小反刍兽疫病毒H‑F融合蛋白及其相关生物材料与应用的制作方法

本发明涉及生物
技术领域：
中小反刍兽疫病毒h-f融合蛋白及其相关生物材料与应用。
背景技术：
：小反刍兽疫(pestedespetitsruminants,ppr)是由小反刍兽疫病毒(pestedespetitsruminantsvirus,pprv)引起的一种急性、热性、接触性传染病，具有高发病率和高死亡率的特点。目前，尚无有效方法治疗小反刍兽疫，只能釆取疫苗接种、疫情发生后扑杀及加强定期血清监测的方法控制该病。国内外最常见的报道是以纯化后的pprvn、h蛋白(全长)或包含n蛋白主要抗原表位的部分重组n、h蛋白片段作为包被抗原,也有以浓缩的pprv全病毒作为包被抗原建立间接elisa方法检测ppr血清抗体(邱文英,2011；balamuruganetal.,2007)，但尚未见到以h-f串联融合蛋白为包被抗原建立间接elisa方法的报道。pprv基因组共编码6种结构蛋白，即核蛋白(n)、磷蛋白(p)、多聚酶大蛋白(l)、基质蛋白(m)、融合蛋白(f)和血凝素蛋白(h)。其中，h基因全长1852bp,由609个氨基酸编码,分子量为68kda。f基因全长2321bp,含有一个orf,f蛋白含有546个氨基酸,分子量大约为59kda,在麻疫病毒属中高度保守。f基因全长2321bp,含有一个orf,f蛋白含有546个氨基酸,分子量大约为59kda,在麻疫病毒属中高度保守。h和f蛋白的抗原性稳定，在病毒感染的动物血清中针对h、f融合蛋白的抗体占主导地位，是两个很好的作为诊断抗原的靶基因。但是，多数研究表达的小反刍兽疫h、f蛋白表达产物通常以不溶性的单价蛋白的包涵体形式存在，具有可溶性的h-f融合活性蛋白表达尚未见报道。单价的包涵体蛋白的表达由于存在表达量不足以及空间结构存在错误折叠，不能形成高级蛋白结构与天然空间构象表位，导致其作为诊断抗原不能形成很好的免疫空间表位。同时，单价的包涵体中的表达产物不具有生物学活性，因而需要进行变性与复性处理。蛋白的变性与复性是一个极其复杂的过程，不同蛋白的复性条件各异，复性率往往很难提高。这是限制其应用的主要制约因素。技术实现要素：本发明所要解决的一个技术问题是如何临床快速检测小反刍兽疫。为解决上述技术问题，本发明提供了可溶性表达的重组小反刍兽疫病毒h-f融合蛋白及其相关生物材料。为解决上述技术问题，本发明提供了a)或b)的重组小反刍兽疫病毒h-f融合蛋白：a)由seqidno.2的氨基酸序列组成的蛋白质；b)将seqidno.2所示的氨基酸序列经过一个或几个氨基酸残基的取代和/或缺失和/或添加得到的可溶性蛋白质。上述蛋白质中，a)的蛋白质名称为rmhf1-y(又称rmhf1)，是重组串联的pprvh-f蛋白。seqidno.2由1184个氨基酸残基组成。上述蛋白质中，所述蛋白质可按照包括如下步骤的方法制备：使所述蛋白质的编码基因在生物中进行表达得到所述蛋白质；所述生物为微生物、植物或非人动物。上述蛋白质中，使所述蛋白质的编码基因在生物中进行表达包括将所述的蛋白质的编码基因导入受体微生物，得到表达所述蛋白质的重组微生物，培养所述重组微生物，表达得到所述蛋白质。上述蛋白质中，所述受体微生物可为c1)-c4)中的任一种:c1)原核微生物；c2)革兰氏阴性细菌；c3)埃希氏菌属细菌；c4)大肠杆菌bl21(de3)。上述蛋白质中，所述蛋白质的编码基因为如下1)或2)所示的dna分子：1)编码序列是seqidno.1第4-3558位所示的dna分子；2)与1)限定的dna分子具有90％以上的同一性且编码rmhf1-y的dna分子。