一种处理粪便的微生物制剂及其制备方法和应用与流程

本发明属于畜牧业养殖技术领域，具体涉及一种处理粪便的微生物制剂及其制备方法和应用。

背景技术：

畜牧养殖业是农业的重要组成部分，自90年代中期开始，我国的畜牧业逐渐形成集中养殖、规模化生产的经营方式，但随之而来的环境污染和粪污排放问题也逐渐成为社会关注的热点之一，随着各项涉污染排放法规的出台和严格执行，许多环境排放不达标的企业不得不面临关停的窘境。

畜牧养殖场的污染物中有机物、恶臭气体等浓度较高，目前针对其产生量大、难处理等问题，陆续出现了一些新型处理工艺。这些新型工艺综合运用减量化、资源化、生态化及无害化处理手段，突破了传统方法脏、臭、累且效率低下的弊端。这些新技术中包括了现代生物技术法，它是利用环境微生物快速分解畜禽粪便营养成分的能力，通过堆肥、密闭厌氧增氧产气等培养方式减少排泄物中有害物质含量的一种处理方法。

微生物发酵床技术，是新一代粪污生物处理技术，它利用从自然环境中分离获取的微生物，快速降解畜禽粪便中的有机物以及其他有害物质。高效混合菌剂的获得需要经历采集菌样(养殖场附近土壤)、分离纯化、制备菌种、扩大培养的过程，并将混合菌剂按比例撒到铺好的有机垫料上，翻犁均匀，牛或猪等畜禽在发酵床上生活，畜禽粪尿会被微生物快速消化、降解。该技术以畜禽粪便作为微生物生长原料，不再需要人工清理粪便，是一种对粪便进行原位分解处理的现代绿色畜牧业技术，可以真正地实现无污染、零排放的目的，操作简便、经济高效、省时省力。该技术的核心是发酵床中的有效微生物的种类及数量。高效混合菌剂中的微生物在生化功能上互为补充，可以高效快捷地分解畜禽粪便中的纤维素、半纤维素、脂肪类以及蛋白质等残余物，生成抑制病原微生物生长的有机酸和无臭的co2、n2等气体。

技术实现要素：

本发明的目的是，提供一种处理粪便的微生物制剂及其制备方法和应用。本发明技术方案从奶牛养殖场的原生态微生物菌群出发，通过科学的培养、富集、训化以及放大，得到适应本地奶牛粪污，并可以高效实现生物降解的微生物菌剂，并通过施洒到奶牛养殖床中，实现零排放地粪便处理。

本发明为解决上述技术问题所采用的技术方案如下：

一种处理粪便的微生物制剂，其特征在于：通过在培养基中添加有机酸和粪臭化合物进行微生物的富集和驯化获得所述微生物制剂，所述微生物制剂中的活菌菌落数为5x10⁸～2x10⁹cfu/g。

优选地，所述有机酸包括乙酸、丙酸、正丁酸、异丁酸、正戊酸和异戊酸，每种有机酸在培养基中的浓度分别为0.05％～0.2％(v/v)。

优选地，所述粪臭化合物包括吲哚和粪臭素，吲哚和粪臭素在培养基中的浓度分别为0.01％～0.02％(w/v)。

优选地，所述吲哚和粪臭素先溶于无水乙醇后再添加至培养基。

优选地，所述微生物制剂主要包括芽孢杆菌、类芽孢杆菌、乳酸杆菌、红曲霉菌和粉状毕赤酵母菌。

本发明还提供一种处理粪便的微生物制剂的制备方法，该方法包括如下步骤：

步骤1，将牛粪便固形物以1％-2％(w/v)的比例接种到液体培养基中，在温度30～35℃、转速150～250rpm条件下，培养5～7天；

步骤2，将步骤1获得的菌液以1％-5％(w/w)的比例接种到固体发酵基质中，发酵温度为30～35℃，每日搅动拌料，连续培养10～20日，制得固体发酵的微生物种源；

步骤3，将前述固体发酵的微生物种源以1％-5％(w/w)的比例接种到固体发酵基质中，发酵温度为30～35℃，每日搅动拌料，连续培养20-30天，制得所述微生物制剂。

优选地，所述液体培养基的制备步骤如下：

步骤1，配制基本培养基，各组分的质量体积百分比为(w/v)：1.0％-2.0％米糠、1.0％-2.0％菜粕、2.0％-3.0％鱼粉、0.5％-1.0％稻草，其余为水；

