本发明属于高分子材料技术领域，涉及一种大分子温敏驱动器及其制备方法和应用。
背景技术：
细胞膜受体蛋白能识别、结合专一的生物活性配体生成复合物，从而激活和启动一系列物理化学变化，进而导致该物质的最终生物效应。这些生物效应包括细胞增殖、细胞分化、细胞凋亡等等。现有调控膜受体蛋白寡聚化的方法主要有三种：1)利用生物活性配体；2)光遗传学；3)磁调控。但每种方法都有各自的弊端。生物活性配体无法实现对受体蛋白在时间空间上的操控。光遗传学依赖于转基因技术在细胞内转染光敏感的蛋白，过程复杂，且应用局限，无法实现对运动能力差的受体蛋白调控。磁调控方法虽然可以实现对受体蛋白在时间空间上的主动调控，但是该方法依赖于复杂的仪器加工设计。
cn106397577a公开了一种双重刺激响应性胶原蛋白多肽聚合物，所述聚合物以胶原蛋白多肽为主链，其侧链上的氨基通过动态键联反应接枝烷氧醚树枝化基元侧链，使得制备得到的胶原蛋白多肽聚合物具有温度和ph双重响应，然而该材料并非是基于细胞膜表面的温度和ph响应，不能直接用于细胞水平的调控。
因此，在本领域，期望得到一种具有膜受体蛋白寡聚化调控的温敏材料。
技术实现要素：
针对现有技术的不足，本发明的目的在于提供一种大分子温敏驱动器及其制备方法和应用。
为达到此发明目的，本发明采用以下技术方案：
一方面，本发明提供一种大分子温敏驱动器，所述大分子温敏驱动器包括由多肽配体构成的靶向模块、由温敏聚合物构成的驱动模块和由光热转换分子构成的触发模块，所述触发模块连接在靶向模块上，所述靶向模块与驱动模块连接。
在本发明中，所述大分子温敏驱动器也可以称为大分子温敏材料。
本发明的温敏驱动器利用温度响应性聚合物材料在特定温度上下发生相变，从舒展态转变成塌缩的聚集态，产生机械拉动力。其在物理器件构建以及生物递药中有很重要的应用。
本发明通过共价键将多肽配体与温敏聚合物进行连接，并在分子中连接具有光热转换性质的分子作为热源，得到大分子的温敏驱动器材料，该驱动器可以通过多肽配体靶向到细胞膜蛋白，在细胞膜表面通过局部升温激活驱动器使其塌缩聚集产生拉拽力，利用其相变产生的拉拽力对细胞膜表面的受体蛋白寡聚化进行简单、主动而精准的操控。该温敏驱动器体系，为信号通路研究提供了新材料，为免疫细胞激活及肿瘤治疗等提供新的有效策略。
优选地，所述多肽配体为能够与细胞膜表面受体蛋白结合的任意氨基酸序列多肽中的任意一种或至少两种的组合；
优选地，所述多肽配体的氨基酸序列为msrtms、gyhwygytpqnvi、rgd或cnscwskd，进一步优选msrtms。
在本发明中，所述多肽配体为具有特定的氨基酸序列的多肽，其对应的特定的识别蛋白，例如msrtms对应的识别蛋白为her2(人类表皮生长因子受体-2)蛋白，gyhwygytpqnvi对应的识别蛋白为her1(人类表皮生长因子受体-1)蛋白，rgd对应的识别蛋白为整合素αvβ3，cnscwskd对应的识别蛋白为dr4/5(死亡受体4或5)。
优选地，所述温敏聚合物为聚n-异丙基丙烯酰胺、聚n,n-二乙基丙烯酰胺、聚n-羟甲基丙基甲基丙烯酰胺、聚n-2,2-二甲基1,3-二氧戊环甲基丙烯酰胺、聚n-2-甲氧基1,3-二氧乙环甲基丙烯酰胺、聚n-2-乙氧基1,3-二氧乙环甲基丙烯酰胺、聚甲基丙烯酸寡聚乙二醇酯、聚n-乙烯基异丁酰胺、聚甲基乙烯基醚、聚n-乙烯基己内酰胺或聚2-乙基噁唑啉中的任意一种或至少两种的组合物。
优选地，所述温敏聚合物为n-异丙基丙烯酰胺和n-2羟异丙基丙烯酰胺的共聚物、n-异丙基丙烯酰胺和n-羟乙基丙烯酰胺的共聚物或者n-异丙基丙烯酰胺和丙烯酸的共聚物中的任意一种或至少两种的组合，优选n-异丙基丙烯酰胺和/或n-2羟异丙基丙烯酰胺的共聚物。
