本发明属于分子育种技术领域，具体涉及一种玉米第4号染色体穗行数的主效qtl分子标记、辅助选择多穗行玉米的方法及其应用。
背景技术：
玉米是世界上主要的大田作物之一。玉米籽粒可作为粮食和饲料、秸秆可以作为能源材料进行利用，在保障粮食安全及发展能源方面具有重要作用。近年来，玉米在中国的种植面积呈逐年递增趋势。截止到2014年，全国玉米种植面积已经达到3700万公顷。尽管国家进行农业供给侧改革，优化农作物种植结构，调减非玉米主产区种植面积，但调减后的玉米总种植面积依然巨大。为确保粮食总量，在农业供给侧改革的大背景下，提高玉米单产成为保障总产的重要手段。其中，玉米育种技术是提高玉米单产的有效途径。随着生物技术的发展，分子标记辅助选择因其可以低成本、高效率地筛选目标性状且不受环境影响，越来越多地用于玉米育种中。
玉米雌穗作为玉米籽粒的载体，其性状对玉米产量具有重要影响。特别是作为玉米产量因子之一的穗行数性状，与行粒数及百粒重性状一起形成了玉米的产量。通常，产量相关性状是由多基因控制的数量性状。研究表明，玉米穗行数是多基因控制的数量性状，其与玉米产量呈显著正相关关系。目前，多个穗行数的qtl得到了定位，部分控制穗行数的基因获得了克隆。严建兵等(2006)采用r/qtl方法检测到7个穗行数主效qtl。ma等(2007)以来源于豫玉22的ril群体为研究材料，得到13个穗行数qtl。peter等(2013)在第4染色体上克隆到一个clavata受体蛋白位点fasciatedear2，该位点的突变导致玉米雌穗分生组织增大，穗行数增多。liu等(2015)利用近等基因系h21和h21nx531杂交构建f2群体，在第4染色体unbranched3(ub3)基因的下游发现一段约3kb的区间通过调控ub3的表达进而调控穗行数的变异(发明专利申请号：201510021578.x)。此外，在玉米第3及第9染色体上也存在控制玉米穗行数的主效qtl位点(发明专利申请号：201510477589.9和201510478284.x)。尽管国内外对穗行数性状qtl进行了大量的研究，但由于所用实验材料、遗传群体、连锁图谱、和qtl分析方法存在差异，研究结果不尽相同。
技术实现要素：
本发明主要提供了一种玉米第4号染色体穗行数的主效qtl分子标记，通过两对引物来辅助选择多穗行玉米。其技术方案如下：一种玉米第4号染色体穗行数的主效qtl分子标记，其由indel73和umc1667两对引物组成，引物indel73的正向引物序列如seqidno:1所示，反向引物序列如seqidno:2所示，引物umc1667的正向引物序列如seqidno:3所示，反向引物序列如seqidno:4所示。
一种辅助选择多穗行玉米的方法如下：提取待测玉米的基因组dna，采用所述引物indel73和umc1667进行pcr扩增，如果得到长度为199bp和142bp的扩增产物，则待测玉米为候选多穗行玉米。
玉米第4号染色体穗行数的主效qtl分子标记可以在多穗行玉米育种中应用。
采用上述分子标记，本发明具有以下优点：
本发明通过qtl分析，发现在玉米第4染色体4.08bin上存在一个与玉米籽粒穗行数相关的qtl，该qtl位于分子标记indel73和umc1667之间，对表型的贡献率为11.9％。利用这两个紧密连锁的分子标记可以对玉米穗行数性状进行选择。
通过本发明公布的分子标记进行分子标记辅助选择，只需检测分子标记的特征扩增条带，即可预测玉米穗行数，鉴定方法简单，选择效率高。在玉米生育早期鉴定出多穗行的玉米单株，淘汰其它单株，选择目标明确，且不受环境的影响。
附图说明
图1为控制玉米穗行数主效qtl在第4染色体上的位置示意图。
具体实施方式
以下实施例中的实验方法如无特殊规定，均为常规方法，所涉及的实验试剂及材料如无特殊规定均为常规生化试剂和材料。
1.获得控制玉米穗行数主效qtl分子标记的详细步骤如下：
(1)玉米三重测交(tripletestcross，ttc)群体的构建及穗行数的鉴定
