst,2013,138(11):3287-3296.本发明采用双模板抗原决定基印迹和蒸馏沉淀聚合方法快速制备金属螯合磁性印迹聚合物，以磁性碳纳米管为载体，包硅后修饰双键，加入目标蛋白的两端多肽模板、功能单体和交联剂，蒸馏沉淀聚合法快速制备出可以特异性识别目标蛋白的印迹聚合物。

技术实现要素：

本发明的目的在于针对上述技术分析和存在问题，提供一种高特异性磁性分子印迹聚合物的制备方法，该方法采用蒸馏沉淀聚合和双模板抗原决定基法，同时结合了金属螯合印迹方法，对目标蛋白的识别具有很好的特异性和选择性；且制备方法简单省时，在实际样品中对目标物的选择性识别和检测有着良好的应用前景。

本发明的技术方案：

一种双模板抗原决定基磁性印迹聚合物的制备方法，以磁性碳纳米管为载体，对载体包硅后修饰双键，以目标的c端9肽和n端9肽为模板，采用蒸馏沉淀聚合法合成分子印迹纳米材料，包括如下步骤：

1)将碳纳米管进行纯化，将碳纳米管加入到浓硝酸中，超声分散后，在浓硝酸中85℃搅拌回流24小时，得到纯化的碳纳米管(cnts)；

2)碳纳米管、硝酸铁(fe(no3)3)、无水乙酸钠(naac)、聚乙二醇(peg)及聚乙烯吡咯烷酮(pvp)加入到乙二醇中，搅拌均匀后置于反应釜200℃反应12h，得到磁性碳纳米管(mcnts)；

3)将磁性碳纳米管加入到用量比为4:1的乙醇-水混合液中，加入氨水后，滴加四乙氧基硅烷(teos)，在室温下反应12h，制得包硅的磁性碳纳米管(mcnts@sio2)；

4)将制备得到的mcnts@sio2分散到150ml无水乙醇中，60℃条件下滴加γ-甲基丙烯酰氧基丙基三甲氧基硅烷(mps)并反应24h，得到双键修饰的磁性碳纳米管(mcnts@mps)。

5)将制备得到的mcnts@mps、c端9肽、n端9肽、丙烯酸锌加入到乙腈中，超声30min，加入交联剂二甲基丙烯酸乙二醇酯(egdma)、引发剂偶氮二异丁腈(aibn)，超声10分钟后，置于反应器上进行搅拌回流，初始温度设为80℃，目标温度设为95℃，溶剂蒸出25ml，用时30min，停止反应，得到的印迹聚合物用甲醇-醋酸混合液进行洗脱，除去模板，得到具有两种印迹位点的磁性印迹聚合物(mcnts@d-emip)。

步骤1)所述碳纳米管纯化中碳纳米管与浓硝酸的用量比为0.5g:60ml。

步骤2)所述磁性碳纳米管制备中cnts、fe(no3)3、naac、peg、pvp、乙二醇的用量比为60mg:2.4g:1.81g:0.8g:20mg:40ml。

步骤3)所述磁性碳纳米管包硅中氨水的质量百分比浓度为25％，其中mcnts、乙醇：水：氨水：teos的用量比为1g:160ml:40ml:2ml:4ml。

步骤4)所述双键修饰磁性碳纳米管中mcnts@sio2、无水乙醇、mps的用量比为1g:150ml:6ml。

步骤5)所述磁性印迹聚合物中mcnts@mps、c端9肽、n端9肽、丙烯酸锌、egdma、aibn、乙腈的用量比为200mg:20mg:20mg:100mg:450ul:60mg:40ml。

步骤5)所述洗脱液中甲醇、醋酸的体积比例为9:1。

本发明的优点和积极效果是：

1)磁性碳纳米管作为一种新型纳米材料，同时兼具磁性和高比表面积的优良特性，作为分子印迹的载体，可以有效提高印迹聚合物对目标物的吸附量，同时磁性能使合成处理过程更加简捷；

2)以修饰双键的磁性碳纳米管为载体，采用双模板抗原决定基方法合成印迹聚合物，制得的印迹聚合物表面含有两种印迹位点均可特异性识别目标物，可有效提高印迹聚合物对目标物印迹效果；

