一株脱氮副球菌及其在畜禽养殖场废水处理中的应用的制作方法

本发明涉及生物
技术领域：
，尤其涉及一株脱氮副球菌的分离鉴定、培养方法及其在畜禽养殖场废水处理中的应用。
背景技术：
：随着社会和经济的发展，集约化畜禽养殖规模越来越大，生产效率提高，经济效益增加，但同时大量畜禽排泄物和废水的产生，造成畜禽业发展与环境污染之间的矛盾日益凸显，粪尿废水过度集中给生态环境带来了极大的压力。畜禽养殖业是我国农业的主导产业之一，而畜禽养殖污染则成为农业面源污染的主要原因之一。大量的畜禽养殖废水成为污染源，如得不到及时处理，必将对环境造成极大危害，导致生态环境恶化，畜禽产品品质下降并危及人体健康，养殖废水治理技术的滞后也将严重制约养殖业的可持续发展。集约化养殖废水主要来源于动物的排泄物及冲洗用水，具有较高浓度的氨氮和有机物，化学需氧量高，臭味大。有研究表明，猪场废水中氨氮浓度高达800—2000mg/l，化学需氧量高达5000—20000mg/l。废水若未得到有效处理直接排入水体容易造成水体富营养化和地下水污染。目前，对这类废水的处理主要包括物化、生化和自然生态等，其中生物脱氮工艺简单，成本低，对环境负荷小，脱氮更彻底。脱氮副球菌(paracoccusdenitrificans)是异养硝化、好氧反硝化菌菌种之一，能直接把氨态氮转化为最终气态产物逸出，使同时硝化反硝化生物脱氮技术成为可能。与传统的自养硝化细菌相比较，异养硝化细菌生长速率快、作用速率高。畜禽养殖业中广泛使用抗生素来预防和治疗动物疾病，但这些抗生素只有很少一部分被动物机体利用，绝大部分通过尿液和粪便排出体外，养殖废水是抗生素污染的重要来源，环境中抗生素富集会对生态环境和人类健康造成威胁。对抗生素污染的处理方法主要有非生物降解和生物降解2种，微生物降解是生物降解的方式之一。探寻新的抗生素降解微生物菌株可以为未来微生物资源和技术处理环境中抗生素类污染物提供参考。技术实现要素：本发明的目的是针对现有养殖废水处理技术的不足，提供了一株脱氮副球菌，该菌株在去除氨氮的同时能够去除养殖废水中的氟喹诺酮类抗生素。所述的脱氮副球菌已于2017年5月5日保藏于中国典型培养物保藏中心(cctcc)，分类命名：脱氮副球菌(paracoccusdenitrificans)tdfq-1，保藏编号为cctccno：m2017238地址：中国武汉武汉大学。本发明的另一个目的在于提供了脱氮副球菌tdfq-1的制备方法，方法简单，发酵液中有效菌浓度高，适应于大规模生产。本发明还有一个目的在于提供了脱氮副球菌tdfq-1的应用，本发明提供的脱氮副球菌可用于同时去除水中的氨氮及氟喹诺酮类抗生素，特别适用于养殖废水的处理。为了达到上述目的，本发明采取以下技术措施：脱氮副球菌(paracoccusdenitrificans)tdfq-1的获得：申请人自湖北随州猪厂污水中，筛选高效的异养硝化细菌，通过大量筛选，生理生化及16s鉴定，最终筛选获得一株脱氮副球菌菌株，所述的脱氮副球菌已于2017年5月5日保藏于中国典型培养物保藏中心(cctcc)，分类命名：脱氮副球菌(paracoccusdenitrificans)tdfq-1，保藏编号为cctccno：m2017238地址：中国武汉武汉大学。脱氮副球菌(paracoccusdenitrificans)tdfq-1的生物学特性如下所述：该菌株在有机和无机培养基中均能生长，在营养琼脂(na)培养基上繁殖生长形成圆形菌落，菌落大小1-2mm，表面光滑湿润。该菌镜检为革兰氏阴性，单个、成对或成堆，对数生长期为球形或近球形，平均大小为1.1×1.3um，静止期菌体为球形，直径1um。不水解明胶、淀粉；不利用d-阿拉伯糖、精氨酸；可利用蔗糖、海藻糖、麦芽糖、甘露醇为唯一碳源生长；铵盐和硝酸盐都能作为氮源；能用氧或硝酸盐作为电子受体，硝酸盐被还原成氧化亚氮和分子态氮。