优选地，所述温敏聚合物为共聚物时，其合成方法为活性/可控自由基聚合，优选raft聚合(可逆加成-断裂链转移聚合)。
优选地，所述raft聚合的链转移试剂为n,n'-二甲基n,n'-二(4-吡啶基)秋兰姆二硫化物、2-(十二烷基三硫代碳酸酯基)-2-甲基丙酸、双(十二烷基硫烷基硫代羰基)二硫化物、2-氰基-2-丙基十二烷基三硫代碳酸酯、2-氰基-2-丙基苯并二硫、4-氰基-4-[(十二烷基硫烷基硫羰基)硫烷基]戊酸、4-氰基-4-(苯基硫代甲酰硫基)戊酸、氰甲基十二烷基三硫代碳酸酯、氰甲基甲基(苯基)氨基二硫代甲酸酯、甲基-2-丙酸甲基(4-吡啶)氨基二硫代甲酸酯、甲基-2-(十二烷基三硫代碳酸酯)-2-甲基丙酸酯或2-苯基-2-丙基苯并二硫中的任意一种或至少两种的组合，进一步优选2-氰基-2-丙基十二烷基三硫代碳酸酯。
优选地，所述温敏聚合物为具有如式i所示结构的聚合物：
其中x＝200-1200(例如200、230、250、280、300、350、380、400、440、480、500、530、550、580、600、620、650、680、700、750、780、810、850、880、900、1000、1100或1200)，y＝1-60(例如1、3、5、8、10、15、18、20、25、30、35、40、45、50、55或60)，且x/y＝19-280(例如19、20、23、25、28、30、35、40、50、60、80、100、130、150、180、200、230、250或280)，例如x＝1168,y＝60或x＝1127,y＝40或x＝1158,y＝14或x＝1447,y＝9或x＝624,y＝34或x＝596,y＝18或x＝642,y＝7或x＝698,y＝4或x＝258,y＝14或x＝252,y＝11或x＝251,y＝3或x＝280,y＝1，优选x＝642，y＝7；
优选地，所述温敏聚合物的分子量为20-80kd，例如20kd、25kd、30kd、35kd、40kd、45kd、50kd、55kd、60kd、65kd、70kd、75kd或80kd，优选40kd。当温敏聚合物的分子量小于20kd时，会使得本发明所述的大分子温敏驱动器(或称为大分子温敏驱动器)的响应性变差，并且分子量太小或太大，均会使得材料对细胞的毒性增大。
优选地，所述多肽配体作为侧链接枝在温敏聚合物骨架上。在温敏聚合物骨架上可以接枝多个多肽配体。
优选地，所述接枝通过迈克尔加成法实现，即通过温敏聚合物中的双键与多肽配体中巯基进行迈克尔加成，从而实现将多肽配体序列接枝在温敏聚合物的骨架上。
优选地，所述多肽配体连接比例为0.5-5％，例如0.5％、0.8％、1％、1.2％、1.5％、1.8％、2％、2.3％、2.5％、2.8％、3％、3.2％、3.5％、3.8％、4％、4.2％、4.5％、4.8％或5％，优选1％。在本发明中，所述多肽配体连接比例指的是多肽配体连接在温敏聚合物骨架上的量，具体的是：多肽配体与构成温敏聚合物的单体或单体混合物(当聚合物由两种以上单体聚合得到时，单体混合物指两种以上单体的总和)的摩尔百分比。
在本发明中将聚合物骨架链长及多肽配体连接比例控制在适当的范围内可以有利于调节本发明所述大分子温敏驱动器的响应温度区间和响应灵敏度。
优选地，所述光热转换分子为紫红素-18(purpurin-18)、焦脱镁叶绿素、cy5、cy6或cy7中的任意一种或至少两种的组合，优选紫红素-18。
在本发明中，光热转换分子的作用是作为分子热源给温敏聚合物提供热量促使其从亲水性的舒展状态转变为疏水的塌缩状态。分子热源的优势在于可以局部给热、可控性高，对于生物应用有利。
