一种乙肝病毒表面抗原基因与表达载体及细胞株的制作方法

本发明属于疫苗生产领域，特别涉及一种乙肝病毒表面抗原基因与表达载体及细胞株。
背景技术：
：通过优化乙肝病毒大s抗原基因序列和构建高效表达载体的方法均无法高效表达分泌性乙肝表面抗原。这是因为过高的larges基因表达会抑制表面抗原的分泌，只有正确比例的larges：s才能够获得表面抗原的高效表达，而s抗原基因的调控序列正好位于pres序列之中，所以改变其基因序列来获得大s抗原的高表达是不可取的。部分发明(如公开号为cn102851313a的专利申请)中描述了利用去除大部分乙肝病毒核心抗原基因的表达载体(含核质附着区序列)，由于其载体中还有sv40等上游强启动子，会干扰乙肝病毒larges：s比例，从而影响抗原表达；并且由于其还是随机插入基因组中，会造成插入序列的不稳定，这对于生产性的表达是有风险的。技术实现要素：本发明的首要目的在于克服现有技术的缺点与不足，提供一种乙肝病毒表面抗原基因。本发明的另一目的在于提供一种乙肝病毒表面抗原的表达载体，其含有上述乙肝病毒表面抗原基因。本发明的再一目的在于提供一种乙肝病毒表面抗原的表达细胞株及其制备方法。本发明的目的通过下述技术方案实现：一种乙肝病毒表面抗原基因，其由抗原启动子和部分核心抗原序列(包括间隔)、大s抗原基因和部分x基因序列(包括间隔)依次连接在一起，核苷酸序列如下(seqidno.1)所示。aagaggcaggtcccctagaagaagaactccctcgcctcgcagacgaaggtctcaatcgccgcgtcgcagaagatctcaatctcgggaatctcaatgttagtattccttggactcataaggtgggaactttacggggctttattcttctacggtacctagctttaatcctaattggcaaactccttcttttcctgacattcatttgcaggaggacattgttgatagatgtaagcaatttgtggggccccttacagtaaatgaaaacaggagactaaaattgattatgcctgctaggttttatcccaatgttactaaatatttgcccttagataaagggatcaaaccttattatccagagcatgtagttaatcattacttccagacgagacattatttacacactctttggaaggcgggtatcttatataaaagagagtccacaagtagcgcctcatattgggggtcaccatattcttgggaacaaaatctacagcatgggaggttggtcttccaaacctcgcaaaggcatggggacaaatctttctgtccccaatcccctgggattcttccccgatcatcagttggaccctgcattcaaagccaactcagaaaatccagattgggacctcaacccgcacaaggacaactggccggacgccaacaaggtgggagtgggagcattcgggccagggttcgcacctccccatgggggactgttggggtggagccctcaggctcagggactactcacaacggtgccagcagttcctcctcctgcctccaccaatcggcagtcaggaaggcagcctactcccttatctccacctctaagggacactcatcctcaggccatgcagtggaactccaccactttccaccaaactcttcaagatcccagagtcagggccctgtactttcctgctggtggctccagttcaggaacagtgagccctgctcagaatactgtctctgccatatcgtcaatcttatcgaagactggggaccctgtaccgaacaatgggaggttggtcttccaaacctcgcaaaggcatggggacaaatctttctgtccccaatcccctgggattcttccccgatcatcagttggaccctgcattcaaagccaactcagaaaatccagattgggacctcaacccgcacaaggacaactggccggacgccaacaaggtgggagtgggagcattcgggccagggttcgcacctccccatgggggactgttggggtggagccctcaggctcagggactactcacaacggtgccagcagttcctcctcctgcctccaccaatcggcagtcaggaaggcagcctactcccttatctccacctctaagggacactcatcctcaggccatgcagtggaactccaccactttccaccaaactcttcaagatcccagagtcagggccctgtactttcctgctggtggctccagttcaggaacagtgagccctgctcagaatactgtctctgccatatcgtcaatcttatcgaagactggggaccctgtaccgaacatggagaacatcgcatcaggactcctaggacccctgctcgtgttacaggcggggtttttcttgttgacaaaaatcctcacaataccacagagtctagactcgtggtggacttctctcaattttctaggggaaacacccgtgtgtcttggccaaaattcgcagtcccaaatctccagtcactcaccaacctgttgtcctccaatttgtcctggatatcgctggatgtgtctgcggcgttttatcatattcctctgcatcctgctgctatgcctcatcttcttgttggttcttctggactatcaaggtatgttgcccgtttgtcctctaattccaggatcctcaacaaccagcacgggaccatgcaaaacctgcacaactcctgctcaaggaacctctatgtttccctcatgttgctgtacaaaacctacggacggaaactgcacctgtattcccatcccatcatcttgggctttcgcaaaatacctatgggagtgggcctcagtccgtttctcttggctcagtttactagtgccatttgttcagtggttcgtagggctttcccccactgtctggctttcagttatattgatgatgtggttttgggggccaagtctgtacaacatcttgagtccctttataccgctgttaccaattttcttttgtctttgggtatacatttaaatgtggctgatagggtgcggtgactgtatattgtgcgcgacacccctgtgtacatgtcgtgtgggctcagactcgcgcacaagacctctccggcgcgctgctctatacgcgcgctctgcgtatagtgtagagagagacacgcgcgcatctctctacacgcacactcgtgtgtgtgtctcatctgccgcaccgtgtgcacttcgctcacctctgcacgtcgcatgagacacgtgacaccacggcatctgccgaacgcccacgggaacctgcccaaggtcttgcataagaggactcttggactttcagcaatgtcaacgaccgaccttgaggcatacttcaaagactgtgtgtttaacgagtgggaggagtcgggggaggaggttaggttaatgatctttgta。一种乙肝病毒表面抗原的表达载体，含有上述乙肝病毒表面抗原基因和空载体。所述的空载体指的是不含有乙肝病毒表面抗原基因的载体，其优选为含有重组酶识别位点的载体。从而将所述的乙肝病毒表面抗原的表达载体定点插入哺乳动物细胞的多拷贝或高表达位点。所述的重组酶识别位点可以为loxp位点、frt位点或其它重组酶识别位点；优选为loxp位点。所述的空载体优选为核苷酸序列如seqidno.2所示的空载体。一种乙肝病毒表面抗原的表达细胞株，含有上述乙肝病毒表面抗原基因。所述的乙肝病毒表面抗原的表达细胞株的制备方法，包括如下步骤：是将上述乙肝病毒表面抗原的表达载体转入哺乳动物细胞株，筛选后得到。所述的哺乳动物细胞株优选为cho细胞株。所述的多拷贝或高表达位点主要指类alu、tert、mll4、ccne1、senp5和rock1等位点。alu序列是人类独特的高拷贝序列，而cho细胞中仅有类似序列；约有30％以上的自然感染的乙肝病毒是插入在此位点。tert、mll4、ccne1、senp5和rock1等附件序列属于高表达位点，即单个拷贝插入即可实现高表达。所述的乙肝病毒表面抗原的表达细胞株的制备方法，优选具体包括如下步骤：(1)将上述乙肝病毒表面抗原的表达载体转染入哺乳动物细胞株；(2)通过抗性筛选，得到乙肝病毒表面抗原的表达细胞株。步骤(1)中所述的转染的方式包括磷酸钙沉淀法和脂质体方法。所述的乙肝病毒表面抗原的表达细胞株适合用于生产乙肝病毒表面抗原疫苗。本发明相对于现有技术具有如下的优点及效果：(1)本发明提供的乙肝病毒表面抗原基因只含有部分核心抗原基因序列，避免得到复制型的病毒颗粒，从而影响产品的安全性和纯度。(2)本发明提供的乙肝病毒表面抗原基因只含有部分x基因序列，避免完整的x基因会负向调控上游的s抗原基因表达。(3)本发明提供乙肝病毒表面抗原基因整合到哺乳动物细胞基因组进行表达后，大抗原得以分泌性表达。(4)本发明提供的x基因序列断点是对大量临床乙肝病毒感染者体内乙肝病毒整合到人肝细胞基因组中的序列测序之后分析获得的，其稳定性和自然感染整合的乙肝病毒基因稳定性相当。附图说明图1是hbv大抗原表达盒子的结构示意图。图2是乙肝表面抗原表达载体的结构示意图。具体实施方式下面结合实施例及附图对本发明作进一步详细的描述，但本发明的实施方式不限于此。实施例1一、元件选择：(1)大s(pres1+pres2+s)抗原基因序列选用我们从广东医学临床样本中获得的hbv序列：atgggaggttggtcttccaaacctcgcaaaggcatggggacaaatctttctgtccccaatcccctgggattcttccccgatcatcagttggaccctgcattcaaagccaactcagaaaatccagattgggacctcaacccgcacaaggacaactggccggacgccaacaaggtgggagtgggagcattcgggccagggttcgcacctccccatgggggactgttggggtggagccctcaggctcagggactactcacaacggtgccagcagttcctcctcctgcctccaccaatcggcagtcaggaaggcagcctactcccttatctccacctctaagggacactcatcctcaggccatgcagtggaactccaccactttccaccaaactcttcaagatcccagagtcagggccctgtactttcctgctggtggctccagttcaggaacagtgagccctgctcagaatactgtctctgccatatcgtcaatcttatcgaagactggggaccctgtaccgaacatggagaacatcgcatcaggactcctaggacccctgctcgtgttacaggcggggtttttcttgttgacaaaaatcctcacaataccacagagtctagactcgtggtggacttctctcaattttctaggggaaacacccgtgtgtcttggccaaaattcgcagtcccaaatctccagtcactcaccaacctgttgtcctccaatttgtcctggatatcgctggatgtgtctgcggcgttttatcatattcctctgcatcctgctgctatgcctcatcttcttgttggttcttctggactatcaaggtatgttgcccgtttgtcctctaattccaggatcctcaacaaccagcacgggaccatgcaaaacctgcacaactcctgctcaaggaacctctatgtttccctcatgttgctgtacaaaacctacggacggaaactgcacctgtattcccatcccatcatcttgggctttcgcaaaatacctatgggagtgggcctcagtccgtttctcttggctcagtttactagtgccatttgttcagtggttcgtagggctttcccccactgtctggctttcagttatattgatgatgtggttttgggggccaagtctgtacaacatcttgagtccctttataccgctgttaccaattttcttttgtctttgggtatacatttaa。(2)抗原启动子和部分核心抗原序列(包括间隔)：aagaggcaggtcccctagaagaagaactccctcgcctcgcagacgaaggtctcaatcgccgcgtcgcagaagatctcaatctcgggaatctcaatgttagtattccttggactcataaggtgggaactttacggggctttattcttctacggtacctagctttaatcctaattggcaaactccttcttttcctgacattcatttgcaggaggacattgttgatagatgtaagcaatttgtggggccccttacagtaaatgaaaacaggagactaaaattgattatgcctgctaggttttatcccaatgttactaaatatttgcccttagataaagggatcaaaccttattatccagagcatgtagttaatcattacttccagacgagacattatttacacactctttggaaggcgggtatcttatataaaagagagtccacaagtagcgcctcatattgggggtcaccatattcttgggaacaaaatctacagcatgggaggttggtcttccaaacctcgcaaaggcatggggacaaatctttctgtccccaatcccctgggattcttccccgatcatcagttggaccctgcattcaaagccaactcagaaaatccagattgggacctcaacccgcacaaggacaactggccggacgccaacaaggtgggagtgggagcattcgggccagggttcgcacctccccatgggggactgttggggtggagccctcaggctcagggactactcacaacggtgccagcagttcctcctcctgcctccaccaatcggcagtcaggaaggcagcctactcccttatctccacctctaagggacactcatcctcaggccatgcagtggaactccaccactttccaccaaactcttcaagatcccagagtcagggccctgtactttcctgctggtggctccagttcaggaacagtgagccctgctcagaatactgtctctgccatatcgtcaatcttatcgaagactggggaccctgtaccgaaca。(3)部分x基因序列(包括间隔)：atgtggctgatagggtgcggtgactgtatattgtgcgcgacacccctgtgtacatgtcgtgtgggctcagactcgcgcacaagacctctccggcgcgctgctctatacgcgcgctctgcgtatagtgtagagagagacacgcgcgcatctctctacacgcacactcgtgtgtgtgtctcatctgccgcaccgtgtgcacttcgctcacctctgcacgtcgcatgagacacgtgacaccacggcatctgccgaacgcccacgggaacctgcccaaggtcttgcataagaggactcttggactttcagcaatgtcaacgaccgaccttgaggcatacttcaaagactgtgtgtttaacgagtgggaggagtcgggggaggaggttaggttaatgatctttgta。二、真核表达载体的构建和转染1、载体构建：通过序列合成方式，将空载体和如图1所示hbv大抗原表达盒子连接在一起，得到的真核表达载体如图2所示。其中，hbv大抗原表达盒子是将抗原启动子和部分核心抗原序列(包括间隔)、大s抗原基因和部分x基因序列(包括间隔)依次连接在一起；空载体含有重组酶识别位点cre、sv40启动子、g418抗性基因、多聚腺苷酸位点、puc复制原点、氨苄青霉素抗性基因等序列，具体序列如下所示。cggggtcattagttcatagcccatatatggagttagcaggatccggtaccaagcttaagtttaaaccgctgatcagcctcgactgtgccttctagttgccagccatctgttgtttgcccctcccccgtgccttccttgaccctggaaggtgccactcccactgtcctttcctaataaaatgaggaaattgcatcgcattgtctgagtaggtgtcattctattctggggggtggggtggggcaggacagcaagggggaggattgggaagacaatagcaggcatgctggggatgcggtgggctctatggcttctgaggcggaaagaaccagctggggctctagggggtatccccacgcgccctgtagcggcgcattaagcgcggcgggtgtggtggttacgcgcagcgtgaccgctacacttgccagcgccctagcgcccgctcctttcgctttcttcccttcctttctcgccacgttcgccggctttccccgtcaagctctaaatcgggggctccctttagggttccgatttagtgctttacggcacctcgaccccaaaaaacttgattagggtgatggttcacgtagtgggccatcgccctgatagacggtttttcgccctttgacgttggagtccacgttctttaatagtggactcttgttccaaactggaacaacactcaaccctatctcggtctattcttttgatttataagggattttgccgatttcggcctattggttaaaaaatgagctgatttaacaaaaatttaacgcgaattaattataacttcgtatagcatacattatacgaagttatctgtggaatgtgtgtcagttagggtgtggaaagtccccaggctccccagcaggcagaagtatgcaaagcatgcatctcaattagtcagcaaccaggtgtggaaagtccccaggctccccagcaggcagaagtatgcaaagcatgcatctcaattagtcagcaaccatagtcccgcccctaactccgcccatcccgcccctaactccgcccagttccgcccattctccgccccatggctgactaattttttttatttatgcagaggccgaggccgcctctgcctctgagctattccagaagtagtgaggaggcttttttggaggcctaggcttttgcaaaaagctcccgggagcttgtatatccattttcggatctgatcaagagacaggatgaggatcgtttcgcatgattgaacaagatggattgcacgcaggttctccggccgcttgggtggagaggctattcggctatgactgggcacaacagacaatcggctgctctgatgccgccgtgttccggctgtcagcgcaggggcgcccggttctttttgtcaagaccgacctgtccggtgccctgaatgaactgcaggacgaggcagcgcggctatcgtggctggccacgacgggcgttccttgcgcagctgtgctcgacgttgtcactgaagcgggaagggactggctgctattgggcgaagtgccggggcaggatctcctgtcatctcaccttgctcctgccgagaaagtatccatcatggctgatgcaatgcggcggctgcatacgcttgatccggctacctgcccattcgaccaccaagcgaaacatcgcatcgagcgagcacgtactcggatggaagccggtcttgtcgatcaggatgatctggacgaagagcatcaggggctcgcgccagccgaactgttcgccaggctcaaggcgcgcatgcccgacggcgaggatctcgtcgtgacccatggcgatgcctgcttgccgaatatcatggtggaaaatggccgcttttctggattcatcgactgtggccggctgggtgtggcggaccgctatcaggacatagcgttggctacccgtgatattgctgaagagcttggcggcgaatgggctgaccgcttcctcgtgctttacggtatcgccgctcccgattcgcagcgcatcgccttctatcgccttcttgacgagttcttctgagcgggactctggggttcgaaatgaccgaccaagcgacgcccaacctgccatcacgagatttcgattccaccgccgccttctatgaaaggttgggcttcggaatcgttttccgggacgccggctggatgatcctccagcgcggggatctcatgctggagttcttcgcccaccccaacttgtttattgcagcttataatggttacaaataaagcaatagcatcacaaatttcacaaataaagcatttttttcactgcattctagttgtggtttgtccaaactcatcaatgtatcttatcatgtctgtataccgagtaaacttggtctgacagttaccaatgcttaatcagtgaggcacctatctcagcgatctgtctatttcgttcatccatagttgcctgactccccgtcgtgtagataactacgatacgggagggcttaccatctggccccagtgctgcaatgataccgcgagacccacgctcaccggctccagatttatcagcaataaaccagccagccggaagggccgagcgcagaagtggtcctgcaactttatccgcctccatccagtctattaattgttgccgggaagctagagtaagtagttcgccagttaatagtttgcgcaacgttgttgccattgctacaggcatcgtggtgtcacgctcgtcgtttggtatggcttcattcagctccggttcccaacgatcaaggcgagttacatgatcccccatgttgtgcaaaaaagcggttagctccttcggtcctccgatcgttgtcagaagtaagttggccgcagtgttatcactcatggttatggcagcactgcataattctcttactgtcatgccatccgtaagatgcttttctgtgactggtgagtactcaaccaagtcattctgagaatagtgta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