一种PWS及AS的快速检测方法与流程

本发明属于遗传病基因检测技术领域，涉及一种pws及as的快速检测方法。

背景技术：

pws/as是两种与基因组印记相关的遗传性疾病，父源15q11-13区域基因缺陷导致prader-willi综合征(pws)，其临床表现为新生儿肌张力低，发育延迟，身材矮小，下丘脑性腺发育不良等；母源15q11-13区域基因缺陷导致angelman综合症(as)。15q11-13区带内各复制子之间发生非平衡易位，由于这些复制子中存在对物种生存相当重要的高度保守序列，因此，15q11-13遗传物质缺失将造成发育迟缓，语言障碍等临床表现。

印记基因具有差异表达特性，这种差异常常是由父方及母方的等位基因传给子代时发生了修饰，其中较为重要的是dna甲基化修饰。dna甲基化修饰是一个主要的表观遗传学修饰。

诊断pws/as疾病的方法有几种，如高分辨率染色体分析、荧光原位杂交、多重连接探针扩增技术(mlpa)。但是上述几种方法均比较复杂，需要时间较长，检测过程缓慢，成本高，检测结果存在不确定性。文献报道方法没有临床检测需要的质控，操作标准及其他环境控制指标。

李璃、刘安等人发表了prader-willi和angelman综合征的分子遗传学诊断研究，用全基因组单核苷酸多态性微阵列芯片(snp-array)对疑似prader-willi综合征(pws)和angelman综合征(as)患儿进行细胞分子遗传学诊断,并根据检测结果对其家系下一胎进行产前遗传学诊断。方法对3位疑似pws和as患儿进行常规g显带染色体核型分析；提取患者外周血dna进行snp-array扫描,阳性结果进行父母样本的snp-array检测用以溯源。上述检测方法比较复杂，需要时间较长，检测过程缓慢。

技术实现要素：

为了克服现有技术的不足，本发明提供一种pws及as的快速检测方法，采用ms-pcr方法检测pws/as，用重亚硫酸盐处理dna样本，可以在短时间内完成，同时还采用柱上去亚硫酸基团的方法，使得整个操作流程更为简便，同时对多处细节做了处理和调整，形成了一套完整的检测体系，设置多个质控点，是通过临床验证可靠的检测方法。ms-pcr是一种快速、高效，并且特异性和敏感性均佳的分子诊断方法，同时，检测成本较低，可诊断绝大多数的pws/as临床病例。

本发明提供了如下的技术方案：

一种pws及as的快速检测方法，包括以下步骤：

(1).采集血液、羊水或唾液中的至少一种并进行dna提取；

(2).提取完dna后，对其进行质量检测；

(3).dna甲基化处理，检测dna甲基化处理后的浓度及纯度；

(4).进行ms-pcr反应；

(5).电泳检测，结果分析。

优选的是，所述步骤(1)中采集全血采用edta抗凝管采集或采血卡采集。

上述任一方案优选的是，所述用edta抗凝管采集具体操作方法为：采集待检者外周血5ml，立即轻柔颠倒混合采血管多次，混匀后4℃放置。将edta抗凝管分别包装，低温运输。

上述任一方案优选的是，所述采血卡采集的具体操作方法为：采集完血液后，滴加在采血卡上，待其晾干后进行运送。

上述任一方案优选的是，所述羊水采集的具体方法为：医生按标准采集后，专用包装保存，低温运输。

上述任一方案优选的是，所述唾液采集的具体方法为：待检者按唾液试子采集要求采集唾液样本，低温运输。

上述任一方案优选的是，所述步骤(1)中dna提取常用例包括血斑dna提取、全血dna提取、羊水dna提取、唾液dna提取中的至少一种。

上述任一方案优选的是，所述血斑dna提取，采用qiagen试剂盒进行，使用试剂盒前需要先在缓冲液aw1和缓冲液aw2中加入无水乙醇。

上述任一方案优选的是，所述全血dna提取，采用任意提取方法或提取试剂盒提取，要求是dna质量及浓度达到实验需求。

上述任一方案优选的是，所述步骤(2)中提取dna后，使用nanodrop对所有dna样本进行浓度、质量检测，达到既定质检标准，可进入下一步试验，质检不通过，需重新提取或纯化处理，直到质检通过。