步骤2，在前述基本培养基中分别加入乙酸、丙酸、正丁酸、异丁酸、正戊酸、异戊酸；每种酸的加入量为0.05％～0.2％(v/v)；

步骤3，在前述基本培养基中分别加入吲哚和粪臭素的乙醇溶液，所述吲哚和粪臭素在基本培养基中的浓度为0.01％～0.02％(w/v)；调整ph值至5.8-6.3，高压灭菌制得所述液体培养基。

优选地，所述固体发酵基质的制备步骤如下：

步骤1，配制基本培养基，各组分的质量体积百分比为(w/v)：36％-40％米糠、8％-12％菜粕、8％-12％鱼粉、12％-16％稻草，2％-4％牛粪，其余为水；

步骤2，在前述基本培养基中分别加入乙酸、丙酸、正丁酸、异丁酸、正戊酸、异戊酸；每种酸的加入量为0.05％～0.2％(v/v)；

步骤3，在前述基本培养基中分别加入吲哚和粪臭素的乙醇溶液，所述吲哚和粪臭素在基本培养基中的浓度为0.01％～0.02％(w/v)；高压灭菌制得所述液体培养基。

本发明还提供了所述的微生物制剂在降解处理奶牛粪便中的应用。具体地，将所述微生物制剂均匀施洒到富含木质纤维素的生物质奶牛养殖床中，对奶牛粪便进行原位分解。

与现有技术相比，本发明的有益效果如下：

本发明利用牛粪便污染物的化学组成及其对微生物生长的影响，结合微生物的生理特性，通过固液发酵组合的方式，富集并放大高效菌种的密度，为奶牛养殖业提供了可实现零排放的切实可行的技术方案，解决了高密度养殖方式下的繁重污染治理的技术问题。

附图说明

图1是本发明实施例中制得的微生物制剂中包含的原核微生物种类的组成和相对含量的示意图；其中黑色图框表示训化前原始样品中的菌，斜条纹图框表示训化后微生物制剂中的菌。

图2是本发明实施例中制得的微生物制剂中包含的真核微生物种类的组成和相对含量的示意图；其中黑色图框表示训化前原始样品中的菌，斜条纹图框表示训化后微生物制剂中的菌。

具体实施方式

下面结合实施例对本发明的技术方案进行详细说明。以下采用的生物材料、试剂或实验仪器如未特别说明，均为商业化产品。

本发明的技术方案具体是：将牛粪自然堆积环境(堆肥处理及自然堆积场)中的微生物群落先经基本培养基培养；向基本培养基中分别加入各种有机酸及粪臭化合物，进行富集培养；培养物进一步通过固体培养基质进行两次放大培养；通过在固体培养基质中添加乙酸、丙酸、正丁酸、异丁酸、正戊酸、异戊酸、吲哚、粪臭素等有机酸和粪臭化合物进行筛选训化，获得能够高效降解粪便污染物的微生物菌群。

实施例1：高效微生物制剂的富集

基本液体培养基(w/v)含1.0％米糠、1.0％菜粕、2.0％鱼粉、0.5％稻草；称0.1g吲哚和粪臭素(3-甲基吲哚)，分别溶于1ml无水乙醇中，摇匀，备用；在基本液体培养基中分别添加100μl(0.1％，v/v)乙酸、丙酸、正丁酸、异丁酸、正戊酸、异戊酸以及100μl(0.01％，w/v)吲哚、粪臭素(3-甲基吲哚)。为了充分混匀，可将吲哚和粪臭素先溶解于无水乙醇，然后再添加至培养基中。调整ph至6.0，121℃高压蒸汽灭菌20min。

称0.1g经堆肥处理的牛粪，接种于上述液体培养基中，接种量0.1％(w/v)，30℃、200r·min^-1摇床培养；连续培养48h，收集菌液用作固体富集及放大培养的种子培养液。

实施例2：高效微生物制剂(1千克)的扩培

固体培养基质含(w/w)38.0％米糠、10.0％菜粕、10.0％鱼粉、14.0％稻草、3.0％牛粪，其余为水分。将配制的培养基放于大型玻璃烧杯中，以铝箔低覆盖，放于灭菌锅中，121℃高压蒸汽灭菌20min；

取50g实施例1中富集的种子培养液，接入灭菌后经降温至室温的上述固体培养基质中，接种量为5.0％(w/w)，并且往上述混合物中分别加入0.1％(v/v)的乙酸、丙酸、正丁酸、异丁酸、正戊酸、异戊酸以及0.02％(w/v)的吲哚、粪臭素。为了充分混匀，可将吲哚和粪臭素先溶解于无水乙醇，然后再添加至培养基中。充分混合均匀后，将混合物装入1kg呼吸袋中，封口，放于30℃恒温培养箱中，静置培养15～20天，每天人工进行充分混匀3～5次，保持呼吸袋不受损。

