本发明提供一种白桦茸的培养基及其制备方法，尤指一种提高白桦茸中的三萜类化合物产量的培养基及其制备方法。
背景技术
白桦茸(inonotusobliquus)是一种民间药用真菌，主要分布于俄罗斯及东欧地区，菌丝体内含有大量的葡聚糖、异多醣体、果胶等物质，可作为细胞膜成分之一，特别是多醣类的brm(biologicalresponsemodifiers)物质中葡聚糖的含量较高，可以提升免疫细胞的活力，具有抑制癌细胞扩散、防止癌症復发、避免胃肠吸收到致癌物质等效果，其营养和药用价值逐渐引起人民的关注，成为医药工业和保健品工业的热门开发领域。
白桦茸中除含有前述多醣类外、亦有研究显示其富含三萜类化合物，具有改善血液循环、调整血压以及降低血液胆固醇的作用。然而，目前野生的白桦茸价格昂贵，且来源日益枯竭，很难满足市场的需求。使用人工栽培如固态发酵培养技术，由于现阶段栽培困难，产量较低。现有白桦茸的固态培养基，多以木屑和麦麸搭配其他营养物质制备培养基，并无法有效提高白桦茸菌丝体产物的产量。此外，以人工方式培养的白桦茸，所含的有效成分三萜类化合物的成份比率均较天然生成的野生白桦茸来得低。因此，如何提高人工培养白桦茸中的三萜类化合物含量占比，是为目前白桦茸培养相关研究的热门课题。
本发明鉴于前述现有技术的课题，其目的在于提供一种新颖的白桦茸的固态培养基以及其制备方法，在藉由添加特殊营养液的固态发酵模拟白桦茸天然的生长环境，并维持产物营养成份的同时，亦能有效率的提升白桦茸所含的有效成分三萜类化合物的产量。
技术实现要素：
有鉴于前述的问题与缺陷，发明人以多年的经验累积，并发挥想象力与创造力，在不断试作与修改之后，始有本发明的一种提高白桦茸的三萜类化合物的培养基配方。
本发明的主要目的是提供一种提高白桦茸的三萜类化合物含量的培养基，其至少包括：
一干料部分，其重量百分比浓度为50％～70％，所述干料部分包含至少一种谷类组合物，所述谷类组合物选自由以下禾本科植物所组成的群组：燕麦、大麦、薏仁、稻米、小米、玉米、高粱、黑麦及小麦中的至少两种；以及
一营养液，其重量百分比浓度为30％～50％，所述营养液包含：
一第一成分，其重量百分比浓度为1％～9％并且包括至少一种含碳化合物；
一第二成分，其重量百分比浓度为1％～5％并且包括至少一种含氮化合物；
一柿树萃取液，其重量百分比浓度为3％～9％；以及
水，其重量百分比浓度为77％～95％。
其中，所述柿树萃取液是萃取自柿树科植物的叶、茎或果。
其中，所述柿树萃取液依以下方法所制备：将柿树的叶经清洗、烘干后，加入30％的酒精中煮沸1.5小时，柿树叶与所述30％酒精的重量比为1∶20，过滤后向所述滤液中加入乙酸乙酯，所述滤液与所述乙酸乙酯的重量比为1∶0.6，混匀后静置5～10小时，待溶液分层后取上层液即完成制备。
其中，所述营养液的酸碱值介于5至8。
其中，所述第一成分选自由以下成份所组成的群组或其组合物：蔗糖、果糖、麦芽糖及葡萄糖中的一种。
其中，所述第二成分选自由以下成份所组成的群组或其组合物：绿豆粉、黄豆粉、酵母菌萃取物、蛋白胨、各种胺基酸、尿素、醋酸胺、氯化铵、硝酸铵、硝酸钾及硝酸钠中的一种。
其中，所述干料部分的重量百分比浓度为60％，所述营养液的重量百分比浓度为40％，所述谷类组合物由燕麦与小麦以1∶1的重量比例混合而组成者，所述柿树萃取液的重量百分比浓度为6％。
其次，提供一种提高白桦茸的三萜类化合物含量的培养基的制备方法，其步骤包括：
制备干料部分，其占培养基总重量的重量百分比浓度为50％～70％，所述干料部分包含至少一种谷类组合物，所述谷类组合物选自由以下禾本科植物所组成的群组或其组合物：燕麦、大麦、薏仁、稻米、小米、玉米、高粱、黑麦及小麦中的至少两种；
制备一营养液，其占培养基总重量的重量百分比浓度为30％～50％，其依下列组成比例与方法调配所预先混合：其重量百分比浓度为1％～9％并且包括至少一种含碳化合物的一第一成分；其重量百分比浓度为1％～5％并且包括至少一种含氮化合物的一第二成分；其重量百分比浓度为3％～9％的一柿树萃取液；以及其重量百分比浓度为77％～95％的水；以及
