本发明涉及一种复合微生物制剂，特别涉及一种用于水稻立枯病防治。本发明还涉及所述复合微生物菌剂的生产方法及其用途。
技术背景
水稻立枯病是水稻旱育秧田常发的一种毁灭性病害由镰刀菌、丝核菌等土壤习居菌及不良的气候、环境条件(低温、盐碱等)综合引起。控制不当很容易造成大面积死苗、毁苗的现象，不仅浪费人力、财力，更重要的是延误农时，影响育秧质量和进度,特别是机械作业，降低水稻产量，因此危害极大。
目前，我国农作物病虫害的防治主要依赖化学农药。化学农药的使用确实对病虫害的防治起了非常重要的作用，但也引起了一系列的环境和社会问题。化学农药是农业面源污染的主要来源，而农业面源污染对生态环境的冲击可谓是全方面的，涉及到了以人为中心的整个食物链，其中对水体造成的危害最为直接、最为显著。由于化学农药的弊端，微生物产品以其不污染环境、保持生态平衡、保持农林业的可持续发展、对人畜及害虫天敌极少或完全没有毒害作用的特点越来越受到人们的关注。因此，本发明通过对水稻立枯病发生病害严重的土壤，进行微生物的分离纯化，筛选出对水稻立枯病具有较好抑制作用的拮抗菌，并通过菌株之间的拮抗作用和优化菌种的配比与发酵条件，制备出稳定、高效的复合微生物制剂产品。
技术实现要素：
(一)要解决的技术问题
本发明的目的在于针对上述现有技术的不足，公开了一种复合微生物制剂，用于防治水水稻立枯病。本发明还公开了该菌剂的生产方法和用途。
(二)技术方案
本发明从23个不同属、种中筛选出最佳稳定共生菌种组合，通过单独培养筛选高产菌种。筛选出的菌种为哈茨木霉q2(trichodermaharzianum)、酿酒酵母t1(saccharomycescerevisiae)、解淀粉芽孢杆菌j12(bacillusamyloliquefaciens)。
根据上述筛选结果，本发明设计了一种复合微生物制剂，包括哈茨木霉q2(trichodermaharzianum)0.5×109cfu/ml、酿酒酵母t1(saccharomycescerevisiae)0.5×109cfu/ml、解淀粉芽孢杆菌j12(bacillusamyloliquefaciens)1.5×109cfu/ml；
优选地，
哈茨木霉q2(trichodermaharzianum)0.8×109cfu/ml、酿酒酵母t1(saccharomycescerevisiae)0.8×109cfu/ml、解淀粉芽孢杆菌j12(bacillusamyloliquefaciens)1.2×109cfu/ml；
本发明所述的复合微生物制剂的生产方法，包括如下步骤：
1)哈茨木霉q2、酿酒酵母t1、解淀粉芽孢杆菌j12原始菌种无菌条件下分别接种于固体培养基上，哈茨木霉q2和酿酒酵母t1于30℃条件下培养4天；；解淀粉芽孢杆菌j12于37℃条件下培养2天；
2).一级种子培养：将步骤1)培养的菌种无菌条件下分别接种于液体培养基，哈茨木霉q2、酿酒酵母t1于30℃条件下培养4天、解淀粉芽孢杆菌j12于37℃条件下培养2天，制得一级种子，结束培养各酿酒酵母、解淀粉芽孢杆菌悬液光密度od600值均分别达到4.0、3.0；
3).二级种子培养：按液体培养基的体积比为15％的接种量，将一级种子分别接种到100l的发酵罐中，发酵罐内培养液的总体积为70l，30℃-35℃条件下，搅拌速度为200r/min，通气量为1：2.0，哈茨木霉q2、酿酒酵母t1培养3天，解淀粉芽孢杆菌j12培养1天制得二级种子；
4).混合发酵培养：按液体培养基的体积比为15％的接种量，将二级种子接种到1吨的发酵罐中，发酵罐内的培养基总体积为700l，进行发酵培养，获得菌剂。
其中，步骤1)、2)、3)中所用的培养基哈茨木霉q2、酿酒酵母t1为pda培养基，解淀粉芽孢杆菌j12为lb培养基。
其中，步骤4)所用的培养基的配方按质量百分比为：糖蜜10％、鱼蛋白胨2％、豆饼粉15％，余量为水；
发酵培养采用补料分批培养方式，其中补料碳源为：葡萄糖；氮源为：鱼蛋白胨。
发酵培养阶段：起始0～24小时内，间隔通气，保持在有氧条件发酵，通气量1：2.0，搅拌转速200r/min，搅拌间隔时间3.5小时，搅拌4分钟，温度30℃-35℃。
本发明所述复合微生物制剂可作为生防制剂用于防治水稻立枯病。
(三)有益效果
本发明用于防治水稻立枯病土传病害，作用效果明显。
具体实施方式
下面结合实施例对本发明作进一步的说明，但不用来限制本发明所要保护的范围。
实施例1复合微生物制剂的构成
总菌数为2.8×109cfu/ml
哈茨木霉q20.8×109cfu/ml
酿酒酵母t10.8×109cfu/ml
解淀粉芽孢杆菌j121.2×109cfu/ml
实施例2复合微生物制剂的构成
总菌数为2.5×109cfu/ml
哈茨木霉q21.0×109cfu/ml