其中，seqidno.1由3564个核苷酸组成，seqidno.1第4-3558位为rmhf1-y基因的核苷酸序列，seqidno.1第4-3558位所示的rmhf1-y基因编码氨基酸序列是seqidno.2的蛋白质rmhf1-y。上述蛋白质中，2)具体可为核苷酸序列与1)具有至少91％、92％、95％、96％、98％或99％的同一性的dna分子。上述蛋白质中，所述重组微生物为将pet30a-rmhf1-y导入大肠杆菌bl21(de3)得到的表达氨基酸序列是seqidno.2的蛋白质的重组微生物，所述重组微生物命名为bl21(de3)/pet30a-rmhf1-y，所述pet30a-rmhf1-y是用seqidno.1所示的dna替换pet30a(+)的ndei和xhoi识别位点间的片段(包括ndei识别位点和xhoi识别位点在内的小片段)，保持pet30a(+)的其它序列不变，得到的rmhf1-y基因重组表达载体。上述蛋白质中，所述表达为诱导表达，所述诱导表达是用0.75mm的iptg在16℃诱导13-16小时或13-24小时或13小时或16小时。与所述蛋白质相关的生物材料也属于本发明的保护范围，所述生物材料可为下述b1)至b16)中的任一种：b1)编码所述蛋白质的核酸分子；b2)含有b1)所述核酸分子的表达盒；b3)含有b1)所述核酸分子的重组载体；b4)含有b2)所述表达盒的重组载体；b5)含有b1)所述核酸分子的重组微生物；b6)含有b2)所述表达盒的重组微生物；b7)含有b3)所述重组载体的重组微生物；b8)含有b4)所述重组载体的重组微生物；b9)含有b1)所述核酸分子的转基因动物细胞系；b10)含有b2)所述表达盒的转基因动物细胞系；b11)含有b3)所述重组载体的转基因动物细胞系；b12)含有b4)所述重组载体的转基因动物细胞系；b13)含有b1)所述核酸分子的转基因植物细胞系；b14)含有b2)所述表达盒的转基因植物细胞系；b15)含有b3)所述重组载体的转基因植物细胞系；b16)含有b4)所述重组载体的转基因植物细胞系。其中，所述核酸分子可以是dna，如cdna、基因组dna或重组dna；所述核酸分子也可以是rna，如mrna或hnrna等。本文中，术语“同一性”指与天然核酸序列的序列相似性。同一性可以用肉眼或计算机软件进行评价。使用计算机软件，两个或多个序列之间的同一性可以用百分比(％)表示，其可以用来评价相关序列之间的同一性。上述生物材料中，所述核酸分子可为如下1)或2)所示的dna分子：1)编码序列是seqidno.1第4-3558位所示的dna分子；2)与1)限定的dna分子具有90％以上的同一性且编码rmhf1-y的dna分子。其中，seqidno.1由3564个核苷酸组成，seqidno.1第4-3558位为rmhf1-y基因的核苷酸序列，seqidno.1第4-3558位所示的rmhf1-y基因编码氨基酸序列是seqidno.2的蛋白质rmhf1-y。上述生物材料中，2)具体可为核苷酸序列与1)具有至少91％、92％、95％、96％、98％或99％的同一性的dna分子。上述生物材料中，所述重组载体可为所述pet30a-rmhf1-y；所述重组微生物可为e1)或e2)：e1)所述重组微生物为将所述的蛋白质的编码基因导入受体微生物，得到表达所述蛋白质的重组微生物，所述受体微生物为c1)-c4)中的任一种:c1)原核微生物；c2)革兰氏阴性细菌；c3)埃希氏菌属细菌；c4)大肠杆菌bl21(de3)。e2)所述重组微生物为将所述pet30a-rmhf1-y导入大肠杆菌bl21(de3)得到的表达氨基酸序列是seqidno.2的蛋白质的重组微生物。