一种双功能共聚纳米颗粒抑制剂的制备方法以及在淀粉样β蛋白聚集的抑制和解毒的应用与流程

本发明涉及一种具有金属螯合和抑制纤维化聚集的双重功能的共聚纳米颗粒抑制剂的制备方法和在金属诱导淀粉样β蛋白聚集的抑制和解毒方面的应用。

背景技术：

阿尔兹海默症是最为常见的老年痴呆症，其病症表现为认知功能障碍、记忆能力衰退、情绪不稳定等症状。大量研究表明ad发病过程中伴随着β淀粉样蛋白(amyloidβ-protein，aβ)的聚集过程，在患者脑内神经元细胞中产生纤维状斑块。因此，一般认为aβ聚集成纤维与ad发病之间存在密切联系。

aβ是由跨膜淀粉样前体蛋白(app)先后经β-和γ-分泌酶剪切得到。但由于γ-分泌酶的酶切位点有所不同，因此可以产生出了带有不同c’末端氨基酸的aβ多肽，如aβ43、aβ42、aβ40、aβ38、aβ37。其中，aβ40在人脑内的含量最高，约占aβ多肽总数的50％-70％，而其它种类的aβ含量都很低。而在病理学研究中发现，aβ42是淀粉样斑块的主要组成部分，具有更强的聚集成纤维的能力，并且发现其在家族性ad患者中分泌较多。因此，aβ40和aβ42是现在研究ad治疗方法的主要靶向蛋白。

锌离子与神经系统关系密切，且大脑是体内含锌量最高的器官之一。研究表明，中枢神经系统中大约85％的锌主要与金属蛋白结合，游离锌在大脑内平均含量为血清中锌含量的10倍。适量浓度锌离子对维持体内正常代谢起到关键作用。目前有报道表明ad患者脑内海马体和杏仁核的锌离子水平约比正常人高出30％，这可能是由于锌离子等重金属离子对蛋白质聚集的诱导作用有关。锌离子与aβ快速结合形成不能纤维化的锌-aβ聚集体或者锌离子直接结合到纤维末端，从而抑制aβ纤维化。目前普遍认为这种锌离子诱导的聚集作用所形成的聚集体具有更强的细胞毒性。

为克服金属诱导aβ聚集，近年来提出了一种“金属螯合治疗”的方法，该方法旨在加入金属螯合剂，从而消除金属离子诱导的aβ聚集。一些金属螯合剂例如乙二胺四乙酸二钠(edta)，5-氯-7-碘-8-羟基喹啉(cq)，cq结构衍生物pbt-2，aβ42的his-ala突变体等可以有效抑制金属离子诱导的aβ蛋白的聚集。然而这些传统的小分子金属螯合剂具有非特异性、毒副作用和较低的血脑屏障穿透性。

亚氨基二乙酸(ida)是一种化学原料，通常被用于草甘膦等农药的制造。与酸碱生成盐，还和多种金属形成螯合物。利用ida的金属螯合性能，在色谱分离领域已有报道将其应用于离子交换树脂的原料，而在生物医药领域却未有报道。

此外，目前的“金属螯合治疗”方法主要是针对在高金属浓度的离子存在区域对金属诱导的蛋白聚集进行抑制，从而延缓aβ蛋白的金属诱导聚集，但是对aβ形成淀粉样纤维及其导致的毒性的抑制和解毒效果并不理想。针对aβ形成淀粉样纤维的问题，hong-chenliu等合成了一系列由包括丙烯酸单体共聚而形成的带有负电荷的共聚纳米颗粒，并得到了纳米颗粒表面负电荷对aβ淀粉样聚集产生抑制作用的抑制机理，且得到了具有抑制和解毒作用的纳米颗粒抑制剂(negativelychargedhydrophobicnanoparticlesinhibitamyloidβ-proteinfibrillation:thepresenceofanoptimalchargedensity[j].reactiveandfunctionalpolymers,2016,103:108-116.)。为进一步扩展共聚纳米颗粒在金属存在下的aβ聚集方面的应用，本发明利用亚氨基二乙酸(ida)，合成gma-ida单体(synthesisofmagneticchelatorforhigh-capacityimmobilizedmetalaffinityadsorptionofproteinbyceriuminitiatedgraftpolymerization,langmuir,2005,21,6987-6994)，利用其修饰共聚纳米颗粒，使之具有金属螯合和抑制纤维化聚集的双重功能。该纳米颗粒抑制剂制备工艺简单，生物相容性好，非常适用于作为淀粉样β蛋白聚集的药物和保健品的应用。