最适温度30℃，温度范围5-37℃。将其16srrna基因测序，结果在ncbi进行blastn比对，发现其16srrna与脱氮副球菌(nr114145.1)的序列同源性最高，相似性为99％。脱氮副球菌(paracoccusdenitrificans)tdfq-1的制备方法，包括：将脱氮副球菌(paracoccusdenitrificans)tdfq-1种子液按1-10％(v/v)接种量接种于50l发酵罐中扩大培养，发酵罐装液量为30-35l，控制搅拌转速维持溶氧在15％-18％，28-32℃培养18-22h收集发酵液。所述的发酵罐，其灌装的发酵培养基的配方包括：蛋白胨5g，酵母膏5g，nacl2g，mgso40.03g，na2hpo40.25g，kh2po40.75g，feso40.03g，mnso40.01g，cacl20.2g，甘油6.0g，加水定容至1l，调节ph7.5。以上所述的方案中，优选的，接种量为3％，发酵罐的装液量为35l，溶氧为16％，培养温度为30℃。脱氮副球菌tdfq-1的应用，包括利用本发明的脱氮副球菌tdfq-1用于处理畜禽废水，或是用于同时处理含有高氨氮和抗生素的污水。所述的抗生素优选诺氟沙星、环丙沙星或恩诺沙星。本发明具有如下优点：本发明提供的脱氮副球菌tdfq-1具有异养硝化-好氧反硝化作用，在有机和无机培养基中均能生长，异养生长速率大大高于自养生长速率。脱氮副球菌tdfq-1能在含有高浓度有机物和nh3-n的养殖废水中生长，具有高效硝化和反硝化能力，通过异养硝化作用分解有机物质，将铵态氮转化为硝态氮和亚硝态氮，通过好氧反硝化作用将亚硝态氮还原为氮气或一氧化二氮。本发明菌株在进行硝化作用的同时，可以降解养殖废水中喹诺酮类物质，减少畜禽抗生素的过度使用和排放对土壤和地下水的污染，避免抗生素通过食物链的积累效果对人体健康产生影响。本发明的脱氮副球菌(paracoccusdenitrificans)tdfq-1具有易于发酵培养，生产成本低，能够在含高浓度有机物的废水中生长繁殖，把养殖废水中的氨氮转化为新的菌体细胞及无害的n2，高效去除其中的氨氮、总氮，相比较于物理和化学处理法，其具有投资少能耗低的优点。在nb中培养18h，活菌含量达到5.84×109cfu/ml，在优化后的发酵培养基中培养18h,活菌含量可以达到8.92×109cfu/ml，活菌数提高了52.74％。将tdfq-1制剂用于处理养猪场废水，用该制剂处理猪场养殖废水，猪场养殖废水中的氨氮和总氮的含量由tdfq-1处理前的562.08mg/l、645.66mg/l降低到54.21mg/l、85.84mg/l，分别减少90.35％和86.71％。处理鸡场养殖废水，鸡场养殖废水中的氨氮和总氮的含量由tdfq-1处理前的662.37mg/l、695.83mg/l降低到54.36mg/l、69.11mg/l，分别减少91.79％和90.07％。在高效去除养殖场废水中的氨氮和总氮的同时，tdfq-1还可以降解废水中的喹诺酮类抗生素。在猪场养殖废水中，使用tdfq-1制剂的试验组和不使用该制剂的对照组相比较，，诺氟沙星降解率为93.41％，提高了69.36％；环丙沙星降解率为96.93％，提高了68.59％；恩诺沙星降解率为93.82％，提高了51.35％。使用tdfq-1的试验组中3种喹诺酮类抗生素的降解率均达到了90％以上。附图说明图1为griess试剂显色法初筛去氨氮细菌示意图；其中：e孔为tdfq-1，h孔为对照。图2为脱氮副球菌(paracoccusdenitrificans)tdfq-1的16srdna系统发育进化树。图3为脱氮副球菌(paracoccusdenitrificans)tdfq-1光学显微照片(400倍)。