优选地，所述光热转换分子通过酰胺键连接在多肽配体上。
另一方面，本发明提供如上所述的大分子温敏驱动器的制备方法，所述制备方法为：通过多肽固相合成法合成多肽配体序列，在多肽序列上连接上光热转换分子，并通过迈克尔加成将连接有光热转换分子的多肽配体序列接枝在温敏聚合物的骨架上得到所述的大分子温敏驱动器。
在本发明中，所述固相合成法以及在多肽序列上连接上光热转换分子以及迈克尔加成等均可以采用本领域已知的方法来实现，在此处不再做具体的叙述。
另一方面，本发明提供一种调控膜受体蛋白聚集的材料，所述材料包括如上所述的大分子温敏驱动器。
本发明所述的大分子温敏驱动器可以有效通过分子识别的主动靶向方式特异性的与膜蛋白结合，温敏聚合物骨架在给温度的情况下驱动膜蛋白寡聚化，寡聚化的膜蛋白影响了下游信号通路，进而影响细胞的生物功能，从而实现从细胞水平的免疫细胞激活及肿瘤治疗等。
另一方面，本发明提供一种药物递送材料，所述药物递送材料包括如上所述的大分子温敏驱动器。
相对于现有技术，本发明具有以下有益效果：
本发明的大分子温敏驱动器利用温度响应性聚合物-多肽杂化材料构筑，该驱动器可以通过多肽配体靶向到细胞膜蛋白，有效通过分子识别的主动靶向方式特异性的与膜蛋白结合，在细胞膜表面通过局部升温激活驱动器使其塌缩聚集产生拉拽力，实现不同膜受体蛋白的组装调控，为信号通路研究、免疫细胞激活及肿瘤治疗等提供新的有效策略。
附图说明
图1为本发明制备的大分子温敏驱动器的结构示意图；
图2为实施例1制备的连接有紫红素-18的多肽配体ck(p18)ggmsrtms的maldi-tof谱图；
图3为实施例1制备的大分子温敏驱动器的核磁氢谱图；
图4为实施例2制备的连接有紫红素-18的多肽配体ck(p18)gyhwygytpqnvi的maldi-tof谱图；
图5为实施例2制备的大分子温敏驱动器的核磁氢谱图；
图6为利用实施例1中制备的大分子温敏驱动器在细胞膜表面调控膜受体蛋白寡聚化的示意图；
图7为实施例1制备得到的大分子温敏驱动器在细胞膜表面的荧光共聚焦显微镜图，其中a图为无激光照射时的荧光共聚焦显微镜图，b图为有激光照射时的荧光共聚焦显微镜图，其标尺均为10μm；
图8为实施例1制备得到的大分子温敏驱动器在细胞膜表面的扫描电镜图，其中a图为无激光照射时的扫描电镜图，b图为有无激光照射时的扫描电镜图，其标尺均为2μm；
图9是用荧光共聚焦显微镜的fret通道观测到的实施例1制备得到的大分子温敏驱动器在细胞表面聚集的发生荧光共振转移的情况图；
图10是实施例1制备得到的大分子温敏驱动器对skbr3细胞增殖的抑制情况曲线图。
具体实施方式
下面通过具体实施方式来进一步说明本发明的技术方案。本领域技术人员应该明了，所述实施例仅仅是帮助理解本发明，不应视为对本发明的具体限制。
下述实施例中的实验方法，如无特殊说明，均为常规方法；所用的实验材料，如无特殊说明，均为自常规生化试剂厂商购买得到的。
实施例1
在本实施例中制备的大分子温敏驱动器的结构示意图如图1所示，其包括由多肽配体构成的靶向模块、由温敏聚合物构成的驱动模块和由光热转换分子构成的触发模块，所述触发模块连接在靶向模块上，所述靶向模块与驱动模块连接。其中光热转换分子为紫红素-18，多肽配体为ckggmsrtms(为了接紫红素-18，添加了氨基酸k；为了将多肽与聚合物相连，添加了氨基酸c。gg是柔性间隔)，连接有紫红素-18的多肽配体ck(p18)ggmsrtms的分子结构如下所示：
在本实施例中，大分子温敏驱动器的合成方法如下：
1)多肽配体的合成：