混合所述干料部分以及所述营养液以形成一初始培养基，其中所述干料部分完全吸收所述营养液。
其中，所述柿树萃取液是萃取自柿树科植物的叶、茎或果。
其中，所述柿树萃取液依以下方法所制备：将柿树的叶经清洗、烘干后，加入30％的酒精中煮沸1.5小时，柿树的叶与所述30％酒精的重量比为1∶20，过滤后向所述滤液中加入乙酸乙酯，所述滤液与所述乙酸乙酯的重量比为1∶0.6，混匀后静置5～10小时，待溶液分层后取上层液，并经减压浓缩、真空干燥后完成制备。
其中，所述营养液的酸碱值介于5至8。
其中，所述第一成分选自由以下成份所组成的群组或其组合物：蔗糖、果糖、麦芽糖及葡萄糖中的一种。
其中，所述第二成分选自由以下成份所组成的群组或其组合物：绿豆粉、黄豆粉、酵母菌萃取物、蛋白胨、各种胺基酸、尿素、醋酸胺、氯化铵、硝酸铵、硝酸钾及硝酸钠中的一种。
具体实施方式
本发明揭露一种提高白桦茸的三萜类化合物含量的的固态培养基配方及其制备方法，将培养基的成分及其含量作适当的调配，最后得出将谷类组合物以及特殊营养液进行混合，其中该特殊营养液含有硝酸铵(nh4no3)做为氮源、含有葡萄糖作为碳源，证实该添加柿树萃取液的营养液的固态培养基具有提高白桦茸的三萜类化合物含量的功效。请参考图示与下列的说明，其中的目的为说明本发明的最佳实施例，而非用以限制本发明的范围。藉由特定的具体实施例说明本发明的实施方式，熟习此技艺的人士可由本说明书所揭示的内容轻易地了解本发明的其他优点与功效。本发明亦可藉由其他不同的具体实施例加以施行或应用，本说明书中的各项细节亦可基于不同观点与应用，在不悖离本发明的精神下进行各种修饰与变更。
菌丝体的培养与取得
于本实施例中，菌丝体的培养选用白桦茸(inonotusobliquus)菌丝体进行发酵。一般而言，发酵方法有两类：固态与液体深层发酵。前者将菌丝体接种于含有碳源或氮源的固态培养基(例如堆肥和木屑)进行培养而得到的生菌丝体或干燥菌丝体。后者，则是使用固定组成的液态培养基，在适当的环境下进行微生物的培养，以制造生质(biomass)与其他的代谢产物(metabolite)。本实施例选择前者方式培养白桦茸菌丝。
实施例1-提高白桦茸的三萜类化合物含量的固态培养基的制备方法
步骤一：制备干料部分，其占培养基总重量的重量百分比浓度为50％～70％，该干料部分包含至少一种谷类组合物，该谷类组合物选自由以下禾本科植物所组成的群组或其组合物：燕麦、大麦、薏仁、稻米、小米、玉米、高粱、黑麦及小麦中的至少两种；步骤二：制备一营养液，其占培养基总重量的重量百分比浓度为30％～50％，并且依下列组成比例与方法调配所预先混合：其重量百分比浓度为1％～9％并且包括至少一种含碳化合物的一第一成分，其选自但不限于葡萄糖(glucose)、果糖(fructose)、蔗糖(sucrose)、麦芽糖(maltose)或其组合；重量百分比浓度为1％～5％并且包括至少一种含氮化合物的一第二成分，选自但不限于酵母菌萃取物(yeastextract)、蛋白胨(peptone)、尿素(urea)、醋酸胺(ch3coonh4)、氯化铵(nh4cl)、硝酸铵(nh4no3)、硝酸钾(kno3)、硝酸钠(nano3)或其组合；重量百分比浓度为3％～9％的一柿树萃取液；以及其重量百分比浓度为77％～95％的水；步骤三：混合该干料部分以及该营养液以形成一初始培养基，其中该干料部分完全吸收该营养液；以及步骤四：将该初始培养基经灭菌处理。
前述谷类组合物以及营养液间调配的浓度比例，依据每100克的该谷类组合物，添加42～100克的该营养液。前述营养液完成制备后，调整其酸碱值介于5至8。柿树萃取物可萃取自柿树科(ebenaceae)植物的叶、茎或果。
前述柿树萃取液以具下列方式所制备：将柿树(diospyroskaki)的叶经清洗、烘干后，加入30％的酒精中煮沸1.5小时，柿树的叶与所述30％酒精的重量比为1∶20，过滤后向所述滤液中加入乙酸乙酯，所述滤液与所述乙酸乙酯的重量比为1∶0.6，混匀后静置5～10小时，待溶液分层后取上层液，得到该柿树萃取液。
实施例2-提高白桦茸的三萜类化合物含量的固态培养基
