一株利用木质纤维素水解液厌氧发酵产L‑天冬氨酸的基因工程菌及其构建方法与应用与流程

文档序号：11582354阅读：509来源：国知局

本发明属于基因工程及发酵工程技术领域，具体涉及一株利用木质纤维素水解液发酵产l-天冬氨酸的基因工程菌构建方法与应用。

背景技术：

l-天冬氨酸在医药、食品和化工等方面有着广泛的用途。在医药方面，是氨基酸制剂的主要成分；在化工方面，可以作为制造合成树脂的原料，大量用于合成环保材料聚天门冬氨酸；尤其在食品工业方面，l-天门冬氨酸是一种良好的营养增补剂，也是糖代用品阿斯巴甜的主要生产原料。l-天冬氨酸需求约7万吨/年，市场需求量大。

目前l-天冬氨酸主要以富马酸为原料，采用生物酶法合成，而目前富马酸主要采用化学法制备，因此从全周期分析，l-天冬氨酸的制备仍然依赖化石资源。葡萄糖、木糖等单糖可来源于可再生的生物质资源，其产量丰富，筛选或构建获得一株能够直接通过发酵制备l-天冬氨酸的生产菌株具有重要的意义。国内全生物合成上述产品尚处于实验室研究阶段，其产业化实施经济性偏低，造成这一现状的主要问题包括：1)原料成本高；2)原料转化率低。

先期已获得了一株有氧条件下能够利用葡萄糖发酵制备l-天冬氨酸的菌株(cn106434510a)，但该菌株因有氧条件下菌株生物量高且脱羧反应导致二氧化碳释放，导致收率偏低仅0.55g/l，生产成本高。与有氧发酵相比，厌氧发酵具有收率高的特点，因此构建了一株在厌氧条件下能够利用单糖发酵制备l-天冬氨酸的菌株(cn105296411a)，但厌氧环境下菌株生长稳定性偏差，且产物浓度仅10g/l，因此进一步构建筛选获得了一株在厌氧条件下生长性能优良且浓度更高的菌株具有显著意义，同时为了能实现利用木质纤维素水解液的目标，在菌株构建过程中提高木糖利用效率，及混合糖的同步利用均需考虑。本发明基于此，公开了相关的技术。

技术实现要素：

本发明要解决的技术问题是，提供一株利用木质纤维素水解液发酵产l-天冬氨酸的基因工程菌。

本发明还要解决的技术问题是，提供上述基因工程菌的构建方法。

本发明最后要解决的技术问题是，提供上述基因工程菌在发酵产l-天冬氨酸中的应用。

为解决上述技术问题，本发明采用如下技术方案：

一株利用木质纤维素水解液厌氧发酵产l-天冬氨酸的基因工程菌，敲除保藏号为cgmccno：2301菌株中苹果酸合成酶和异柠檬酸裂解酶的编码基因aceba，并在aceba基因的位置处插入l-天冬氨酸酶基因，再敲除该菌种中糖转运系统的ptsg基因，得到重组大肠杆菌as31；基因的敲除和敲除插入采用通用的red重组技术。

将能够催化草酰乙酸合成l-天冬氨酸的天冬氨酸转氨酶基因aspc、磷酸烯醇式丙酮酸激酶编码基因pck克隆到表达质粒上，将该重组质粒转化大肠杆菌as31，即得到木质纤维素水解液厌氧发酵产l-天冬氨酸的基因工程菌as32。基因的表达采用具有较高本底表达水平的ptrc99a大肠杆菌表达质粒，aspc基因和pck基因的表达采用单质粒表达模式，两个基因采用人工合成基因序列的方式，各自带有自身独立的启动子序列。

本发明中，

所述苹果酸合成酶和异柠檬酸裂解酶的编码基因aceba的genbank登记号为eu889415.1；

所述糖转运系统的ptsg基因在大肠杆菌信息学数据库中的登记号为：eg10787；

所述l-天冬氨酸酶基因的核苷酸序列如seqidno：1所示；

所述天冬氨酸转氨酶基因aspc的核苷酸序列如seqidno：2所示；

所述磷酸烯醇式丙酮酸激酶编码基因pck的核苷酸序列如seqidno：3所示。

其中，所述的表达质粒为ptrc99a。

其中，天冬氨酸转氨酶基因aspc的启动子如seqidno：4所示，磷酸烯醇式丙酮酸激酶编码基因pck的启动子如seqidno：5所示。

上述利用木质纤维素水解液发酵产l-天冬氨酸的基因工程菌的构建方法，其特征在于，包括如下步骤：

苹果酸合成酶和异柠檬酸裂解酶的编码基因aceba的敲除与l-天冬氨酸酶基因的插入：

(1)以seqidno：6和seqidno：7所示的核苷酸序列为引物，质粒pij773为模板，pcr扩增得到线性片段1；

以seqidno：8和seqidno：9所示的核苷酸序列为引物，seqidno：1所示的核苷酸序列为模板，pcr扩增得到线性片段2；

以seqidno：6和seqidno：9所示的核苷酸序列为引物，线性片段1和线性片段2为模板扩增得到基因敲除片段a；

(2)将pkd46质粒转化cgmccno：2301菌株，利用l-阿拉伯糖诱导其表达λ重组酶，再将该菌株制备成感受态ⅰ；

(3)将步骤(1)中基因敲除片段a转化步骤(2)得到的感受态ⅰ中，涂布安普霉素的平板筛选出阳性重组子a；

(4)将pcp20转化到步骤(3)得到的阳性重组子a中，42℃热激使其表达flp重组酶，利用无抗性平板和含有安普霉素抗性的平板进行双挑，能够在无抗性平板上生长，但不能在安普霉素抗性平板上生长的菌株即为大肠杆菌as12；

ptsg基因的敲除：

(5)将pkd46质粒转化大肠杆菌as12，利用l-阿拉伯糖诱导其表达λ重组酶，再将该菌株制备成感受态ⅱ；

(6)以seqidno：10和seqidno：11为引物，质粒pij773为模板，pcr扩增得到基因敲除片段b；

(7)将步骤(6)得到的基因敲除片段b转化步骤(5)得到的感受态ⅱ中，涂布安普霉素的平板筛选出阳性重组子b；

(8)将pcp20转化到步骤(7)得到的阳性重组子b中，42℃热激使其表达flp重组酶，利用无抗性平板和含有安普霉素抗性的平板进行双挑，能够在无抗性平板上生长，但不能在安普霉素抗性平板上生长的菌株即为重组大肠杆菌as31；

天冬氨酸转氨酶基因aspc、磷酸烯醇式丙酮酸激酶编码基因pck过表达：

(9)将seqidno：12所示的序列插入表达质粒ptrc99a中，得到重组质粒，将该重组质粒转化重组大肠杆菌as31，得到所述利用木质纤维素水解液发酵产l-天冬氨酸的基因工程菌as32。

上述利用木质纤维素水解液厌氧发酵产l-天冬氨酸的基因工程菌在发酵制备l-天冬氨酸中的应用在本发明的保护范围之内。

利用本发明的基因工程菌发酵产l-天冬氨酸的具体发酵培养过程如下：

(s1)将基因工程菌as32转接到摇瓶lb培养基中，有氧培养10～12h，得到一级种子液；

(s2)将一级种子液转接到发酵罐lb培养基中，培养，得到二级种子液；

(s3)待二级种子液od600至2.5～4时，再接种到发酵培养基，所述发酵培养基的配方如下：

谷氨酸9g/l、玉米浆干粉5g/l、柠檬酸3.0g/l、na2hpo4·7h2o3.00g/l、kh2po48.00g/l、(nh4)2hpo420.00g/l、nh4cl10g/l、(nh4)2so45g/l、mgso4·7h2o1.00g/l溶剂为水；

发酵过程中，分次加入灭菌葡萄糖或木质素水解液，保证培养基中葡萄糖或木质素水解液的浓度在1～50g/l；

发酵过程中，谷氨酸浓度控制为6～15g/l。

步骤(s1)和(s2)中，培养温度为35～38℃。

步骤(s3)中，采用两阶段发酵模式，当菌体od600为20以下时，通氧气进行有氧发酵，溶解氧为5～40％；当菌体od600至20以上时改通二氧化碳气体进行厌氧发酵，通气量控制在0.01～0.5vvm。

其中，两阶段发酵过程中温度为25～30℃，培养过程ph用氨水调节为7.0～8.5。

有益效果：

本发明创新性地建立了原有l-天冬氨酸采用酶转化制备的替代路线，彻底摆脱了依赖于石油基富马酸的问题，同时针对之前有氧和厌氧发酵制备l-天冬氨酸存在的问题，重新设计路线，最终提高了厌氧下l-天冬氨酸的收率和浓度，具有显著的经济性和社会效益，工艺路线绿色、环保。

附图说明

图1带有安普霉素抗性基因的长链片段鉴定图。

图2ptsg突变体的菌落pcr鉴定图。

图3诱导pcp20表达flp重组酶去除抗性基因后菌落pcr鉴定图。

具体实施方式

根据下述实施例，可以更好地理解本发明。然而，本领域的技术人员容易理解，实施例所描述的内容仅用于说明本发明，而不应当也不会限制权利要求书中所详细描述的本发明。

实施例1：

本实施例说明利用重叠pcr技术和同源重组技术敲除亲本大肠杆菌jm125(cgmccno：2301)中aceba基因(seqidno：2)的同时插入l-天冬氨酸酶基因(seqidno：1)的过程。

