一种外泌体总RNA的提取方法与流程

本发明涉及一种外泌体总rna的提取方法，属于生物活性物质提取领域。

背景技术：

当外泌体在1980年首次被发现后，其被认为是细胞排泄废物的一种方式，如今随着大量对其生物来源、其物质构成及运输、细胞间信号的传导以及在体液中的分布的研究发现外泌体具有多种多样的功能。外泌体的功能取决于其所来源的细胞类型，其可参与到机体免疫应答、抗原提呈、细胞迁移、细胞分化、肿瘤侵袭等方方面面。有研究表明肿瘤来源的外泌体参与到肿瘤细胞与基底细胞的遗传信息的交换，从而导致大量新生血管的生成，促进了肿瘤的生长与侵袭。

人体内多种细胞及体液均可分泌外泌体，包括内皮细胞、免疫细胞、血小板、平滑肌细胞等。当其由宿主细胞被分泌到受体细胞中时，外泌体可通过其携带的蛋白质、核酸、脂类等来调节受体细胞的生物学活性。外泌体介导的细胞间通讯主要通过以下三种方式：一是外泌体膜蛋白可以与靶细胞膜蛋白结合，进而激活靶细胞细胞内的信号通路。二是在细胞外基质中，外泌体膜蛋白可以被蛋白酶剪切，剪切的碎片可以作为配体与细胞膜上的受体结合，从而激活细胞内的信号通路。有报道称一些外泌体膜上蛋白在其来源细胞膜上未能检测出。三是外泌体膜可以与靶细胞膜直接融合，非选择性的释放其所含的蛋白质、mrna以及microrna。

中国发明专利申请cn201610021424.5公开了一种血清外泌体中rna的提取方法，其包括以下步骤：1)提取血清中的外泌体；2)在超声的作用下使用rna提取试剂裂解步骤1)中提取的外泌体；3)使用氯仿分离步骤2)中裂解后的外泌体的rna至水相；4)使用异丙醇沉淀步骤3)得到的水相中的rna；5)使用乙醇洗涤步骤4)中沉淀的rna，之后再次溶解rna，即得所述血清外泌体中的rna。本发明的血清外泌体中rna的提取方法具有提取时间短、效率高、效果好、试验成本低的优点。

中国专利申请cn201510488030.6提供了一种外泌体mirna的定量检测方法，包括外泌体总rna提取、3’端和5’端特异性唯一标签接头连接、反转录合成cdna并进行pcr扩增、mirna文库的筛选纯化与上机测序、纠错算法的信息分析等步骤。该方法基于特异性的唯一标签接头的标记，对每个原始模板进行区分，避免了扩增时分子间存在的偏好性，可以精确检测低于10拷贝以下的mirna分子，且特异性高，可用于肿瘤源性的外泌体mirna的检测，神经退行性疾病、心血管疾病，生育健康等领域的检测，可为疾病的早期筛查提供依据，还可应用于其他小rna精准定量检测领域。

技术实现要素：

本发明目的在于提供一种外泌体总rna的提取方法。该方法包括超速离心法提取外泌体和外泌体中rna的提取步骤，提取得到的样品经过检测包括18s和28srna，其含量较高，提取方法可行性强，适宜推广应用。

一种外泌体总rna的提取方法，其包括如下步骤：

1)超速离心法提取外泌体：

将样本加入离心管，300xg，4℃离心10min，吸取上清到离心管中，2000xg，4℃离心10min，吸取上清到离心管中，10000xg，4℃离心30min；吸取上清到离心管，100000xg，4℃离心70min，去除上清，保留沉淀，沉淀中含有外泌体和部分杂蛋白，加入1xpbs缓冲液重悬，100000xg，4℃离心70min，去除上清后得到的沉淀即为外泌体；向外泌体中加入140μl1xpbs缓冲液重悬保存得到外泌体保存液；

2)外泌体中rna的提取：

a.向外泌体保存液中加入700μl的qiazollysisreagent，使用移液枪吹打混匀，室温条件下静置5～10min，向其中加入140μl的氯仿，温和颠倒混匀后混合液呈粉红色，室温条件下静置2～3min；将混合液在12000xg，4℃离心15min，离心结束后液体分层，吸取上层水相rna层到离心管；

b.向其中加入1.5倍体积的无水乙醇，吹打数次混匀后转移700μl混合液到离心收集管中，套上2ml收集管，≥8000xg，室温条件下离心15s，重复b步骤，直到所有液体都进行一次过柱；

c.向其中加入700μlbufferrwt，≥8000xg，室温离心15s，加入500μl的bufferrpe，≥8000xg，室温离心15s，再次加入500μl的bufferrpe，≥10000xg，室温离心2min，将吸附柱套于一个新的2ml收集管中，全速离心1min，去除收集管；将吸附柱转移到一个1.5ml离心管中，打开盖子，室温风干3～5min；加入24～40μl的depc水或无rnase水，室温静置3～5min，然后≥8000xg，室温离心1min，即可得到rna溶液。