gtatgttgcccgtttgt1860cctctaattccaggatcctcaacaaccagcacgggaccatgcaaaacctgcacaactcct1920gctcaaggaacctctatgtttccctcatgttgctgtacaaaacctacggacggaaactgc1980acctgtattcccatcccatcatcttgggctttcgcaaaatacctatgggagtgggcctca2040gtccgtttctcttggctcagtttactagtgccatttgttcagtggttcgtagggctttcc2100cccactgtctggctttcagttatattgatgatgtggttttgggggccaagtctgtacaac2160atcttgagtccctttataccgctgttaccaattttcttttgtctttgggtatacatttaa2220atgtggctgatagggtgcggtgactgtatattgtgcgcgacacccctgtgtacatgtcgt2280gtgggctcagactcgcgcacaagacctctccggcgcgctgctctatacgcgcgctctgcg2340tatagtgtagagagagacacgcgcgcatctctctacacgcacactcgtgtgtgtgtctca2400tctgccgcaccgtgtgcacttcgctcacctctgcacgtcgcatgagacacgtgacaccac2460ggcatctgccgaacgcccacgggaacctgcccaaggtcttgcataagaggactcttggac2520tttcagcaatgtcaacgaccgaccttgaggcatacttcaaagactgtgtgtttaacgagt2580gggaggagtcgggggaggaggttaggttaatgatctttgta2621<210>2<211>1203<212>dna<213>人<400>2atgggaggttggtcttccaaacctcgcaaaggcatggggacaaatctttctgtccccaat60cccctgggattcttccccgatcatcagttggaccctgcattcaaagccaactcagaaaat120ccagattgggacctcaacccgcacaaggacaactggccggacgccaacaaggtgggagtg180ggagcattcgggccagggttcgcacctccccatgggggactgttggggtggagccctcag240gctcagggactactcacaacggtgccagcagttcctcctcctgcctccaccaatcggcag300tcaggaaggcagcctactcccttatctccacctctaagggacactcatcctcaggccatg360cagtggaactccaccactttccaccaaactcttcaagatcccagagtcagggccctgtac420tttcctgctggtggctccagttcaggaacagtgagccctgctcagaatactgtctctgcc480atatcgtcaatcttatcgaagactggggaccctgtaccgaacatggagaacatcgcatca540ggactcctaggacccctgctcgtgttacaggcggggtttttcttgttgacaaaaatcctc600acaataccacagagtctagactcgtggtggacttctctcaattttctaggggaaacaccc660gtgtgtcttggccaaaattcgcagtcccaaatctccagtcactcaccaacctgttgtcct720ccaatttgtcctggatatcgctggatgtgtctgcggcgttttatcatattcctctgcatc780ctgctgctatgcctcatcttcttgttggttcttctggactatcaaggtatgttgcccgtt840tgtcctctaattccaggatcctcaacaaccagcacgggaccatgcaaaacctgcacaact900cctgctcaaggaacctctatgtttccctcatgttgctgtacaaaacctacggacggaaac960tgcacctgtattcccatcccatcatcttgggctttcgcaaaatacctatgggagtgggcc1020tcagtccgtttctcttggctcagtttactagtgccatttgttcagtggttcgtagggctt1080tcccccactgtctggctttcagttatattgatgatgtggttttgggggccaagtctgtac1140aacatcttgagtccctttataccgctgttaccaattttcttttgtctttgggtatacatt1200taa1203<210>3<211>1017<212>dna<213>artificialsequence<220><223>抗原启动子和部分核心抗原序列<400>3aagaggcaggtcccctagaagaagaactccctcgcctcgcagacgaaggtctcaatcgcc60gcgtcgcagaagatctcaatctcgggaatctcaatgttagtattccttggactcataagg120tgggaactttacggggctttattcttctacggtacctagctttaatcctaattggcaaac180tccttcttttcctgacattcatttgcaggaggacattgttgatagatgtaagcaatttgt240ggggccccttacagtaaatgaaaacaggagactaaaattgattatgcctgctaggtttta300tcccaatgttactaaatatttgcccttagataaagggatcaaaccttattatccagagca360tgtagttaatcattacttccagacgagacattatttacacactctttggaaggcgggtat420cttatataaaagagagtccacaagtagcgcctcatattgggggtcaccatattcttggga480acaaaatctacagcatgggaggttggtcttccaaacctcgcaaaggcatggggacaaatc540tttctgtccccaatcccctgggattcttccccgatcatcagttggaccctgcattcaaag600ccaactcagaaaatccagattgggacctcaacccgcacaaggacaactggccggacgcca660acaaggtgggagtgggagcattcgggccagggttcgcacctccccatgggggactgttgg720ggtggagccctcaggctcagggactactcacaacggtgccagcagttcctcctcctgcct780ccaccaatcggcagtcaggaaggcagcctactcccttatctccacctctaagggacactc840atcctcaggccatgcagtggaactccaccactttccaccaaactcttcaagatcccagag900tcagggccctgtactttcctgctggtggctccagttcaggaacagtgagccctgctcaga960atactgtctctgccatatcgtcaatcttatcgaagactggggaccctgtaccgaaca1017<210>4<211>401<212>dna<213>人<400>4atgtggctgatagggtgcggtgactgtatattgtgcgcgacacccctgtgtacatgtcgt60gtgggctcagactcgcgcacaagacctctccggcgcgctgctctatacgcgcgctctgcg120tatagtgtagagagagacacgcgcgcatctctctacacgcacactcgtgtgtgtgtctca180tctgccgcaccgtgtgcacttcgctcacctctgcacgtcgcatgagacacgtgacaccac240ggcatctgccgaacgcccacgggaacctgcccaaggtcttgcataagaggactcttggac300tttcagcaatgtcaacgaccgaccttgaggcatacttcaaagactgtgtgtttaacgagt360gggaggagtcgggggaggaggttaggttaatgatctttgta401<210>5<211>4101<212>dna<213>artificialsequence<220><223>空载体<400>5cggggtcattagttcatagcccatatatggagttagcaggatccggtaccaagcttaagt60ttaaaccgctgatcagcctcgactgtgccttctagttgccagccatctgttgtttgcccc120tcccccgtgccttccttgaccctggaaggtgccactcccactgtcctttcctaataaaat180gaggaaattgcatcgcattgtctgagtaggtgtcattctattctggggggtggggtgggg240caggacagcaagggggaggattgggaagacaatagcaggcatgctggggatgcggtgggc300tctatggcttctgaggcggaaagaaccagctggggctctagggggtatccccacgcgccc360tgtagcggcgcattaagcgcggcgggtgtggtggttacgcgcagcgtgaccgctacactt420gccagcgccctagcgcccgctcctttcgctttcttcccttcctttctcgccacgttcgcc480ggctttccccgtcaagctctaaatcgggggctccctttagggttccgatttagtgcttta540cggcacctcgaccccaaaaaacttgattagggtgatggttcacgtagtgggccatcgccc600tgatagacggtttttcgccctttgacgttggagtccacgttctttaatagtggactcttg660ttccaaactggaacaacactcaaccctatctcggtctattcttttgatttataagggatt720ttgccgatttcggcctattggttaaaaaatgagctgatttaacaaaaatttaacgcgaat780taattataacttcgtatagcatacattatacgaagttatctgtggaatgtgtgtcagtta840gggtgtggaaagtccccaggctccccagcaggcagaagtatgcaaagcatgcatctcaat900tagtcagcaaccaggtgtggaaagtccccaggctccccagcaggcagaagtatgcaaagc960atgcatctcaattagtcagcaaccatagtcccgcccctaactccgcccatcccgccccta1020actccgcccagttccgcccattctccgccccatggctgactaattttttttatttatgca1080gaggccgaggccgcctctgcctctgagctattccagaagtagtgaggaggcttttttgga11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