技术实现要素：

本发明的目的在于克服现有技术的不足，进一步开发具有金属螯合基团和负电荷表面修饰的双功能纳米颗粒抑制剂。所述纳米颗粒同时具有金属螯合作用和抑制蛋白聚集的作用，可有效抑制金属离子存在条件下的aβ蛋白聚集。同时提供了本发明在作为淀粉样β蛋白聚集的药物和保健品的用途。

本发明的技术方案概述如下：

本发明将亚氨基二乙酸(ida)与甲基丙烯酸缩水甘油酯(gma)的连接产物gma-ida作为单体与n-异丙基丙烯酰胺(nipam)、叔丁基丙烯酰胺(tbam)等单体通过自由基共聚反应合成具有金属螯合能力和抑制蛋白聚集能力的双功能纳米颗粒抑制剂。该方法合成的纳米颗粒的平均粒径为80-120nm。该方法合成的纳米颗粒的金属离子螯合容量达到700-800μmol/g，可以螯合环境中的金属离子，同时抑制aβ42的纤维化聚集过程。

上述gma-ida的结构式如下：

上述双功能纳米颗粒的结构式如下：

纳米颗粒平均粒径80-120nm，纳米颗粒金属离子螯合容量达到700-800μmol/g，其中化学式中x、y、z的比例为38-53：35-50：5-20。

本发明的双功能共聚纳米颗粒的制备方法，其步骤如下：

1)合成甲基丙烯酸缩水甘油酯与亚氨基二乙酸的连接产物gma-ida；

2)将聚合单体n,-n’-亚甲双丙烯酰胺、叔丁基丙烯酰胺、n-异丙基丙烯酰胺按照1-5：38-53：35-50的比例和gma-ida混合，其中控制gma-ida单体占总单体的摩尔比为5-20％。

3)向上述步骤2)中的混合液中加入表面活性剂，例如十六烷基硫酸钠，并使表面活性剂终浓度为0.2-0.4mg/ml；

4)将上述步骤3)的混合液超声处理使之完全溶解，并通入氮气10-60min以排出混合液中的空气；

5)向上述步骤4)中的混合液中加入引发剂过硫酸钠起始共聚反应。在氮气保护下于恒温水浴摇床中反应10-15h后得到双功能共聚纳米颗粒。

本发明得到的双功能共聚纳米颗粒的粒径为80-120nm，在水中的表面δ电位约为-40mv，负电荷表面导致了纳米颗粒与aβ42蛋白的分子间的静电排斥作用，从而更有效地抑制aβ的纤维化聚集；此外，纳米介质表面大量的金属螯合基团，其金属离子螯合容量>700μmol/g，可以有效吸附环境中的金属离子，阻碍了金属离子诱导的淀粉样聚集；同时抑制aβ42的纤维化聚集过程，是一种潜在的治疗阿尔兹海默症的新药原料。