合成选用0.35mm负载量的wang树脂，其中第一个氨基酸(丝氨酸)的n端被fmoc保护，c端固定于树脂上。用20％(v/v)的六氢吡啶的dmf溶液脱去n端的fmoc保护，然后用茚三酮测试法检测脱保护结果。然后将下一个氨基酸的羧基用0.4m的n-甲基吗啉(nmm)和10倍于氨基酸的苯并三氮唑-n,n,n',n'-四甲基脲六氟磷酸酯(hbtu)的dmf溶液活化，并加入到脱去保护的树脂中反应1小时。按此方法，将剩余的所有氨基酸都通过缩合反应连接上去，形成固定于树脂的连接多肽，其中赖氨酸使用的是fmoc-lys(dde)-oh。
2)紫红素-18连接多肽的合成：
在步骤1)完成所有氨基酸的合成后，用2％的水合肼脱除赖氨酸侧链的dde，然后将活化好的紫红素-18分子重复上述步骤偶联在赖氨酸的n端；然后用含有2.5％水和2.5％三异丙基硅烷的三氟乙酸溶液将合成好的多肽从树脂上脱除，同时脱除氨基酸的侧链保护；将三氟乙酸用旋转蒸发法去除，然后多肽的粗产物用无水乙醚沉淀，洗涤并干燥；最后选用反相制备液相色谱，将多肽纯化。
纯化过程的条件为：流动相是含有0.1％三氟乙酸的乙腈和含有0.1％三氟乙酸的双蒸水；参数是梯度洗脱从5％乙腈/95％水到60％乙腈/40％水，流速为10ml/min，处理时间为30min。上述方法所得到的紫红素-18连接多肽的maldi-tof图谱如图2所示，由图可知，连接有紫红素-18的多肽配体的分子量为1604.8。
3)温敏聚合物骨架的合成：
将n-异丙基丙烯酰胺及n-2羟异丙基丙烯酰胺按不同摩尔比(99：1)加入到史莱克瓶中，然后加入2-氰基-2-丙基十二烷基三硫代碳酸酯及偶氮二异丁腈，以n,n’-二甲基甲酰胺(dmf)溶解，浓度为1.5g/ml，搅拌溶解后，密封体系，通入氮气30分钟，恒温70℃反应10小时；将反应后的溶液加入透析袋中，透析3天，冷冻干燥得到淡黄色粉末状固体。
将还有14mmol量的上述聚合物与0.35g的4,4'-亚甲基双(2,6-二叔丁基苯酚)加入到反应容器中，并用35ml无水dmf溶解。将30mmol的丙烯酸异丙腈乙酯及50mg的二月桂酸二丁基锡加入到反应容器中，次子搅拌溶解。恒温40℃反应48小时。将反应后的溶液用乙醚沉淀过滤并透析1天，冷冻干燥得到双键修饰的淡黄色粉末状固体。通过核磁及凝胶渗透色谱确定聚合物结构及分子量。
4)聚合物-多肽连接物的合成：
将0.045mmol多肽分子ck(p18)ggmsrtms与0.03mmol双键量的聚合物共聚物溶于1mldmso中，并置于反应容器中，加入1滴三乙胺，搅拌溶解，密封体系，通入氮气30分钟，恒温37℃反应3天；将反应后的溶液加入透析袋中，透析24小时，通过热沉淀的方法得到纯的温敏聚合物-多肽连接物，冷冻干燥得到粉末状固体。
得到的大分子温敏驱动器的结构如下所示：
在本实施例中制备得到的连接有紫红素-18的多肽配体ck(p18)ggmsrtms的maldi-tof谱图如图2所示，由图可以看出，多肽的分子量1604.8
利用核磁氢谱对得到的大分子温敏驱动器进行结构表征，结果如图3所示，由图可以看出，化学位移值δ＝3.43ppm和δ＝3.18ppm分别对应-och2-跟-ch2-；δ＝7.5-7.0，δ＝3.85ppm和δ＝1.05ppm对应n-异丙基丙烯酰胺中的-nh-，-ch-以及-ch3。δ＝9.0-8.0对应多肽上的-conh-。
实施例2
利用与实施例1的步骤(1)相同的多肽配体合成方法合成了多肽配体ck(p18)gyhwygytpqnvi，其结构如下：