上述生物材料中，b9)至b16)可包括繁殖材料也可不包括繁殖材料。d1)或d2)的应用也属于本发明的保护范围：d1)所述蛋白质或所述生物材料在制备小反刍兽疫诊断抗原中的应用、在制备检测小反刍兽疫病毒抗体的试剂盒中的应用或在制备小反刍兽疫诊断试剂盒中的应用；d2)所述蛋白质在制备单克隆抗体中的应用。本发明将小反刍兽疫病毒h和f蛋白基因进行密码子优化后融合串联后在大肠杆菌中获得了可溶性融合高表达抗原rmhf1-y(重组小反刍兽疫病毒h-f融合蛋白)：本发明用seqidno.1所示的dna替换pet30a(+)的ndei和xhoi识别位点间的片段(包括ndei识别位点和xhoi识别位点在内的小片段)，保持pet30a(+)的其它序列不变，得到的rmhf1-y基因重组表达载体pet30a-rmhf1-y，将pet30a-rmhf1-y导入大肠杆菌bl21(de3)获得了可溶性的目的蛋白rmhf1。用0.75mm的iptg在16℃诱导16小时，rmhf1的含量达到菌体总蛋白的45％，表达的rmhf163％可溶。实验证明，将rmhf1-y作为包被抗原建立的间接elisa检测小反刍兽疫病毒抗体的方法具有较高的特异性、敏感性和良好的精确度,且能快速、简便的操作,有利于临床上对小反刍兽疫的监测。将rmhf1-y作为包被抗原建立的间接elisa检测小反刍兽疫病毒抗体的方法与法国id-vet的小反刍兽疫抗体检测试剂盒符合率为94.5％，而以重组pprvh蛋白rmh作为包被抗原建立的间接elisa检测小反刍兽疫病毒抗体的方法与法国id-vet的小反刍兽疫抗体检测试剂盒的符合率只有83.3％，以重组pprvf蛋白rmf作为包被抗原建立的间接elisa检测小反刍兽疫病毒抗体的方法与法国id-vet的小反刍兽疫抗体检测试剂盒的符合率只有72.6％。说明将rmhf1-y作为包被抗原建立的间接elisa检测小反刍兽疫病毒抗体的方法与法国id-vet的小反刍兽疫抗体检测试剂盒的符合率显著高于以重组pprvh蛋白rmh作为包被抗原建立的间接elisa检测小反刍兽疫病毒抗体的方法和以重组pprvf蛋白rmf作为包被抗原建立的间接elisa检测小反刍兽疫病毒抗体的方法。将rmhf1-y作为包被抗原建立的间接elisa检测小反刍兽疫病毒抗体的方法的敏感性显著高于以重组pprvh蛋白rmh作为包被抗原建立的间接elisa检测小反刍兽疫病毒抗体的方法和以重组pprvf蛋白rmf作为包被抗原建立的间接elisa检测小反刍兽疫病毒抗体的方法。将rmhf1-y作为包被抗原建立的间接elisa检测小反刍兽疫病毒抗体的方法不仅可用于小反刍兽疫的诊断,而且可评价疫苗免疫效果,此外,该方法可快速准确的检测小反刍兽疫,从而为我国更好的控制小反刍兽疫的传播将会产生积极作用。附图说明图1为各菌株表达蛋白的sds-page电泳图谱。图中，m为marker，从上到下分别为180kda、150kda、130kda、92kda、62kda、43kda、26kda、10kda；1、诱导表达的受体菌全菌蛋白液体，2、诱导表达的bl21(de3)/pet30a-rmhf1-y含蛋白上清液，3、诱导表达的bl21(de3)/pet30a-rmhf1-y含蛋白沉淀，4、诱导表达的bl21(de3)/pet30a-rmhf1-y的全菌蛋白液体，5、镍柱纯化后的上清可溶性蛋白，6、分子筛纯化后的上清可溶性蛋白，7、诱导表达的bl21(de3)/pet30a-rmhf1-w全菌蛋白液体，8、诱导表达的bl21(de3)/pet30a-rmhf2-y全菌蛋白液体。图2为重组蛋白rmhf1-y的分子筛纯化鉴定与结构鉴定。