本发明所述的双功能共聚纳米颗粒用于金属离子诱导淀粉样蛋白聚集的抑制的方法具有如下优点：

第一，与普通金属螯合剂相比，本发明的双功能共聚纳米颗粒具有更好的生物相容性；

第二，与先前的单功能纳米颗粒抑制剂相比，本发明的双功能共聚纳米颗粒具有很好的金属螯合能力，可用于淀粉样聚集的“金属螯合治疗”。

第三，本发明的双功能共聚纳米颗粒抑制剂可以同时抑制金属离子诱导的aβ42聚集和aβ42纤维化聚集。

第四，本发明所述的双功能共聚纳米颗粒抑制剂可以降低aβ42聚集过程所产生的细胞毒性作用。

附图说明

图1：实施例4中与锌离子及锌离子和双功能共聚纳米颗粒抑制剂混合物共同培养的aβ42聚集体的tht荧光强度。

图2：实施例5中与锌离子及锌离子和双功能共聚纳米颗粒抑制剂混合物共同培养的aβ42聚集体的透射电镜图。

图3：实施例6中与锌离子及锌离子和双功能共聚纳米颗粒抑制剂混合物共同培养的aβ42聚集体的圆二色谱图。

图4：实施例7中与锌离子及锌离子和双功能共聚纳米颗粒抑制剂混合物共同培养的aβ42对sh-sy5y的细胞存活率影响图。

具体实施方式

下面的实例将对本发明提供的方法予以进一步的说明：

实施例1：双功能共聚纳米颗粒抑制剂的合成。

通过自由基共聚反应制备共聚物纳米粒子。(1)将n,-n’-亚甲双丙烯酰胺、叔丁基丙烯酰胺、n-异丙基丙烯酰胺和gma-ida分别按摩尔比1％、53％、41％、5％混合。混合物中，加入表面活性剂十六烷基硫酸钠15mg，混合液最终体积为50ml。得到的溶液在氮气中吹约30min，以排净空气。加入60mg/ml过硫酸钠引发剂，在氮气保护下于25℃160rpm摇床反应12h。反应后所得聚合物用milliq水透析14天(每天至少两次换水)以除去未反应的单体。纳米颗粒冻干保存在4℃冰箱待用。该条件制得的纳米颗粒的水力学粒径为118±6nm，表面zeta电位为-37±5mv。

实施例2：双功能共聚纳米颗粒抑制剂的合成。

通过自由基共聚反应制备共聚物纳米粒子。(1)将n,-n’-亚甲双丙烯酰胺、叔丁基丙烯酰胺、n-异丙基丙烯酰胺和gma-ida分别按摩尔比2％、40％、48％、10％混合。混合物中，加入表面活性剂十六烷基硫酸钠10mg，混合液最终体积为50ml。得到的溶液在氮气中吹约60min，以排净空气。加入60mg/ml过硫酸钠引发剂，在氮气保护下于25℃160rpm摇床反应15h。反应后所得聚合物用milliq水透析14天(每天至少两次换水)以除去未反应的单体。纳米颗粒冻干保存在4℃冰箱待用。该条件制得的纳米颗粒的水力学粒径为88±6nm，表面zeta电位为-41±8mv。

实施例3：双功能共聚纳米颗粒抑制剂的合成。

通过自由基共聚反应制备共聚物纳米粒子。(1)将n,-n’-亚甲双丙烯酰胺、叔丁基丙烯酰胺、n-异丙基丙烯酰胺和gma-ida分别按摩尔比5％、38％、37％、20％混合。混合物中，加入表面活性剂十六烷基硫酸钠20mg，混合液最终体积为50ml。得到的溶液在氮气中吹约10min，以排净空气。加入60mg/ml过硫酸钠引发剂，在氮气保护下于25℃160rpm摇床反应10h。反应后所得聚合物用milliq水透析14天(每天至少两次换水)以除去未反应的单体。纳米颗粒冻干保存在4℃冰箱待用。该条件制得的纳米颗粒的水力学粒径为80.0±5nm，表面zeta电位为-49±7mv。