上述所述的rna的提取方法中，所述的样本为细胞培养液/血清/血浆中的一种。

上述所述的rna的提取方法中，所述步骤2)a中离心结束后液体分成三层，其中上层为水相rna层，中层为蛋白层，下层为有机相。

一种利用上述rna的提取方法制备得到的rna检测方法，其包括如下步骤：

a)进行rnaagilent2100检测前，所使用的ladder应在70℃下预变性2min，然后迅速放于冰上，静置5min，分装成小管后放于-80℃备用，其余试剂放于室温备用；

b)装配加样压胶台并将平台配件调节到适当的档位：

c)准备试剂：吸取550μl的胶溶液到试剂盒中的离心过滤柱中，1,500xg±20％，室温离心10min，去除过滤柱保留过滤液体胶；每次检测时使用吸取65μl的液体胶到一个洁净离心管中，并加入1μl的荧光染料，充分混匀，13000xg，室温离心10min，得到混合胶溶液；

d)rna检测：向对应的孔位加入9μl混合胶溶液，盖紧压胶平台，将注射器压下，静置30s；释放注射器，待注射器恢复到原位置时打开平台，在对应的孔位中加入9μl混合胶溶液；向如图所示加入每孔5μl的marker溶液，向对应孔位加入1μl变性的ladder溶液，其余孔依次加入1μlrna样本；加样完毕后放于振荡器中震荡混匀1min；打开仪器软件，设置程序，选择rna→eukaryoternananochip→start运行程序，即可得到各孔位的峰图。

本发明通过检测发现，采用本发明提取工艺制备得到的rna包括18srna和28srna，rna在提取过程中无丢失，且制备效率高，适宜进行推广应用。本发明使用乙醇作为rna的沉淀溶剂要显著优于其他溶剂，其与其他溶剂相比具有显著的提高rna浓度和rna纯度的作用。本发明使用bufferrwt和bufferrpe组合的处理工艺对rna进行纯化，可以明显提高rna的纯度以及rna的浓度。其在rna纯度和浓度的提升方面具有关键作用。本发明所使用的外泌体裂解试剂效率高，所获得的rna的浓度显著高于对照实施例，且本发明使用超速离心发提取外泌体，其极大地减少了外来试剂对于外泌体的消耗作用，从而提高了rna的浓度和纯度。

附图说明

图1为本发明外泌体总rna提取方法中平台孔位加样示意图，其中a、b对应孔位加入混合胶溶液，c孔位加入mark溶液，d对应孔位加入ladder溶液，e对应孔位加入提取得到的样品溶液。

图2为本发明外泌体总rna提取方法中ladder峰形图。

图3为本发明外泌体总rna提取方法中mark峰形图。

图4为本发明外泌体总rna提取方法中加入样品和mark的峰形图。

具体实施方式

以下通过具体实施方式进一步描述本发明，但所述实施例并不以任何方式限定本发明专利保护的范围。

实施例1一种外泌体总rna的提取方法

一种外泌体总rna的提取方法，其包括如下步骤：

1)超速离心法提取外泌体：将样本加入离心管，300xg，4℃离心10min，吸取上清到离心管中，2000xg，4℃离心10min，吸取上清到离心管中，10000xg，4℃离心30min；吸取上清到离心管，100000xg，4℃离心70min，去除上清，保留沉淀，沉淀中含有外泌体和部分杂蛋白，加入1xpbs缓冲液重悬，100000xg，4℃离心70min，去除上清后得到的沉淀即为外泌体；向外泌体中加入140μl1xpbs缓冲液重悬保存得到外泌体保存液；上述所述的rna的提取方法中，所述的样本为细胞培养液/血清/血浆中的一种。