酿酒酵母t11.0×109cfu/ml
解淀粉芽孢杆菌j120.5×109cfu/ml
实施例3复合微生物制剂的生产方法
1).斜面培养：哈茨木霉q2、酿酒酵母t1、解淀粉芽孢杆菌j12原始菌种无菌条件下分别接种于固体培养基上，哈茨木霉q2和酿酒酵母t1于30℃条件下培养3-4天；；解淀粉芽孢杆菌j12，37℃条件下培养1-2天。
2).一级种子培养：将步骤1)培养的菌种无菌条件下分别接种于液体培养基，哈茨木霉q2、酿酒酵母t1于30℃条件下培养3-4天、解淀粉芽孢杆菌j12于37℃条件下培养1-2天，制得一级种子，结束培养各酿酒酵母、解淀粉芽孢杆菌悬液光密度od600值均分别达到4.0、3.0；
3).二级种子培养：按液体培养基的体积比为10％的接种量，将一级种子分别接种到70l的发酵罐中，发酵罐内培养液的总体积为100l，25℃-35℃条件下，搅拌速度为120r/-200min，通气量为1：1.5-2.0，哈茨木霉q2、酿酒酵母t1培养3-4天，解淀粉芽孢杆菌j12培养1-2天制得二级种子；
4).混合发酵培养：按液体培养基的体积比为10－15％的接种量，将二级种子接种到1吨的发酵罐中，发酵罐内的培养基总体积为700l，进行发酵培养，获得菌剂，
其中，步骤1)、2)、3)中所用的培养基哈茨木霉q2、酿酒酵母t1为pda培养基，解淀粉芽孢杆菌j12为lb培养基。
其中，步骤4)所用的培养基的配方按质量百分比为：糖蜜8-10％、鱼蛋白胨2-5％、豆饼粉10-15％，余量为水；
发酵培养采用补料分批培养方式，其中补料碳源为：葡萄糖、蔗糖；氮源为：鱼蛋白胨、豆饼粉。
发酵培养阶段：起始0～24小时内，间隔通气，保持在有氧条件发酵，通气量1：1.8，搅拌速度150r-200/min，搅拌间隔时间3-5小时，搅拌3-5分钟，温度25℃-35℃。
实施例4复合微生物制剂的生产方法
1)哈茨木霉q2、酿酒酵母t1、解淀粉芽孢杆菌j12原始菌种无菌条件下分别接种于固体培养基上，哈茨木霉q2和酿酒酵母t1于30℃条件下培养4天；解淀粉芽孢杆菌j12于37℃条件下培养2天；
2).一级种子培养：将步骤1)培养的菌种无菌条件下分别接种于液体培养基，哈茨木霉q2、酿酒酵母t1于30℃条件下培养4天、解淀粉芽孢杆菌j12于37℃条件下培养2天，制得一级种子，结束培养各酿酒酵母、解淀粉芽孢杆菌悬液光密度od600值均分别达到4.0、3.0；
3).二级种子培养：按液体培养基的体积比为15％的接种量，将一级种子分别接种到100l的发酵罐中，发酵罐内培养液的总体积为70l，30℃-35℃条件下，搅拌速度为200r/min，通气量为1：2.0，哈茨木霉q2、酿酒酵母t1培养3天，解淀粉芽孢杆菌j12培养1天制得二级种子；
4).混合发酵培养：按液体培养基的体积比为15％的接种量，将二级种子接种到1吨的发酵罐中，发酵罐内的培养基总体积为700l，进行发酵培养，获得菌剂。
其中，步骤1)、2)、3)中所用的培养基哈茨木霉q2、酿酒酵母t1为pda培养基，解淀粉芽孢杆菌j12为lb培养基
其中，步骤4)所用的培养基的配方按质量百分比为：糖蜜10％、鱼蛋白胨2％、豆饼粉15％，余量为水；
发酵培养采用补料分批培养方式，其中补料碳源为：葡萄糖；氮源为：鱼蛋白胨。
发酵培养阶段：起始0～24小时内，间隔通气，保持在有氧条件发酵，通气量1：2.0，搅拌转速200r/min，搅拌间隔时间3.5小时，搅拌4分钟，温度30℃-35℃。
实施例5对水稻立枯病的防治效果
方法：以灭菌的草炭土为基质，温室育苗钵育苗，每盆装土400g并播种20粒种子，每个处理重复4次，种子处理按实例一复合微生物制剂和50％多菌灵可湿性粉剂分别按0.3％拌种。置于温室中生长，每天视水稻苗生长情况补充水分。立枯丝核菌接种采用菌土法：将培养10d的立枯丝核菌病菌接种于1∶4的水稻、砂子培养基上，1周后按2％的接菌量与灭菌的草炭土混合均匀，分装于育苗钵内，然后再将经不同药剂处理的水稻种子分别播种于育苗盘中，置温度25-28℃温室中培养。各处理出苗后20d调查各盆水稻植株的发病率，统计各个处理的防治效果。各处理盆水稻出苗后25d进行秧苗素质调查，将每盆随机拔稻苗10株，测量其株高、根长、鲜重、干重。
发病率(％)＝发病的苗数/调查的菌数×100
防治效果(％)＝(对照发病率-处理发病率)/对照发病率×100
处理：
处理1实例一菌剂
处理2多菌灵
ck清水对照
表1立枯丝核菌引起的水稻立枯病的对秧苗素质的防治效果
由表1数据可见，多菌灵与按照实例一配置的复合微生物制剂对水稻立枯病发病与防效差异很小，但施用菌剂的秧苗素质要明显强于施用多菌灵处理，在目前国家对于农药施用零增长的政策下以及使用农药带来的一系列危害，可见复合微生物制剂具有广阔的应用前景。