实施例4：与锌离子及锌离子和双功能共聚纳米颗粒抑制剂混合物共同培养的aβ42聚集体的tht荧光强度。

首先，将aβ42固体粉末以1mg/ml浓度溶解与hfip中，超声分散20min以除去aβ42聚集体，随后静置2h使aβ42充分溶解。随后将aβ42的hfip溶液于4℃，12000g下冷冻离心20min，取75％的上清液冷冻干燥。将冻干后的aβ42固体粉末在-20℃低温冰箱中储存待用。在使用前，将aβ42固体粉末重新溶解于20mmnaoh中，随后于4℃，12000g下冷冻离心20min，取75％的上清液冷冻干燥。随后加入不含金属离子hepes缓冲液a(20mm,ph7.4)，或含金属离子hepes缓冲液b(20mm,ph7.4，25μmzncl)，或加入了50μg/ml的单功能纳米颗粒(通过文献negativelychargedhydrophobicnanoparticlesinhibitamyloidβ-proteinfibrillation:thepresenceofanoptimalchargedensity[j].reactiveandfunctionalpolymers,2016,103:108-116.中方法合成)的hepes缓冲液b中，或加入了50μg/ml的本发明制备的双功能共聚纳米颗粒的hepes缓冲液b中，最终aβ浓度为25μm。在37℃，160rpm摇床中培养48h。将200μl样品加入2ml40μmtht溶液中，使用荧光分光光度仪(perkingelmerls-55,ma,usa)对aβ42蛋白聚集情况进行测定，测定在25℃条件下进行，其中激发光为440nm，发射光为480nm，狭缝宽度5nm。实验结果取三次测定的平均值。

由图1可以看到，含有锌离子的aβ42聚集的tht荧光强度明显降低，而加入锌离子和双功能共聚纳米颗粒的样品的aβ42聚集的tht荧光显著上升，但而加入锌离子和单功能纳米颗粒的样品的aβ42聚集的tht荧光上升不明显。这说明锌离子诱导aβ42聚集形成不具有β片层结构的聚集体；单功能纳米颗粒无法抑制锌离子诱导的aβ42聚集体形成；而双功能共聚纳米颗粒可以螯合锌离子，抑制锌离子诱导的aβ42聚集体形成。

实施例5：与锌离子及锌离子和双功能共聚纳米颗粒抑制剂混合物共同培养的aβ42聚集体的形貌差异。

按照与实施例4相同的方法处理并培养aβ42样品。在培养了48h后，取100μl的aβ培养液，超声10min，将5-10μl溶液滴加在400目的碳膜铜网上，自然干燥。待铜网上的溶液将干未干时，滴加2％的磷钨酸溶液(ph6.5)负染30s后吸掉多余液体，自然干燥。制得的样品使用jem-100cxii透射电子显微镜(加速电压100kv)观察。选取放大后标尺为100nm的图像进行观察，结果如图2所示。

由图2可以看到，加入锌离子的aβ聚集成了无规则的金属-蛋白聚集体，加入了锌离子和单功能纳米颗粒的aβ42聚集体形态基本与加入锌离子的aβ聚集成的无规则金属-蛋白聚集体一致，这说明单功能纳米颗粒无法抑制金属离子诱导的aβ42聚集。而加入了锌离子和双功能共聚纳米颗粒的aβ42聚集体形成了短而粗的纤维状聚集体。这说明了ida不仅阻止了金属离子诱导的aβ42聚集，而且一定程度上抑制了aβ的纤维化聚集。

实施例6：与锌离子及锌离子和双功能共聚纳米颗粒抑制剂混合物共同培养的aβ42聚集体的二级结构变化

按照与实例4相同的方法处理和培养aβ42蛋白。取300μl培养液加入光程为0.1mm的石英皿中，在远紫外波长(190-260nm)下观察。其中扫描带宽为1nm，扫描速度为100nm/min。连续扫描三次取平均作为测量结果，测量结果如图3所示。