箭头所指的为纯化的目的蛋白峰。具体实施方式下面结合具体实施方式对本发明进行进一步的详细描述，给出的实施例仅为了阐明本发明，而不是为了限制本发明的范围。下述实施例中的实验方法，如无特殊说明，均为常规方法。下述实施例中所用的材料、试剂等，如无特殊说明，均可从商业途径得到。pet30a(+)为novagen公司产品。pet28a(+)为novagen公司产品。实施例1、可溶性表达rmhf11、合成基因本申请设计了3种小反刍兽疫病毒h和f蛋白融合基因，分别为seqidno.1第4-3558位所示的rmhf1-y基因、seqidno.3第1-3684位所示的rmhf2-y基因和seqidno.5第4-3558位所示的rmhf1-w基因。rmhf1-y基因和rmhf2-y基因在核苷酸序列上的区别仅在于5'端不同，seqidno.1第24-3564位和seqidno.3的第150-3690位核苷酸相同。rmhf1-y基因和rmhf1-w基因均编码seqidno.2所示的蛋白质rmhf1，rmhf2-y基因编码seqidno.3所示的蛋白质rmhf2。rmhf1和rmhf2在氨基酸序列上的区别仅在于氨基端不同，seqidno.2第8-1184位和seqidno.3第51-1227位氨基酸残基相同。2、重组表达载体和重组菌的构建用seqidno.1所示的dna替换pet30a(+)的ndei和xhoi识别位点间的片段(包括ndei识别位点和xhoi识别位点在内的小片段)，保持pet30a(+)的其它序列不变，得到rmhf1-y基因重组表达载体，命名为pet30a-rmhf1-y。pet30a-rmhf1-y含有rmhf1-y基因，rmhf1-y基因的核苷酸序列是seqidno.1的第4-3558位核苷酸，rmhf1-y基因编码seqidno.2所示的蛋白质rmhf1。用seqidno.5所示的dna替换pet30a(+)的ndei和xhoi识别位点间的片段(包括ndei识别位点和xhoi识别位点在内的小片段)，保持pet30a(+)的其它序列不变，得到rmhf1-w基因重组表达载体，命名为pet30a-rmhf1-w。pet30a-rmhf1-w含有rmhf1-w基因，rmhf1-w基因的核苷酸序列是seqidno.5的第4-3558位核苷酸，rmhf1-w基因编码seqidno.2所示的蛋白质rmhf1。用seqidno.3第145-3690位所示的dna替换pet30a(+)的bamhi和xhoi识别位点间的片段(包括bamhi识别位点和xhoi识别位点在内的小片段)，保持pet30a(+)的其它序列不变，得到rmhf2-y基因重组表达载体，命名为pet30a-rmhf2-y。pet30a-rmhf2-y含有rmhf2-y基因，rmhf2-y基因的核苷酸序列是seqidno.3的第1-3684位核苷酸，rmhf2-y基因编码seqidno.4所示的蛋白质rmhf2。将pet30a-rmhf1-y、pet30a-rmhf1-w和pet30a-rmhf2-y分别单独转化大肠杆菌bl21(de3)感受态细胞。将其均匀涂布于含卡那霉素的lb平板上，37℃培养16小时。单菌落振荡培养过夜，提取质粒进行测序，将测序结果表明含有pet30a-rmhf1-y的重组大肠杆菌命名为bl21(de3)/pet30a-rmhf1-y，将测序结果表明含有pet30a-rmhf1-w的重组大肠杆菌命名为bl21(de3)/pet30a-rmhf1-w，将测序结果表明含有pet30a-rmhf2-y的重组大肠杆菌命名为bl21(de3)/pet30a-rmhf2-y。