图4为脱氮副球菌(paracoccusdenitrificans)tdfq-1生长曲线图。图5为总氮测定标准曲线。图6为氨氮测定标准曲线。图7为脱氮副球菌(paracoccusdenitrificans)tdfq-1对猪场养殖废水中喹诺酮类抗生素降解效果示意图。具体实施方式本发明所述技术方案，如未特别说明，均为本领域的常规技术；所述试剂或材料，如未特别说明，均来源于商业渠道。本发明实施例所用培养基如下：液体种子培养集(nb)的配方(1l)：牛肉膏5g，蛋白胨10g，氯化钠5g，加水定容至1l；固体种子培养基(na)的配方(1l)：牛肉膏5g，蛋白胨10g，氯化钠5g，琼脂15g，加水定容至1l。发酵培养基(1l)：蛋白胨5g，酵母膏5g，nacl2g，mgso40.03g，na2hpo40.25g，kh2po40.75g，feso40.03g，mnso40.01g，cacl20.2g，甘油6.0g，加水定容至1l，调节ph7.5。液体硝化培养基(yw)配方(1l)：(nh4)2so42g，mnso40.01g，mgso40.03g，na2hpo40.25g，kh2po40.75g，cacl20.2g，feso40.03g，甘油6g，加水定容至1l，调节ph7.8。实施例1：脱氮副球菌(paracoccusdenitrificans)tdfq-1的获得：从南湖、湖北随州某猪场、湖北安陆某鸡场采集湖水及养殖场废水，以(nh4)2so4为唯一氮源，在yw液体培养基中富集培养能利用氨氮为氮源生长的细菌，30℃，200rpm培养72h，在yw培养基中连续富集传代3次，培养液稀释后涂平板，挑取单菌落接种于yw液体培养基摇瓶培养，用griess试剂显色法筛选硝化能力强的菌株(见图1)。液体硝化培养基(yw)配方：(nh4)2so42g，mnso40.01g，mgso40.03g，na2hpo40.25g，kh2po40.75g，cacl20.2g，feso40.03g，甘油6g，ph7.8。菌种16s鉴定对分离获得的7株菌进行鉴定，利用已发表的16s通用引物(27f和1492r，引物序列为27f：5’-agagtttgatcctggctcag-3’；1492r：5’-ggttaccttgttacgactt-3’)对7株菌的16srrna基因序列进行扩增和测序，pcr扩增产物送生工生物工程(上海)股份有限公司测序。测序序列在ncbi进行blastn比对，并利用mega软件中的clusterw构建系统进化发育树(进化树见图2)，同源性比对结果显示这7株菌分别为2株芽孢杆菌、2株脱氮副球菌、1株假单胞菌、1株红串红球菌、1株颗粒申氏杆菌，分别命名为芽孢杆菌(bacillussp)xhyb-1、芽孢杆菌(bacillussp)xhyb-2、脱氮副球菌(paracoccusdenitrificans)tdfq-1、脱氮副球菌(paracoccusdenitrificans)tdfq-2、红串红球菌(rhodococcuserythropolis)hchq、假单胞菌(pseudomonassp)jdb、颗粒申氏杆菌(shinellagranuli)klss，其中脱氮副球菌(paracoccusdenitrificans)tdfq-1在显色法分离筛选过程中变色最明显，说明其异养硝化能力最强。生理生化鉴定tdfq-1：tdfq-1在营养琼脂(na)培养基上繁殖生长形成圆形菌落，菌落大小1-2mm，表面光滑湿润。该菌镜检为革兰氏阴性，单个、成对或成堆，对数生长期为球形或近球形，平均大小为1.1×1.3um，静止期菌体为球形，直径1um。不水解明胶、淀粉；不利用d-阿拉伯糖、精氨酸；可利用蔗糖、海藻糖、麦芽糖、甘露醇为唯一碳源生长；铵盐和硝酸盐都能作为氮源；能用氧或硝酸盐作为电子受体。