从图3中可以看出，当培养48h后，只含aβ42的样品在200nm左右出现正极大值而在219nm左右出负极小值。该曲线表明样品中形成了β-片层结构。而与25μm锌离子共同培养的样品在200nm左右出现负极小值且在220nm左右有一个很弱负值，这表明样品在锌离子诱导下形成了不规则二级结构。在加入单功能纳米颗粒的样品中，图谱与加入锌离子的结果一致，这表明单功能纳米颗粒无法抑制金属离子诱导的aβ42不规则二级结构的形成。在加入双功能共聚纳米颗粒的样品中，曲线在215-218nm处具有最小值，这可能是α-helix向β-片层转化的二级结构特征。这表明，双功能共聚纳米颗粒可以阻止aβ42蛋白形成锌离子诱导的不规则二级结构，且干扰了β-片层结构的形成。

实施例7：锌离子及锌离子和双功能共聚纳米颗粒抑制剂混合物共同培养的aβ42对sh-sy5y的细胞存活率的影响。

采用了sh-sy5y细胞株(dmem/f12培养基，其中20％fbs，2mmol/l谷氨酰胺，100u/ml双抗)。细胞于37℃，含5％co2的恒温培养箱中培养。

利用mtt检测对细胞活性进行分析。具体实验步骤如下：将细胞培养液加入96孔板中，其中每孔加入90μl细胞液，每孔的细胞密度为5000个。在培养箱中培养24h后，加入10μl250μm的锌离子母液，或含有250μm锌离子和500μg/ml的单功能纳米粒子(通过文献negativelychargedhydrophobicnanoparticlesinhibitamyloidβ-proteinfibrillation:thepresenceofanoptimalchargedensity[j].reactiveandfunctionalpolymers,2016,103:108-116.中方法合成)母液，或含有250μm锌离子和500μg/ml的本发明制备的双功能共聚纳米粒子母液。最终锌离子浓度为25μm，纳米粒子浓度为50μg/ml。继续培养48h后去除培养基，使用hepes缓冲液(ph7.4)清洗，随后在每孔中加入100μl无血清培养基和10μlmtt溶液(6mg/ml)，继续在37℃培养箱中培养4h。

在检测前，首先使用平板离心除去培养基，随后加入100μldmso溶解附着在孔板底的细胞。将96孔板避光离心10min，待紫色晶体全部溶解后，使用酶标仪测定其在570nm的吸光度。通过吸光度计算细胞活性。其中不含细胞的样品为空白组(0％)，不含aβ42和抑制剂，仅含有细胞的样品为对照组(100％)。每个样品设置6个复孔测定，对测定结果取平均。结果如图4所示。

在不含锌离子时，aβ42的加入会导致细胞活性降低至64.7％，而含锌离子的aβ42样品的细胞活性降低至47.6％，明显低于不含锌离子的aβ42样品的细胞活性。这表明锌离子诱导的蛋白聚集具有更高的细胞毒性。加入双功能共聚纳米颗粒的样品具有较高的细胞活性(86.3％),不仅远高于单功能纳米颗粒的样品，且细胞活性明显高于只加入aβ42的样品。这表明双功能共聚纳米颗粒不但螯合了锌离子，消除了金属诱导蛋白质聚集的毒性，同时对aβ42的纤维化聚集导致的细胞毒性也具有良好的解毒作用。

本发明提出了利用自由基共聚合方法，利用金属螯合功能单体、疏水性功能单体等合成了具有金属螯合基团的双功能共聚纳米颗粒，并提出了双功能共聚纳米颗粒在抑制金属诱导β-淀粉样蛋白聚集及其相关细胞毒性的应用，以及在阿尔兹海默症药物和保健品开发方面的应用。已通过现场较佳实施例子进行了描述，相关技术人员明显能在不脱离本发明内容、精神和范围内对本文所述的方法进行改动或适当变更与组合，来实现本发明技术。特别需要指出的是，所有相类似的替换和改动对本领域技术人员来说是显而易见的，他们都被视为包括在本发明精神、范围和内容中。