3、蛋白表达形式的分析与鉴定将bl21(de3)/pet30a-rmhf1-y、bl21(de3)/pet30a-rmhf1-w、bl21(de3)/pet30a-rmhf2-y和大肠杆菌bl21(de3)(简称受体菌)这四个菌株分别单独接种于含50μg/ml卡那霉素的lb液体培养基(在lb液体培养基中加入卡那霉素至卡那霉素的浓度为50μg/ml得到的培养基)中，37℃，采用thermomaxq6000型全温振荡器200rpm振荡培养至0d600值(以含50μg/ml卡那霉素的lb液体培养基为空白对照)达到0.6时，加入异丙基硫代-β-d-半乳糖苷(iptg)进行诱导表达。上述四株菌的诱导表达均是用0.75mm的iptg在16℃诱导16小时(该诱导表达条件是经过对温度、时间、iptg浓度等条件进行优化得到的高效可溶性诱导表达条件)。取诱导表达发酵液用于蛋白表达形式分析。具体步骤为，取1ml发酵液置于1.5ml离心管中，做好标记，4℃条件下8500rpm/min离心45min，弃掉上清液，收集菌体沉淀。加入1mlpbs重悬沉淀，8000rpm/min离心5min，弃掉上清液。向洗涤好的菌体沉淀中加入200μlpbs，高压破碎菌体，裂解至菌液不再粘稠，得到全菌蛋白液体。将全菌蛋白液体于4℃离心机中18000rpm/min离心45min，分别收集上清液(命名为含蛋白上清液)和沉淀(命名为含蛋白沉淀)，向含蛋白沉淀中加入50μlpbs重悬洗涤沉淀。向全菌蛋白液体、含蛋白上清液和含蛋白沉淀中加入10μl5×sds-pageloadingbuffer，充分混匀后，置沸水浴中煮沸5min，待样品冷却后，用掌式离心机瞬离。取6μl用于sds-page电泳分析，并且结合蛋白灰度分析软件初步分析蛋白含量。将电泳后的凝胶转印于nc膜，以抗his标签的羊抗鼠抗体为结合抗体dab显色，进行western-blot鉴定。将上述全菌蛋白液体和含蛋白上清液用0.22μm滤膜过滤后上样至预先用溶液1(溶质及其浓度如下：20mmtris、150mmnacl，溶剂是水，ph8.0的溶液)平衡好的镍柱。将镍柱接入akta机器上，分别用10个柱体积的溶液1与10个柱体积的溶液2(溶质及其浓度如下：20mmtris、150mmnacl、50mm咪唑，溶剂是水，ph8.0的溶液)清洗镍柱中的杂质蛋白，并在akta机器上监测蛋白峰。用溶液3(溶质及其浓度如下：20mmtris、150mmnacl、300mm咪唑，溶剂是水，ph8.0的溶液)冲洗挂在镍柱上的目的蛋白，并使用akta收集出现目的蛋白峰的洗脱样品，将该样品称为镍柱纯化目的蛋白样品。将镍柱纯化的目的蛋白样品用ge公司生产的superdex200凝胶柱通过分子筛进一步纯化。流动相使用溶液1。通过分子筛纯化后可以除去样品中的含有的大量咪唑，收集洗脱峰，得到分子筛纯化的目的蛋白样品，使用nanodrop2000超微量分光光度计(nd2000)对得到的分子筛纯化的目的蛋白样品中蛋白(即可溶性目的蛋白)的含量进行定量分析。并用nanodrop2000超微量分光光度计(nd2000)测定全菌蛋白液体中的蛋白质含量，得到菌体总蛋白含量。将含蛋白沉淀用尿素溶解后，用nanodrop2000超微量分光光度计(nd2000)测定含蛋白沉淀中的蛋白质的含量。