本实施例的白桦茸固态培养基的制备方法主要如实施例1所述，其中各组成的浓度依照以下所列进行制备，提供一种重量百分比浓度为50％～70％的谷类组合物，其依照重量比例1：1混合的燕麦与小麦所组成；其重量百分比浓度为30％～50％的营养液，该营养液依下列组成比例与方法调配所预先混合：提供碳源的第一成分选自葡萄糖，其重量百分比浓度1～9％；提供氮源的第二成分选自硝酸铵(nh4no3)，其重量百分比浓度1～5％；其重量百分比浓度为3～9％的一柿树萃取液；以及其重量百分比浓度为77～95％的水。营养液完成制备后，调整其酸碱值为6.8。在本实施例中，柿树萃取液以具下列方式所制备：将柿树(diospyroskaki)的叶经清洗、烘干后，加入30％的酒精中煮沸1.5小时，柿树的叶与所述30％酒精的重量比为1∶20，过滤后向所述滤液中加入乙酸乙酯，所述滤液与所述乙酸乙酯的重量比为1∶0.6，混匀后静置8小时，待溶液分层后取上层液，得到该柿树萃取液。
实施例3-较佳白桦茸固态培养基
本实施例的白桦茸固态培养基的制备方法主要如实施例1所述，其中各组成的浓度依照以下所列进行制备，提供一种重量百分比浓度为60％的谷类组合物，其依照重量比例1∶1混合的燕麦与小麦所组成；其重量百分比浓度为40％的营养液，该营养液依下列组成比例与方法调配所预先混合：提供碳源的第一成分选自葡萄糖，其重量百分比浓度2.3％；提供氮源的第二成分选自硝酸铵(nh4no3)，其重量百分比浓度2.7％；其重量百分比浓度为6％的一柿树萃取液；以及其重量百分比浓度为89％的水。营养液完成制备后，调整其酸碱值为6.8。在本实施例中，柿树萃取液以具下列方式所制备：将柿树(diospyroskaki)的叶经清洗、烘干后，加入30％的酒精中煮沸1.5小时，柿树的叶与所述30％酒精的重量比为1∶20，过滤后向所述滤液中加入乙酸乙酯，所述滤液与所述乙酸乙酯的重量比为1∶0.6，混匀后静置8小时，待溶液分层后取上层液，并经减压浓缩、真空干燥后得到最终萃取物。
实验例-本发明以及传统固态培养基对于白桦茸菌丝体的三萜类化合物产量的影响
本实验例将白桦茸菌株植入至含有本发明的固态培养基的培养瓶；在菌丝体萌发初期，较怕杂菌感染，所需的氧气交换较少、产出的二氧化碳及热也较少，此时将温度控制在摄氏25至30度，湿度控制在70％左右，以利菌丝体萌发生长。待菌丝体生长至直径3公分时，杂菌的危害相对较小、所需的氧气交换较多、产出的二氧化碳及热也较多，此时将温度控制在摄氏22至27度，湿度控制在50％，以利菌丝体持续生长。待菌丝体长至直径8公分，为适合采摘的大小，可对白桦茸菌丝体产物进行采收。
白桦茸从植入菌株至菌丝体生长至直径3公分大小的天数，称为第一阶段，使用一般培养基约需耗时10至20日。而白桦茸菌丝体直径3公分生长至直径8公分大小最适采摘阶段的天数，称为第二阶段，使用一般培养基约需耗时10至15日。本实验例是将实施例2及实施例3中制得该本发明的固态培养基对白桦茸进行培养，并以未添加柿树萃取物的传统固态培养基配方培养白桦茸作为对照组，培养70日后进行白桦茸菌丝体产物的采收，并将采收而得的产物进行三萜类化合物的粗萃取步骤。粗萃取步骤分别利用水、50％酒精、95％酒精作为萃取液，在50℃的温度条件下萃取30分钟后，计算各组三萜类化合物的产量与进行比较，实验结果请参照以下表1及表2。
表1
表2
根据实验结果可得知，无论以水或任何浓度的酒精进行萃取，本发明的培养基配方所萃取出的三萜类化合物含量均高于对照组，显见本发明的培养基配方确实可有效促进白桦茸生产三萜类化合物含量。
综上所述，本发明的提高白桦茸的三萜类化合物含量的固态培养基及其制备方法，其优点在于能以易于取得的材料制作培养基配方从而成功培养出白桦茸菌丝体产物，并且制备步骤简单，亦能达到降低培养人力与时间成本的功效。
甚者，本发明相较于现有技术主要在于通过特殊培养基配方的改良，添加含有柿树萃取物的营养液，进而使该白桦茸菌丝体产物中的三萜类化合物的占比提升。此外，本发明于培养过程中的温、湿度等环境参数均可参照已知的白桦茸的固态培养方式，不需特别调控，故具有不需担心原料匮乏、操作简单、易于推广应用，及能够节省培养过程中的人事与成本等优点。