上述任一方案优选的是，所述步骤(3)中dna甲基化处理方法包括以下步骤：

(1).将待处理的dna样本从-20℃取出，解冻，待dna完全解冻后，轻微震荡离心；

(2).取pcr管，加入待处理的dna样本与ctconversionreagent，颠倒混匀，短暂离心；

(3).将pcr管置于pcr仪上，条件如下：

(4).将收集柱置于离心管中，加入m-bindingbuffer到收集柱中；

(5).转移步骤2中的样本到收集柱中，盖紧管盖后颠倒混匀几次，离心，弃废液；

(6).加m-wash-buffer到收集柱中，离心；

(7).加m-desulphonationbuffer到收集柱中，孵育，离心；

(8).加m-washbuffer到收集柱中，离心，重复操作；

(9).转移收集柱到离心管中，加m-elutionbuffer到收集柱，静置，离心，回收样本。

上述任一方案优选的是，所述步骤(4)中ms-pcr引物为：

反应体系为：

ms-pcr反应程序为：

上述任一方案优选的是，所述步骤(5)中电泳检测时采用采用3％琼脂糖凝胶电泳检测，50bpmarker或者100bpmarker标记。

上述任一方案优选的是，所述步骤(5)中结果分析按照标准的依据，对检测结果进行判读。

本发明的原理：正常人同时存在父源母源基因，而在患者中只存在父源或母源其中一方基因。位于15q11-13区域的小核糖核酸多肽n基因(snrpn)序列经亚硫酸氢钠处理后，父源dna非甲基化的胞嘧啶转化为尿嘧啶，而母源dna甲基化胞嘧啶则不变，用特异pcr引物(父源p引物，母源m引物)，便可将等位基因区别开。

有益效果

(1).本发明用重亚硫酸盐处理dna样本，可以在短时间内完成，同时还采用柱上去亚硫酸基团的方法，使得整个操作流程更为简便；

(2).检测试剂统一处理保存，全部为一次性取用，不涉及反复冻融及交叉污染的问题，同时便于批量化操作，可以承接大检测样本通量；

(3).形成完整的检测及质控体系，便于样本管控及问题查找；

(4).优化后的最适实验条件，能有效保证检测的成功率，避免处理不当，目标区域扩增效率不高，必须进行重复检测带来的时间的不确定性；

(5).检测流程标准化，有配套的操作规范和试验记录表单(按医学检测标准编写)，适用于pcr实验室的临床检测。

附图说明

图1为pws家系检测ms-pcr电泳检测结果；注：m：maker；1：阴性水对照；2：正常对照样本；3：病人样本；4：正常对照样本；

图2为as家系检测ms-pcr电泳检测结果；注：正常人有父源、母源两个扩增结果；母源缺失为as患者，父源缺失为pws患者。

具体实施方式

为了进一步了解本发明的技术特征，下面结合具体实施例对本发明进行详细地阐述。实施例只对本发明具有示例性的作用，而不具有任何限制性的作用，本领域的技术人员在本发明的基础上做出的任何非实质性的修改，都应属于本发明的保护范围。

实施例一

一种pws及as的快速检测方法按照以下步骤进行：

1.样本采集及运输要求(医院采样)

从基因水平来检测pws-as疾病，需要获得dna样本，我们通过采集血液、羊水、唾液、组织进行基因组的提取。

1.1edta抗凝管采集

用edta抗凝管采集孕妇外周血5ml，立即轻柔颠倒混合采血管10次。混匀后将采血管直立放于试管架上，4℃放置。将edta抗凝管分别放入泡泡纸中独立包装，泡沫箱底层放上用报纸包裹的冰袋(报纸需多包几层)，再将包好的edta抗凝管放入用报纸、泡沫等软性填充物将泡沫箱填满，封箱，低温运输。4小时内必须进行血浆分离。

1.2临床采血卡采集

临床血液用采血卡的形式进行运输，采集完血液后，滴加在采血卡上，待其晾干后室温运送。

1.3临床羊水采集

医生按标准采集后，专用包装保存后，低温运输。

1.4唾液样本采集

待检者按唾液试子采集要求采集唾液样本，低温运输。

2.样本dna提取(样本处理区)

实验人员做好防护措施，样本提取前填写完整的提取试验表单，跟踪样本进程，双人核对，避免样本污染、混淆、溢出等试验失误。试验结束后按规定保存血液样本及dna样本到规定的位置，完成提取试验表单，并交接样本。

提取质检不通过的样本重新进入样本提取流程。

以常见样本血斑样本及全血样本为例，具体流程如下：

2.1血斑dna提取

当样本以采血卡的形式运送过来，我们进行血斑dna提取，采用qiagen试剂盒实验。使用试剂盒前请先在缓冲液aw1和缓冲液aw2中加入无水乙醇，加入体积参照瓶上的标签。

具体流程：

(1).用打孔器对血斑进行打孔取到1.5ml的离心管中，每个血斑打5个孔；

(2).每管加入300ul的atl和20ul的proteinasek；

(3).轻轻颠倒混匀，简短离心以去除管盖内壁的液滴。56℃温浴1h，1500rpm旋转震荡；

(4).在生物安全柜中加入300ulal溶液，70℃温浴10min，1500rpm旋转震荡；

(5).每管加入150ul的无水乙醇，颠倒混匀，短暂离心；

(6).将上一步所得溶液加到一个吸附柱中(吸附柱放入收集管中，小纸片不需要)，8000rpm，离心1min；

(7).将吸附柱放入新的收集管中，加入500ul的aw1溶液，8000rpm，离心1min；

(8).将吸附柱放入新的收集管中，加入700ul的aw2溶液，8000rpm，离心1min；

(9).再将吸附柱放入新的收集管中，加入700ul的无水乙醇溶液，8000rpm，离心1min；

(10).再将吸附柱放入新的收集管中，最大转速空离，离心1min；

(11).将吸附柱放入干净发离心管中，室温放置10min；

(12).加入35ul的nf-h2o，静置5min，最大转速离心1min；

(13).填写血斑dna提取任务单；

2.2全血dna提取(样本处理区)

当样本抗凝管全血的形式运送过来，我们进行全血dna提取，采用天根试剂盒实验。使用前请先在缓冲液gd和漂洗液pw中加入无水乙醇，加入体积请参照瓶上的标签。

具体流程：

(1).取100ul血液到1.5ml的离心管；

(2).加入10ul的proteinasek溶液；

(3).加入100ul的缓冲液gb，轻轻颠倒混匀，简短离心以去除管盖内壁的液滴。56℃温浴10min，并不时轻摇样品；

(4).加入50ul乙醇(96-100％)，如果室温超过25℃，请将乙醇置冰上预冷。轻轻颠倒混匀样品，室温放置3min。简短离心以去除管盖内壁的液滴；

(5).将上一步所得溶液都加到一个吸附柱cr2中(吸附柱放入收集管中)，12,000rpm，离心30s，弃废液，将吸附柱cr2放回收集管中；

(6).向吸附柱cr2中加入500ul缓冲液gd(使用前请先检查是否已加入无水乙醇)，12,000rpm，离心30s，弃废液，将吸附柱cr2放回收集管中；

(7).向吸附柱cr2中加入600ul漂洗液pw(使用前请先检查是否已加入无水乙醇)，12,000rpm，离心30s，弃废液，将吸附柱cr2放回收集管中；

(8).重复操作步骤8；

(9).12,000rpm，离心2min，倒掉废液。将吸附柱cr2置于室温放置2-5min，以彻底晾干吸附材料中残余的漂洗液；

注意：这一步的目的是将吸附柱中残余的漂洗液去除，漂洗液中乙醇的残留会影响后续的酶反应(酶切、pcr等)实验。

(10).将吸附柱cr2转入一个干净的离心管中，向吸附膜中间位置悬空滴加25ul洗脱水，室温放置2-5min，12,000rpm，离心2min，为增加基因组dna的得率，可将离心得到的溶液再次加入吸附柱，重复一次；

(11).填写全血dna提取任务单；

3.nanodrop浓度纯度测定(样本制备区)

从血斑或全血中提取完dna后，对其进行质量检测，使用nanodrop检测仪进行dna浓度及纯度测定。

要求dna样本浓度不能低于25ng/ul，260/280在1.8-2.0之间。浓度及纯度不达要求的样本，重新提取或纯化处理后，重新质检，直到dna样本符合实验要求，质控通过。

4.dna甲基化试剂盒使用前处理(试剂准备区)

在试剂准备区完成试剂配置，分装，保存，按计划统一处理，避免污染。

本检测方法采用zednamethylation-goldtmkit。

(1).预处理ct转换反应液(ctconversionreagent)

ctconversionreagent在试剂盒中是固体混合粉末，在第一次使用前需溶解混匀，按以下比例混合，室温混匀震荡10min；

注：每管ctconversionreagent可处理11个样本dna。

按样本量配置反应液，配置后分装到pcr管中，视检测样本量处理ctconversionreagent量，分装后即刻使用或-20℃避光保存。一个反应管最多只冻融1次，

保存方法：ctconversionreagent是光敏感试剂，最好现配现用，若不能立即使用，ctconversionreagent需避光保存，4℃保存一周，-20℃保存一个月，再次使用前需37℃温浴后使用。