结果表明诱导表达的bl21(de3)/pet30a-rmhf1-y的全菌蛋白液体、含蛋白上清液和含蛋白沉淀中均含有大小为131kda的目的蛋白rmhf1；诱导表达的bl21(de3)/pet30a-rmhf1-y的全菌蛋白液体中的目的蛋白rmhf1占菌体总蛋白(全菌总蛋白)的45％，诱导表达的bl21(de3)/pet30a-rmhf1-y的含蛋白上清液中的目的蛋白rmhf1占诱导表达的bl21(de3)/pet30a-rmhf1-y的全菌蛋白液体中目的蛋白hf-his的63％，该63％的目的蛋白rmhf1为可溶性蛋白；诱导表达的bl21(de3)/pet30a-rmhf1-y的含蛋白沉淀中的目的蛋白rmhf1占诱导表达的bl21(de3)/pet30a-rmhf1-y的全菌蛋白液体中目的蛋白rmhf1的37％，该37％的目的蛋白rmhf1为不溶性包涵体蛋白；说明诱导表达的bl21(de3)/pet30a-rmhf1-y的目的蛋白rmhf1占菌体总蛋白的45％，bl21(de3)/pet30a-rmhf1-y表达的目的蛋白rmhf1中63％为可溶性蛋白，37％为不溶性包涵体蛋白。诱导表达的bl21(de3)/pet30a-rmhf1-w的全菌蛋白液体中不含有大小为131kd的目的蛋白rmhf1，说明bl21(de3)/pet30a-rmhf1-w没有表达目的蛋白rmhf1。诱导表达的bl21(de3)/pet30a-rmhf2-y的全菌蛋白液体中不含有大小为131kd的目的蛋白rmhf2，说明bl21(de3)/pet30a-rmhf2-y没有表达目的蛋白rmhf2。诱导表达的大肠杆菌bl21(de3)的全菌蛋白液体不含有大小为131kd的目的蛋白rmhf1和大小为131kd的目的蛋白rmhf2；说明大肠杆菌bl21(de3)没有表达目的蛋白rmhf1和rmhf2(图1)。可见，虽然采用同一种表达载体pet30a(+)和同一种宿主菌大肠杆菌bl21(de3)，不同的外源目的基因的表达情况相差很大，将rmhf1-y基因通过pet30a(+)导入大肠杆菌bl21(de3)可获得rmhf1-y基因的高效可溶性表达，将rmhf1-w基因通过pet30a(+)导入大肠杆菌bl21(de3)中，rmhf1-w基因却没有表达，将rmhf2-y基因通过pet30a(+)导入大肠杆菌bl21(de3)中，rmhf2-y基因也没有表达。另外，按照上述方法，将pet28a(+)的限制性内切酶nhei和noti位点之间的序列替换为seqidno.1第4-3558位所示的rmhf1-y基因，保持pet28a(+)的其它序列不变，得到含有rmhf1-y基因的重组表达载体，将该重组表达载体命名为pet28a-rmhf1-y。将pet28a-rmhf1-y转入大肠杆菌bl21(de3)感受态细胞，将得到的重组大肠杆菌命名为bl21(de3)/pet28a-rmhf1-y。将bl21(de3)/pet28a-rmhf1-y接种于含50μg/ml卡那霉素的lb液体培养基(在lb液体培养基中加入卡那霉素至卡那霉素的浓度为50μg/ml得到的培养基)中，37℃，采用thermomaxq6000型全温振荡器200rpm振荡培养至0d600值(以含50μg/ml卡那霉素的lb液体培养基为空白对照)达到0.6时，加入异丙基硫代-β-d-半乳糖苷(iptg)进行诱导表达。该诱导表达是用0.75mm的iptg在16℃诱导16小时。取诱导表达的发酵液按照上述方法进行蛋白表达形式分析。结果表明，诱导表达的bl21(de3)/pet28a-rmhf1-y全菌蛋白液体中没有目的蛋白的表达。可见，虽然采用同一种外源目的基因(rmhf1-y基因)和同一种宿主菌大肠杆菌bl21(de3)，在不同的bl21(de3)表达载体-pet28a(+)和pet30a(+)中，外源目的基因的表达情况相差很大，将rmhf1-y基因通过pet30a(+)导入大肠杆菌bl21(de3)可获得rmhf1-y基因的高效可溶性表达，将rmhf1-y基因通过pet28a(+)导入大肠杆菌bl21(de3)中，rmhf1-y基因却没有表达。