与《伯杰细菌鉴定手册》中脱氮副球菌生理生化特性一致，确认该菌为脱氮副球菌(paracoccusdenitrificans)。tdfq-1光学显微照片见图3。所述的脱氮副球菌已于2017年5月5日保藏于中国典型培养物保藏中心(cctcc)，分类命名：脱氮副球菌(paracoccusdenitrificans)tdfq-1，保藏编号为cctccno：m2017238地址：中国武汉武汉大学。实施例2：脱氮副球菌(paracoccusdenitrificans)tdfq-1的制备：1)脱氮副球菌(paracoccusdenitrificans)tdfq-1的生长曲线将活化好的脱氮副球菌(paracoccusdenitrificans)tdfq-1按1％(v/v)的接种量分别接种于200mlnb和200ml发酵培养基，30℃，200rpm摇床培养，每隔2h取样测定od600值，以时间为横坐标，od600值为纵坐标绘制生长曲线，见图4。表1脱氮副球菌(paracoccusdenitrificans)tdfq-1生长曲线数据生长曲线代表微生物的生长特性，根据微生物的生长曲线可以明确微生物的生长规律，测定其到达稳定期的时间能够确定合适的发酵培养时间，对生产实践具有一定的指导意义。结果表明，在nb培养基中，tdfq-1从第4h进入对数生长期，18h到达稳定期，4-18h间处于快速生长的对数生长期；在发酵培养基中tdfq-1从第4h进入对数生长期，18h到达稳定期，4-18h间处于快速生长的对数生长期。由tdfq-1的生长曲线可知，本发明菌株在18h时即可达到稳定期，生长周期短，在大规模发酵培养条件下，可以降低生产成本。2)脱氮副球菌(paracoccusdenitrificans)tdfq-1的制备：将脱氮副球菌(paracoccusdenitrificans)tdfq-1种子液按1％(v/v)的接种量接种于200ml发酵培养基，30℃，200rpm摇床培养18h(达到稳定期时间点)，活菌数达到8.92×109cfu/ml。而tdfq-1在同样条件下接种于nb培养基中培养18h时,活菌数为5.84×109cfu/ml，相比较活菌数提高了52.74％。将脱氮副球菌(paracoccusdenitrificans)tdfq-1种子液按3％(v/v)接种量接种于50l发酵罐中扩大培养，发酵罐装液量是为35l，控制搅拌转速维持溶氧在16％，30℃培养18h收集发酵液，发酵液菌量达到9.87×109cfu/ml。所述的发酵培养基的配方(g/l)：蛋白胨5g，酵母膏5g，nacl2g，mgso40.03g，na2hpo40.25g，kh2po40.75g，feso40.03g，mnso40.01g，cacl20.2g，甘油6.0，调节ph7.5；实施例3：脱氮副球菌(paracoccusdenitrificans)tdfq-1对yw培养基中氨氮和总氮去除效果将脱氮副球菌(paracoccusdenitrificans)tdfq-1接种于200mlnb液体培养基中，30℃，200rpm培养18小时，发酵液液离心去上清，加灭菌单蒸水洗涤2次，加灭菌单蒸水重悬，调节菌体浓度od600值为1.5；重悬种子液按5％的接种量接种于200mlyw培养基，30℃，200rpm培养54h，每6小时取2ml培养液，用于测定发酵液中总氮和氨氮的含量。总氮采用过硫酸钾氧化风光光度法，氨氮采用纳氏试剂光度法。总氮和氨氮测定标准曲线：图5和图6，结果如表2和表3所示。脱氮副球菌(paracoccusdenitrificans)tdfq-1不同培养时间发酵液中总氮和氨氮含量测定。