(2).制备清洗缓冲液(m-washbuffer)

将处理后的试剂保存在一区试剂准备区，使用时按需转到二区样本处理区。

5.dna甲基化处理(样本制备区)

实验人员做好防护措施，样本处理前填写完整的检测表单，跟踪样本进程，双人核对，避免样本污染、混淆、溢出等试验失误。试验结束后按规定保存处理后dna样本到规定的位置，完成检测表单的甲基化处理部分。

用于甲基化处理的dna的量为500ng，体积为20ul(不足20ul的用nfh2o补齐)。

(1).将待处理的dna样本从-20℃取出，放在冰上解冻，待dna完全解冻后，轻微震荡离心；

(2).取pcr管，加入待处理的dna样本20ul与130ul的ctconversionreagent，若dna样本不足20ul，用水补至20ul；颠倒混匀，短暂离心；

(3).将pcr管置于pcr仪上，条件如下：

(4).将收集柱(zymo-spintmiccolumn)置于离心管(collectiontube)中，加入600ul的m-bindingbuffer到收集柱中；

(5).转移步骤2中的样本到收集柱中，盖紧管盖后颠倒混匀几次，1500g，离心30s，弃废液；

(6).加100ul的m-wash-buffer到收集柱中，12000g，离心30s；

(7).加200ul的m-desulphonationbuffer到收集柱中，30℃孵育15min，12000g，离心30s；

(8).加200ul的m-washbuffer到收集柱中，12000g，离心30s；

(9).步骤8重复一次；

(10).转移收集柱到1.5ml离心管中，加20ul的m-elutionbuffer到收集柱中央，静置2min，12000g，离心1min，回收样本；

(11).dna质检，并在20℃保存；

(12).填写dna甲基化任务单

6.qubit浓度纯度测定

本步实验检测dna甲基化处理后的浓度及纯度，具体步骤同7.3，检测的浓度若大于2ng/ul，可以进行下一步实验；

7.ms-pcr(样本处理区/扩增区)

dna样本甲基化处理完及qubit质检之后，进行ms-pcr反应。加入正常人对照，阴性水对照，pws阳性对照，as阳性对照。

(1).pcr体系按如下配方：

(2).降落ms-pcr反应程序

8.琼脂糖电泳检测(产物分析区)

由于snrpn基因经过甲基化处理后，用特异性引物进行pcr扩增得到特异性两条带(m：174bp，p：100bp)。

(1).配制3％琼脂糖：称取0.9g的琼脂糖，加入30ul的1xtae，待其完全溶解，加入3ul的荧光染料，混匀即可；

(2).选取合适的dnamaker(50bp)，每个孔加入5ul的样(pcr产物及loadingbuffer)；

(3).100v恒压进行电泳，1h；

(4).填写ms-pcr体系及电泳任务单；

9.结果分析

每批检测同时加入一个阴性对照(水)和多个正常对照样本，若出现对照结果异常，则该批样本重新检测，若阴性对照和正常样本对照结果正常，说明本批次检测结果可信。

正常对照样本和正常样本显示两条扩增带；pws阳性结果只显示174bp扩增带；as阳性结果只显示100bp扩增带。

(1).pws家系检测：pws阳性结果只显示174bp扩增带，正常实验结果如图1所示：

1：阴性水对照的泳道没有任何条带，正常；2，4：正常对照样本的泳道出现2条带，分子量为174bp的母源条带和100bp的父源条带，正常；3为病人样本的泳道只出现174bp的母源条带。

(2)as家系检测：1为ntc，2为ck,3为父亲，4为母亲，5为先证者，6为胎儿(羊水)，7为ck，由图2结果表明，父亲，母亲，胎儿(羊水)均为正常人，先证者为as患者。

本发明采用全血，血斑，羊水，绒毛膜样本即可完成检测。

本发明优化了实验方案，经过稳定化测试，可得出稳定检测结果，不需要复杂仪器，全部实验需要的设备包括：超清工作台，pcr，电泳检测设备。以上设备常规pcr检测实验室均包括，无需增加设备设施，即可进行检测，成本投入小。本发明经过甲基化处理，得到合适的处理产物，保证扩增产物产量；ms-pcr体系优化，得到特异性高、扩增稳定性高的扩增产物。检测体系流程化，有严格的质控体系、sop、质控表单。本发明的检测方法可批量化操作，日检测量可满足不同要求，可以进行自动化操作；电泳检测可用其他自动化片段分析仪替代，效果一致，避免危害性化学试剂的使用。