4、rmhf1的可溶性表达及纯化将bl21(de3)/pet30a-rmhf1-y接种于含50μg/ml卡那霉素的lb液体培养基(在lb液体培养基中加入卡那霉素至卡那霉素的浓度为50μg/ml得到的培养基)中，37℃，采用thermomaxq6000型全温振荡器200rpm振荡培养至0d600值(以含50μg/ml卡那霉素的lb液体培养基为空白对照)达到0.6时，加入iptg进行诱导表达。该诱导表达用0.75mm的iptg在16℃诱导16h。取iptg诱导表达16h后的发酵液收集菌体沉淀。加入pbs重悬沉淀，8000rpm/min离心5min，弃掉上清液。向洗涤好的菌体沉淀中加入pbs，高压破碎菌体，裂解至菌液不再粘稠，于4℃离心机中16000rpm/min离心30min，收集上清液(命名为含蛋白上清液)，弃沉淀。将含蛋白上清液用0.22μm滤膜过滤后上样至预先用溶液1(溶质及其浓度如下：20mmtris、150mmnacl，溶剂是水，ph8.0的溶液)平衡好的镍柱。将镍柱接入akta机器上，分别用10个柱体积的溶液1与10个柱体积的溶液2(溶质及其浓度如下：20mmtris、150mmnacl、50mm咪唑，溶剂是水，ph8.0的溶液)清洗镍柱中的杂质蛋白，并在akta机器上监测蛋白峰。用溶液3(溶质及其浓度如下：20mmtris、150mmnacl、300mm咪唑，溶剂是水，ph8.0的溶液)冲洗镍柱挂在镍柱上的目的蛋白，并使用akta收集出现目的蛋白峰的洗脱样品，将该样品称为镍柱纯化的rmhf1蛋白(镍柱纯化目的蛋白样品)。将镍柱纯化的rmhf1蛋白用ge公司生产的superdex200凝胶柱通过分子筛进一步纯化，得到分子筛纯化的rmhf1蛋白。该分子筛纯化中的流动相使用上述溶液1。通过分子筛纯化后可以除去样品中的含有的大量咪唑，rmhf1蛋白的结构为单体结构(图2)。收集单体结构的洗脱峰，得到分子筛纯化的rmhf1蛋白(分子筛纯化目的蛋白样品)，使用nanodrop2000超微量分光光度计(nd2000)对得到的蛋白的纯度进行定量分析。将分子筛纯化的rmhf1蛋白进行质谱分析其氨基酸序列，结果表明rmhf1的氨基酸序列如seqidno.2所示。实施例2、以rmhf1蛋白为包被抗原间接elisa方法检测小反刍兽疫病毒抗体本实施例中的相关溶液如下：浓度为0.01m，ph值为7.4的pbs缓冲液的配制：8.5gnacl、0.2gkcl、2.9gna2hpo4·12h2o、0.59gnah2po4·2h2o，1l去离子水。包被缓冲液：0.05mol/l的碳酸钠-碳酸氢钠缓冲液(ph9.6)，溶剂为水，溶质及其浓度如下：na2co31.59g/l和nahco32.93g/l。洗涤液:0.5％吐温洗涤液。0.5％吐温洗涤液按照如下方法配制：在浓度为0.01m，ph值为7.4的pbs缓冲液中加入吐温20和叠氮化钠至叠氮化钠的含量为5g/l、吐温20的含量为5ml/l，得到0.5％吐温洗涤液。封闭液：1％bsa封闭液。1％bsa封闭液按照如下方法配制：在浓度为0.01m，ph值为7.4的pbs缓冲液中加10％的bsa溶液，稀释至1％(体积百分含量)，得到1％bsa封闭液。二抗稀释液：在浓度为0.01m，ph值为7.4的pbs缓冲液中加入bsa至bsa的含量为1％(体积百分含量)，得到二抗稀释液。