收集经连续培养后的固体培养物，用作10千克微生物菌剂的放大培养。

实施例3：高效微生物制剂(10千克)的扩培

首先制备固体培养基质1kg，1kg培养基的配方如下(w/w)：38.0％米糠、10.0％菜粕、10.0％鱼粉、14.0％稻草、3.0％牛粪，其余为水分，培养基放于大的无纺布袋中，置于一个钢制托盘中，放于灭菌锅中，121℃高压蒸汽灭菌20min；

取500g实施例2中扩培后的固体培养物，接入上述固体培养基质中，接种量5.0％(w/w)，混合均匀，装入10kg呼吸袋中，并且往上述混合物中分别加入0.1％(v/v)的乙酸、丙酸、正丁酸、异丁酸、正戊酸、异戊酸以及0.01％(w/v)的吲哚、粪臭素。为了充分混匀，可将吲哚和粪臭素先溶解于无水乙醇，然后再添加至培养基中。封口，30℃静置培养20～30天，每天充分混匀数次，获得能够高效处理牛粪便的微生物制剂。

实施例4：微生物制剂的菌群检测

称5～10g待检测样品，提取总基因组dna，具体提取步骤参照omega试剂盒e.z.n.atmmag-bindsoildnakit的试剂盒使用说明书(网址链接：http://www.omegabiotek.com.cn/product/109.html)。将基因组提交到至生物公司进行16s、18s宏基因组测序及生物信息学比较分析，其中用于扩增16s的引物对分别为341f：5′-ccctacacgacgctcttccgatctgcctacgggnggcwgcag-3′及805r：5′-gactggagttccttggcacccgagaattccagactachvgggtatctaatcc-3′；而用于扩增18s的引物对为ns1：5′-cctacacgacgctcttccgatctngtagtcatatgcttgtctc-3′及fung：5′-gactggagttccttggcacccgagaattccaattccccgttacccgttg-3′。

利用qubit2.0dna检测试剂盒对基因组dna精确定量，以确定pcr反应应加入的dna量。pcr所用的引物融合了miseq测序平台的通用引物，并利用pcr体系按照如下进行：

配置好的pcr体系按照如下反应条件进行pcr扩增：

94℃，3min

94℃，30sec,45℃，30sec,65℃，30sec；5个循环

94℃，20sec,55℃，20sec,72℃，30sec；20个循环

72℃，5min，然后是4℃

扩增后的dna利用dna纯化试剂盒进行回收纯化并作dna的精确定量，然后对每个样品dna量取10ng，最终上机测序浓度为20pmol。测序后的dna数据经过生物信息学处理分析，得到如图1和图2所示的微生物丰度排序情况图。图1是本发明实施例中制得的微生物制剂中包含的原核微生物种类的组成和相对含量的示意图；图2是本发明实施例中制得的微生物制剂中包含的真核微生物种类的组成和相对含量的示意图。其中黑色图框表示训化前原始样品中的菌，斜条纹图框表示本发明制得的训化后的微生物制剂中的菌。

从图中可知：本发明获得的高效微生物制剂中，在原核微生物中，类芽孢杆菌的增长最多；而在真核微生物中，红曲霉菌和粉状毕赤酵母菌的数量较多。

实施例5：高效微生物制剂在奶牛养殖床技术中的应用

一个200(10m*20m)平米的奶牛养殖床大概可以养殖15头成年奶牛，首先将约60吨的木屑均匀铺设在养殖场内，再将约200公斤的微生物菌剂均匀地撒到表面，再利用翻匀机械设备进行2～3次深耕搅拌。木屑的铺设厚度约为50cm，含水量低于50％。铺设完成后，奶牛便可以在养殖床上进行排便，每日利用翻耕设备对表层的木屑和粪便进行一定的混匀，这样便可以完成奶牛松软舒适的养殖环境，养殖床中的微生物每年可以补充3～4次，每次约0.5公斤/m²，微生物可以对奶牛粪便中的酸臭物进行降解，并完全利用和分解其中的蛋白质、脂类、糖类成分，减少了自然分解状态下氨、胺类、有机酸等有害物质的释放，改善了养殖场的饲养工人的作业环境，真正实现零排放生态养殖。

上述仅为本发明的部分优选实施例，本发明并不仅限于实施例的内容。对于本领域中的技术人员来说，在本发明技术方案的构思范围内可以有各种变化和更改，所作的任何变化和更改，均在本发明保护范围之内。