2)外泌体中rna的提取：向外泌体保存液中加入700μl的qiazollysisreagent，使用移液枪吹打混匀，室温条件下静置5～10min，向其中加入140μl的氯仿，温和颠倒混匀后混合液呈粉红色，室温条件下静置2～3min；将混合液在12000xg，4℃离心15min，离心结束后液体分成三层，其中上层为水相rna层(约300～400μl)，中层为蛋白层，下层为有机相，吸取水相rna层到离心管，向其中加入1.5倍体积的无水乙醇(450～600μl)，吹打数次混匀后转移700μl混合液(包括沉淀)到离心收集管中，套上2ml收集管，≥8000xg，室温离心15s，重复上一步，直到所有液体都进行一次过柱，

向其中加入700μlbufferrwt，≥8000xg，室温离心15s，加入500μl的bufferrpe，≥8000xg，室温离心15s，再次加入500μl的bufferrpe，≥10000xg，室温离心2min，将吸附柱套于一个新的2ml收集管中，全速离心1min，去除收集管将吸附柱转移到一个1.5ml离心管中，打开盖子，室温风干3～5min；加入24～40μl的depc水或无rnase水，室温静置3～5min，然后≥8000xg，室温离心1min，收集rna溶液，保留备用。

一种上述提取方法获得的rna检测方法，其包括如下步骤：

a)进行rnaagilent2100检测前，所使用的ladder应在70℃下预变性2min，然后迅速放于冰上，静置5min，分装成小管后放于-80℃备用，其余试剂放于室温备用。

b)装配加样压胶台并将平台配件调节到适当的档位：

c)准备试剂：吸取550μl的胶溶液到试剂盒中的离心过滤柱中，1,500xg±20％，室温离心10min，去除过滤柱保留过滤液体胶；每次检测时使用吸取65μl的液体胶到一个洁净离心管中，并加入1μl的荧光染料，充分混匀，13000xg，室温离心10min，得到混合胶溶液；

d)向图1对应的孔位加入9μl混合胶溶液，同时，盖紧压胶平台，将注射器压下静置30s，压下前确认注射器位置为1ml位置，释放注射器，待注射器恢复到1ml位置。

e)打开平台，同时在图2对应的孔位加入9μl混合胶溶液：然后再向如图所示加入每孔5μl的marker溶液(包括ladder孔)。若rna浓度较低，可选择加入适当量的marker，如血清外泌体rna提取获得rna量较少，同时片段较小，可用灭菌水代替marker

f)向如图中加入1μl变性的ladder溶液，其余孔依次加入1μlrna样本，放于振荡器中震荡混匀1min(仪器默认)：

g)打开仪器软件，设置程序，选择rna→eukaryoternananochip→start运行程序，如图所示分别为ladder和样本的峰图：

由图2-图4可以看出，25nt(20～25s间)处为marker峰。本发明通过检测发现，采用本发明提取工艺制备得到的rna包括18srna和28srna，rna在提取过程中无丢失，且制备效率高，适宜进行推广应用。

参比实施例1

除步骤2)中乙醇替换为异丙醇外，其余同实施例1。

参比实施例2

除步骤2)缺少“向其中加入700μlbufferrwt，≥8000xg，室温离心15s，加入500μl的bufferrpe，≥8000xg，室温离心15s，再次加入500μl的bufferrpe，≥10000xg，室温离心2min，将吸附柱套于一个新的2ml收集管中，全速离心1min，去除收集管将吸附柱转移到一个1.5ml离心管中，打开盖子，室温风干3～5min；”外，其余同实施例1

对照实施例1按照201610021424.5实施例1和实施例2所述的制备工艺制备外泌体rna。

试验例

使用同一血清样本，分别按照实施例1，参比实施例1，参比实施例2以及对照实施例所述的工艺提取外泌体rna，测定rna的纯度和rna浓度。测定结果如表1所示。

表1使用不同工艺提取样本中外泌体rna的纯度和浓度分析

从上表可以看出：

1)对比实施例1和参比实施例1可以看出，本发明使用乙醇作为rna的沉淀溶剂要显著优于其他溶剂，其与其他溶剂相比具有显著的提高rna浓度和rna纯度的作用。

2)对比实施例1和参比实施例2可以看出，本发明使用bufferrwt和bufferrpe组合的处理工艺对rna进行纯化，可以明显提高rna的纯度以及rna的浓度。其在rna纯度和浓度的提升方面具有关键作用。

3)对比实施例1和对照实施例1可以看出，本发明所使用的外泌体裂解试剂效率高，所获得的rna的浓度显著高于对照实施例，且本发明使用超速离心发提取外泌体，其极大地减少了外来试剂对于外泌体的消耗作用，从而提高了rna的浓度和纯度。