表2脱氮副球菌(paracoccusdenitrificans)tdfq-1对培养基中总氮去除率表3脱氮副球菌(paracoccusdenitrificans)tdfq-1对培养基中氨氮去除率由表2和表3可知，脱氮副球菌(paracoccusdenitrificans)tdfq-1对培养基中总氮的最终去除率为92.41％，氨氮的去除率为94.72％，18h时氨氮、总氮的减少量均大于85％。之后随着时间的增加，氨氮和总氮的减少量变化不是很大，因此，在实际应用中，脱氮副球菌tdfq-1对养殖废水的处理时间确定为18h。实施例4：脱氮副球菌(paracoccusdenitrificans)tdfq-1对养殖场高有机质废水的处理一、对猪场养殖废水的处理1.对猪场养殖废水中氨氮和总氮去除效果采取随州某猪场的养殖废水，过滤去除养殖废水中的颗粒悬浮物，过滤后的污水作为脱氮副球菌(paracoccusdenitrificans)tdfq-1脱氮作用的实验用水。按5％(v/v)的量将12.5ml(活菌数5×109cfu/ml)的tdfq-1液体制剂加入250ml污水中，室温下(25℃)处理18h，测定污水中氨氮和总氮的含量变化。表4脱氮副球菌(paracoccusdenitrificans)tdfq-1对猪场养殖废水中氨氮和总氮的去除效果由表4可知，通过脱氮副球菌(paracoccusdenitrificans)tdfq-1的处理，猪场养殖废水中的氨氮和总氮的含量由tdfq-1处理前的562.08mg/l、645.66mg/l降低到54.21mg/l、85.84mg/l，分别减少90.35％和86.71％。2.对猪场养殖废水中氟喹诺酮类抗生素的降解作用采取随州某猪场的养殖废水，过滤去除养殖废水中的颗粒悬浮物，过滤后的污水作为脱氮副球菌(paracoccusdenitrificans)tdfq-1降解喹诺酮类抗生素的实验用水。按5％(v/v)的量将12.5ml(活菌数5×109cfu/ml)的tdfq-1液体制剂加入250ml污水中，室温下(25℃)处理一定时间，测定污水中喹诺酮类(诺氟沙星、环丙沙星、恩诺沙星)抗生素含量变化(表5、图7)。养殖废水中抗生素浓度的测定采用高效液相色谱法(hplc)。表5脱氮副球菌(paracoccusdenitrificans)tdfq-1对猪场养殖废水中喹诺酮类抗生素的降解作用(单位ng/l)由表5可知，用脱氮副球菌(paracoccusdenitrificans)tdfq-1处理猪场养殖废水的试验组和未使用tdfq-1的对照组比较，诺氟沙星降解率从24.05％提高到93.41％，降解率提高了69.36％；环丙沙星降解率从28.34％提高到96.93％，降解率提高了68.59％；恩诺沙星降解率从42.47％提高到93.82％，提高了51.35％。使用tdfq-1的试验组中3种喹诺酮类抗生素的降解率均达到了90％以上。二、对鸡场养殖废水中氨氮和总氮去除效果采取安陆某鸡场的养殖废水，过滤去除养殖废水中的颗粒悬浮物，过滤后的污水作为脱氮副球菌(paracoccusdenitrificans)tdfq-1脱氮作用的实验用水。按5％(v/v)的量将12.5ml(活菌数5×109cfu/ml)的tdfq-1液体制剂加入250ml污水中，室温下(25℃)处理18h，测定污水中氨氮和总氮的含量变化。表6脱氮副球菌(paracoccusdenitrificans)tdfq-1对鸡场养殖废水中氨氮和总氮的去除效果指标处理前处理后去除率(％)氨氮(mg/l)662.3754.3691.79总氮(mg/l)695.8369.1190.07由表6可知，通过脱氮副球菌(paracoccusdenitrificans)tdfq-1的处理，鸡场养殖废水中的氨氮和总氮的含量由tdfq-1处理前的662.37mg/l、695.83mg/l降低到54.36mg/l、69.11mg/l，分别减少91.79％和90.07％。当前第1页12