利用121份不同基因型的高遗传交换率ibm重组自交系群体分别与其亲本b73、mo17及f1杂交，获得tc(b73)、tc(mo17)及tc(f1)ttc群体。将121份不同基因型ibm群体、tc(b73)、tc(mo17)及tc(f1)群体按照随机分组的方式种植于试验基地。每个基因型材料按照单行种植，行长3.6m，行距60cm，株距30cm。为降低边际效应的影响，小区周边种植了保护行。玉米整个生育期采用常规栽培管理措施。
待籽粒生理成熟后，收获ibm重组自交系及ttc群体的成熟穗。每行去除行头及行尾的单株共收获5株用于穗行数鉴定。
根据ttc群体的遗传交配设计，将121个tc(b73)、tc(mo17)、tc(f1)的籽粒长度数据分别表示为l1i、l2i和l3i(i＝1,…,121)，对于每一个ibm个体计算和式z1＝(l1i+l2i)/2(i＝1,…,121)，用于检测加性qtl。
(2)indel(insertion/deletion)标记的开发和遗传连锁图谱的构建
利用b73全基因组序列(第三版)和mo17二代序列，mo17二代原始序列经过q20标准过滤后用bwa软件处理并利用samtool对结果进行整理。在分析过程中删除可在b73基因组上对应多个位点的mo17二代原始序列。利用eprimer3设计引物，将这些引物在玉米自交系b73、mo17基因组之间进行pcr扩增，通过2％的琼脂糖凝胶筛选出在b73、mo17基因组间扩增条带清晰、无非特异性扩增的共显性indel标记。
提取ibm群体的dna，利用筛选的多态性indel标记进行pcr扩增，通过2％的琼脂糖凝胶电泳获得ibm群体的indel标记基因型。结合ibm群体的公共标记基因型，利用mstmap软件对这些分子标记进行分群、排序并计算遗传距离(kosambi)。经过分析，构建的遗传图谱共有744个分子标记，覆盖了玉米的10个染色体，总遗传距离达到了4263.1cm，分子标记间平均遗传距离为5.7cm。
(3)qtl分析
ibm群体亲本b73、mo17穗行数间存在显著差异(p＝0.032)，构建的ttc群体可以用于穗行数qtl分析。利用icimappingv4.0对z1进行完备区间作图(inclusivecompositeintervalmapping，icim)分析穗行数qtl的遗传位置及遗传效应。以0.5cm的步移扫描全基因组，抽样1000次迭代值模拟确定qtl的阈值(lod)。当lod值大于2.5时，认为该区间存在一个qtl。完备区间作图分析表明，在玉米第4号染色体4.08bin上存在一个控制玉米穗行数的加性主效qtl，介于分子标记indel73和umc1667之间物理距离约2mb的区域内(图1)，与已报道的该染色体上控制穗行数的krn4基因和fasciatedear2基因分别相距约20mb和45mb。该qtl对表型的贡献率为11.9％，命名为qrpe4。该qtl增加穗行数的等位基因来自亲本b73，可用于对玉米穗行数的预测。引物indel73的正向引物序列如seqidno:1所示，反向引物序列如seqidno:2所示，引物umc1667的正向引物序列如seqidno:3所示，反向引物序列如seqidno:4所示。
2.一种辅助选择多穗行玉米的方法，具体如下：
提取待测玉米的基因组dna，用引物indel73和umc1667进行pcr扩增，如果得到长度为199bp和142bp的扩增产物，则待测玉米为候选多穗行玉米。
上述鉴定出的候选多穗行玉米应用于育种，在玉米生育早期鉴定出多穗行的玉米单株，淘汰其它单株，在玉米种植过程中，可以在有限的耕地资源上显著提高玉米的产量。
对本领域的技术人员来说，可根据以上描述的技术方案以及构思，做出其它各种相应的改变以及形变，而所有的这些改变以及形变都应该属于本发明权利要求的保护范围之内。
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<110>江苏省农业科学院
<120>玉米第4号染色体穗行数的主效qtl分子标记、辅助选择多穗行玉米的方法及
其应用
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