(1)利用lb培养基，于37℃、有氧条件下培养大肠杆菌jm125至od600＝0.4～0.6，制备成电转感受态；

(2)将重组质粒电转入感受态的大肠杆菌cgmccno：2301。电击条件为：200ω，25μf，电击电压2.3kv，电击时间4～5ms。电击后迅速将菌体加入预冷1ml的soc培养基，150r/min、30℃培养1h之后涂布于带氨苄青霉素(amp)的lb培养基平板筛选出阳性转化子cgmccno：2301(pkd46)；

(3)在lb培养基中加入10mm的l-阿拉伯糖，于30℃下诱导质粒pkd46表达出λ重组酶，制成电转感受态；

(4)以两侧带有frt位点的安普霉素抗性基因(pij773)和l-天冬氨酸酶基因的(genbank：x03629.1)为模板设计引物f1，r1和f2，r2，具体序列为：

f1(seqidno：6)：

ccttcgttcacagtggggaagttttcggatccatgacgaggagctgcacgtgtaggctggagctgcttcgaag；

r1(seqidno：7)：attccggggatccgtcgactacaaactcttgtaatggcggcg；f2(seqidno：8)：taaggcccctaggcagctgatgtttgagaacattaccgccgc；r2(seqidno：9)：

tgcggcgtgaacgccttatccggcctacagtcagcaacggttgttgttgccgggcttcattgtttttaatgcttacagca；

(5)以f1，r1和f2，r2分别扩增出安普霉素抗性基因(线性片段1)和l-天冬氨酸酶基因(线性片段2)，再以f1和r2为引物扩增出两端带有aceba基因同源臂的dna敲除片段；

(6)电转线性dna片段至已诱导表达λ重组酶的大肠杆菌cgmccno：2301(pkd46)感受态，并涂布于带安普霉素的lb平板筛选出阳性重组子，并进行了pcr鉴定；

(7)阳性重组子制备成感受态后倒入能诱导表达flp重组酶的质粒pcp20，于42℃热激表达flp重组酶后即可消除安普霉素抗性。利用一对平板，进行平行点样，能够在无抗性平板上生长，但不能在抗性平板上生长的菌落即为已经敲除抗性的菌株，命名为as12。

实施例2：

本实施例利用red同源重组技术敲除大肠杆菌as12糖转运系统的ptsg基因，具体步骤包括：

(1)利用lb培养基，于37℃、有氧条件下培养大肠杆菌as12至od600＝0.4～0.6，制备成电转感受态。

(2)将重组质粒电转入感受态的大肠杆菌as12。电击条件为：200ω，25μf，电击电压2.3kv，电击时间4～5ms。电击后迅速将菌体加入预冷1ml的soc培养基，150r/min、30℃培养1h之后涂布于带氨苄青霉素(amp)的lb培养基平板筛选出阳性转化子as12(pkd46)。

(3)在lb培养基中加入10mm的l-阿拉伯糖，于30℃下诱导质粒pkd46表达出λ重组酶，制成电转感受态。

(4)以两侧带有frt位点的安普霉素抗性基因为模板，利用高保真pcr扩增系统，以质粒pij773为模板，并设计两端带有fum同源片段的扩增引物，扩增出线性dna同源片段，鉴定结果见附图1，引物序列如下：

上游带同源臂引物h1-p1，下划线为同源片段(seqidno：10)：

5’-atgtttaagaatgcatttgctaacctgcaaaaggtcggtaaatcgctggtgt

aggctggagctgcttc-3’；

下游带同源臂引物h2-p2，下划线为同源片段(seqidno：11)：

5’-ttagtggttacggatgtactcatccatctcggttttcaggttatcggaatgg

gaattagccatggtcc-3’。

反应体系：带同源臂的上下游引物(100pmol/μl)各0.5μl；模板dna(100ng/μl)0.5μl；10×buffer5μl；dntps(10mm)各1μl；dmso(100％)2.5μl；pyrobestdna聚合酶(2.5u/μl)1μl；ddh2o36/35.5μl；总体积50μl。

反应条件：94℃，2min；(94℃，45sec；50℃，45sec；72℃，90sec；10个循环)；(94℃，45sec；55℃，45sec；72℃，90sec；15个循环)；72℃，5min。

(5)电转线性dna片段至已诱导表达λ重组酶的大肠杆菌as12感受态，并涂布于带安普霉素的lb平板筛选出阳性重组子，并进行了菌落pcr鉴定，结果见附图2。

(6)阳性重组子制备成感受态后倒入能诱导表达flp重组酶的质粒pcp20，于42℃热激表达flp重组酶后即可消除安普霉素抗性。利用一对平板，进行平行点样，能够在无抗性平板上生长，但不能在抗性平板上生长的菌，并通过pcr鉴定(附图3)即可确定是否已经敲除抗性，敲除抗性的菌株为as31。

实施例3：

本实施例说明采用质粒共表达的方式超量表达两个酶，即能够催化草酰乙酸合成l-天冬氨酸的天冬氨酸转氨酶基因aspc和磷酸烯醇式丙酮酸激酶编码基因pck，并将重组质粒导入突变株as31中，获得l-天冬氨酸高产菌as32，具体方法如下：

1、构建超量表达磷酸烯醇式丙酮酸羧化激酶编码基因(pck)和天冬氨酸转氨酶编码基因(aspc)的表达质粒，其过程包括：

(1)人工设计并合成两端带有ecori和hindiii酶切位点，两个基因的各自带有自身

操纵子，可实现无诱导下的高本底表达，具体序列见seqidno：1。

(2)表达质粒ptrc99a分别用ecori和hindiii双酶切，并与合成的基因连接获得重组质粒ptrc99a-pck-aspc。

2、将质粒ptrc99a-ppc-aspa导入突变株as31感受态，获得的阳性转化子即为本发明的新构建菌株as32。

实施例4：

本实施例说明新构建的重组大肠杆菌as32厌氧发酵产l-天冬氨酸的能力。

1、采用lb培养基按1～2％(v/v)接种量从冻存管接入三角瓶中，有氧培养10～12h，进一步按1～2％(v/v)接种量接种至种子发酵罐(培养基也为lb)，培养4～6h后待菌体od600至2.5～4之间，按5～10％接种发酵培养基(jspg培养基，葡萄糖为碳源分批补加)；

2、种子培养过程温度控制在35～38℃，培养中不需调节ph。发酵过程采用有氧-厌氧两阶段发酵模式，od600为20以下时，通氧气进行有氧发酵，溶解氧为5～40％；当菌体od600至20以上时改通二氧化碳气体进行厌氧发酵，通气量控制在0.01～0.5vvm。发酵过程温度控制在25～30℃，培养过程ph用氨水控制在7.0～8.5。

出发菌株与重组菌株的厌氧发酵48h后的结果见表1。

表1出发菌株及两株重组菌发酵产酸情况

实施例5：

本实施例说明新构建的重组大肠杆菌as32厌氧发酵时，添加不同浓度谷氨酸对产l-天冬氨酸的能力的影响。

1、采用lb培养基按1～2％(v/v)接种量从冻存管接入三角瓶中，有氧培养10～12h，进一步按1～2％(v/v)接种量接种至种子发酵罐(培养基也为lb)，培养4～6h后待菌体od600至2.5～4之间，按5～10％接种发酵培养基(jspg培养基，葡萄糖为碳源分批补加，谷氨酸控制在不同浓度)；

不同谷氨酸添加时重组菌株as32的厌氧发酵48h后的结果见表1。

表2不同谷氨酸添加时重组菌发酵产酸情况

实施例6：

本实施例说明新构建的重组大肠杆菌as32利用木质纤维素水解液厌氧发酵产l-天冬氨酸的能力。

1、采用lb培养基按1～2％(v/v)接种量从冻存管接入三角瓶中，有氧培养10～12h，进一步按1～2％(v/v)接种量接种至种子发酵罐(培养基也为lb)，培养4～6h后待菌体od600至2.5～4之间，按5～10％接种发酵培养基(jspg培养基，纤维素水解液为碳源分批补加)；

出发菌株与重组菌株的厌氧发酵48h后的结果见表3。

表3出发菌株及两株重组菌利用木质纤维素发酵产酸情况

sequencelisting

<110>南京工业大学

<120>一株利用木质纤维素水解液厌氧发酵产l-天冬氨酸的基因工程菌及其构建方

法与应用

<130>sg20170518011

<160>12

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<211>1191

<212>dna

<213>l-天冬氨酸酶基因的核苷酸序列

<400>1

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ggcaaaaccccggtactgaccagcgtgaaaaaggctgaacagtatctgctcgaaaatgaa180

accaccaaaaattacctcggcattgacggcatccctgaatttggtcgctgcactcaggaa240

ctgctgtttggtaaaggtagcgccctgatcaatgacaaacgtgctcgcacggcacagact300

ccggggggcactggcgcactacgcgtggctgccgatttcctggcaaaaaataccagcgtt360

aagcgtgtgtgggtgagcaacccaagctggccgaaccataagagcgtctttaactctgca420

ggtctggaagttcgtgaatacgcttattatgatgcggaaaatcacactcttgacttcgat480

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<213>天冬氨酸转氨酶基因aspc的核苷酸序列

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