3)采用蒸馏沉淀聚合方法合成印迹聚合物，蒸馏沉淀聚合方法选用乙腈为溶剂，聚合过程中，随着溶剂的蒸出，聚合速率随着反应物浓度的增加而加快，能够在段时间内完成聚合反应，且无需通氮气，简便省时；

4)采用金属螯合的作用方式进行螯合，丙烯酸锌为功能单体，其可以和模板多肽上的氨基、羧基、羟基等形成螯合以及六元环作用，该作用能够以比氢键作用力更强的作用固定模板，从而产生更多的印迹位点，可有效提高对目标蛋白的印迹效果。

附图说明

图1是双模板抗原决定基磁性印迹聚合物的透射电镜图。

图2是双模板抗原决定基磁性印迹聚合物与单模板抗原决定基磁性印迹聚合物对目标蛋白的识别性能的差异性。

图3是双模板抗原决定基磁性印迹聚合物对非目标蛋白的识别性能。

具体实施方式

实施例：

一种双模板抗原决定基磁性印迹聚合物的制备方法，以磁性碳纳米管为载体，对载体包硅后修饰双键，以目标的c端9肽和n端9肽为模板，采用蒸馏沉淀聚合法合成分子印迹纳米材料，包括如下步骤：

1)将0.5g碳纳米管加入到60ml浓硝酸中，超声分散后，在85℃下搅拌回流反应24h，得到纯化的碳纳米管(cnts)；

2)将60mg碳纳米管、2.4g硝酸铁、1.81g无水乙酸钠、0.8g聚乙二醇以及20mg聚乙烯吡咯烷酮加入到40ml乙二醇中，搅拌均匀后，转移至50ml高温高压反应釜，200℃反应12h，得到磁性碳纳米管(mcnts)；

3)将1g磁性碳纳米管加入到200ml的乙醇和水的混合液中(乙醇：水＝4:1)，加入2ml的氨水后，将4ml四乙氧基硅烷缓慢滴加进去，室温下反应12h，得到包硅的磁性碳纳米管(mcnts@sio2)。将1gmcnts@sio2分散到150ml无水乙醇中，60℃条件下滴加6mlγ-甲基丙烯酰氧基丙基三甲氧基硅烷(mps)并反应24h，得到双键修饰的磁性碳纳米管(mcnts@mps)；

4)将200mgmcnts@mps，20mgc端9肽和20mgn端9肽，100mg丙烯酸锌加入到40ml乙腈中，超声30min后，加入交联剂二甲基丙烯酸乙二醇酯(egdma)450ul和引发剂偶氮二异丁腈(aibn)60mg，超声10分钟后，置于反应器上进行搅拌回流，初始温度设置为80℃，目标温度设为95℃，溶剂蒸出25ml后(反应时间为30min)，停止反应，将得到的磁性印迹聚合物进行磁性分离除去溶剂，用体积比为9:1甲醇-醋酸混合液洗脱除去印迹聚合物中的模板分子，得到具有两种印迹位点的磁性印迹聚合物(mcnts@d-emip)。

制得的双模板抗原决定基磁性印迹聚合物(mcnts@d-emip)对目标蛋白猪血清蛋白(psa)的特异性识别性能：

将得到的双模板抗原决定基磁性印迹聚合物加入到目标蛋白溶液中，即4mgmcnts@d-emip加入到4ml的0.5mgml^-1的psa溶液中进行吸附，吸附达到平衡后，对吸附后的上清液在280nm处进行紫外测试，从而计算目标蛋白的吸附量。通过对比印迹聚合物与非印迹聚合物二者的吸附量评价印迹聚合物对目标蛋白的特异性识别性能。

图1是双模板抗原决定基磁性印迹聚合物的透射电镜图，图中显示：印迹聚合物层约15nm，且印迹层明显。

图2是双模板抗原决定基磁性印迹聚合物与单模板抗原决定基磁性印迹聚合物对目标蛋白的识别性能的差异性，数据显示：双模板印迹聚合物对目标蛋白的识别性能明显高于单模板印迹聚合物。

图3是双模板抗原决定基磁性印迹聚合物对非目标蛋白的识别性能。数据显示：双模板印迹聚合物对目标蛋白以外的蛋白没有特异性识别。