利用与实施例1的步骤(2)相同的方法将紫红素-18连接在所述多肽配体上，而后进行与实施例1相同的步骤(3)和(4)制备得到大分子温敏驱动器，其结构如下：
在本实施例中制备得到的连接有紫红素-18的多肽配体ck(p18)gyhwygytpqnvi的maldi-tof谱图如图4所示，由图可以看出，多肽的分子量为2375.0，分子加钠离子的峰为2397.0。
利用核磁氢谱对得到的大分子温敏驱动器进行结构表征，结果如图5所示，由图可以看出，化学位移值δ＝3.43ppm和δ＝3.18ppm分别对应-och2-跟-ch2-；δ＝3.85ppm和δ＝1.05ppm对应n-异丙基丙烯酰胺中的-ch-以及-ch3。δ＝9.0-8.0对应多肽上的-conh-。
实施例3
实施例1制备得到的大分子温敏驱动器以图6所示方式在细胞膜表面调控膜受体蛋白寡聚化，对驱动器拉动受体蛋白寡聚化进行验证，方法如下：
将fitc标记的温敏驱动器分子以3μm的浓度在confocal皿中与贴壁的skbr3细胞共孵育半小时，使分子与细胞表面受体蛋白结合；激光共聚焦显微镜成像结果如图7所示，其中a图为无激光照射时的扫描电镜图，b图为有无激光照射时的扫描电镜图，在不给激光照射时，驱动器分子由于处于伸展状态，铺展在细胞表面，且几乎没有入胞，细胞表面荧光较弱；当在655nm的波长下，用4.77wcm-2的激光密度照射样品，局部温度升高到驱动器分子相转变温度之上，导致分子塌缩聚集，形成的聚集体荧光变强。同时，利用热场扫描电镜观察驱动器分子在细胞表面激光照射前后的形貌像，图8中a图和b图分别是大分子温敏驱动器在细胞膜表面无激光及有激光照射时的扫描电镜图，由此可知，驱动器分子确实由激光照射前的铺展状态(a图)变成激光照射后的塌缩聚集状态(b图)。综上，通过激光共聚焦荧光成像及热场扫描电镜的表面成像共同证明驱动器分子在激光照射后发生聚集塌缩，这种聚集塌缩产生的拉动力具有潜在的调控蛋白聚集的能力。
为了验证驱动器分子的聚集拉动并导致了受体蛋白的寡聚化，将具有fret效应的融合蛋白ecfp-her2及eyfp-her2转染到hek-293t细胞内。用荧光共聚焦显微镜的fret通道观测发生荧光共振转移的量。结果如图9所示，可以看到对比没有激光照射的细胞或者空白对照细胞，激光照射组的fret水平明显提升，证明了温敏驱动器拉动受体寡聚化。
利用相同的实验过程可以验证得到实施例2制备得到的大分子温敏驱动器对her1受体寡聚化具有调控作用。
实施例4
在本实施例中对实施例1制备得到的大分子温敏驱动器进行增殖抑制检测：
将上述温敏驱动器分子溶于磷酸缓冲液(pbs溶液)中，用结晶紫测试方法评价驱动器对skbr3细胞生长的抑制。将skbr3细胞种在12孔板中，密度为20000个细胞/孔。细胞的量可以通过结晶紫的吸收进行定量。在不同的时间点(0天，2天，4天，6天，8天，12天)用4％的多聚甲醛固定细胞，并用0.1％的结晶紫溶液对细胞染色15分钟，pbs洗三次后，用1ml1％的十二烷基磺酸钠溶液萃取结晶紫，用酶标仪在570nm波长下测试吸收值。每个实验重复三次，取平均值。
结果如图10所示，可以看出，不同处理对细胞的增殖有影响，本发明的温敏驱动器在激光触发下，对skbr3细胞的增殖有很好的抑制效果，这是由于her2受体的寡聚化干扰了恶性信号向胞内的传递，最终引起增殖抑制。
申请人声明，本发明通过上述实施例来说明本发明的大分子温敏驱动器及其制备方法和应用，但本发明并不局限于上述实施例，即不意味着本发明必须依赖上述实施例才能实施。所属技术领域的技术人员应该明了，对本发明的任何改进，对本发明所选用原料的等效替换及辅助成分的添加、具体方式的选择等，均落在本发明的保护范围和公开范围之内。