1、间接elisa反应条件的建立与优化采用棋盘方阵滴定法确定实施例1中分子筛纯化的rmhf1蛋白(以下简称rmhf1蛋白)最适包被浓度和最佳血清稀释度，以不同浓度的bsa封闭酶标板确定最佳封闭液浓度，确定血清和酶标二抗最佳工作时间，优化酶标二抗工作浓度，判定标准为：阳性血清与阴性血清的od450比值(p/n)最大的孔所对应的反应条件为elisa方法的最佳反应条件。将实施例1中分子筛纯化的rmhf1蛋白梯度稀释后包被酶标板，采用棋盘方阵滴定法确定rmhf1蛋白的包被量和血清稀释度；并在抗原最佳包被浓度和血清稀释度基础上优化elisa检测条件。结果如表1所示，rmhf1蛋白的质量浓度为1.0μg/ml，待测血清稀释倍数为1:20时，p/n值最大，因此确定抗原(rmhf1蛋白)的最佳包被浓度为1.0μg/ml，待测血清稀释倍数为1:20。同时本实验确定hrp标记的兔抗山羊igg按1:20000的比例稀释，37℃作用0.5h，加入tmb显色液10min后od值最佳。表1、elisa检测方法的反应条件优化结果包被的抗原封闭条件待测血清二抗igg-hrp优化稀释度1.0μg/ml1％bsa1:201:20000反应条件4℃/16h37℃/2h37℃/1h37℃/0.5h该步骤确定的以rmhf1蛋白为包被抗原间接elisa方法检测小反刍兽疫病毒抗体的优化实验方法(以下简称重组rmhf1优化间接elisa方法)如下：1.1包被：用包被缓冲液稀释实施例1中分子筛纯化的rmhf1蛋白(以下简称rmhf1蛋白)至rmhf1蛋白的浓度为1.0μg/ml，得到包被原溶液，用该包被原溶液包被实验孔，100μl/孔加至酶标板，4℃孵育16h。1.2洗涤：倾去孔内包被原溶液，用0.5％吐温洗涤液洗涤5次，每次3min；拍干。1.3封闭：加入1％bsa封闭液，100ul/孔，37℃孵育2h。1.4加样：1.4.1样品孔用包被缓冲液将pprv阳性血清稀释20倍，得到待测血清。将100μl待测血清加到酶标板上，37℃反应1h，倾去孔内液体，然后用洗涤液洗涤5次，每次3min。其中，阳性血清为法国id-vet的小反刍兽疫抗体检测试剂盒(idpprcompetition小反刍兽疫抗体检测试剂盒，产品编号为pprc-4p)检测为pprv抗体阳性的羊血清。1.4.2空白对照孔与1.4.1的区别仅在于将待测血清替换为等体积的高纯水，其它步骤不变。1.5加酶标二抗：加入用二抗稀释液进行1:20000稀释的hrp标记兔抗山羊igg，100ul/孔，37℃30min。1.6显色：加入tmb，100ul/孔，反应10min。1.7终止：加入0.2mol/lh2so4溶液终止反应，100ul/孔。1.8测定：用酶标仪读取各孔od450nm数值。2、elisa阴阳性临界值的确定将中国动物疫病预防控制中心草食动物与人畜共患病室保存的1000份经法国id-vet的小反刍兽疫抗体检测试剂盒(idpprcompetition小反刍兽疫抗体检测试剂盒，产品编号为pprc-4p)检测为pprv阴性的羊血清采用步骤1的重组rmhf1优化间接elisa方法(将1.4.1中的pprv阳性血清分别替换为该1000份pprv阴性血清，其它操作相同)进行间接elisa检测，计算该1000份pprv阴性血清的平均值(x)和标准偏差(sd)。判为阳性；判为阴性。结果表明，该1000份pprv阴性血清平均值为0.162，sd为0.053，因此阴阳性临界值为0.321。3、特异性试验利用步骤1的重组rmhf1优化间接elisa方法对10份羊副结核病、羊布病、结核病、产气荚膜梭菌病和口蹄疫阳性血清进行检测，观察与其它疾病有无交叉反应。其中，将1.4.1中的pprv阳性血清分别替换为上述血清，其它操作相同。结果表明该重组rmhf1优化间接elisa方法对几种羊源的病原(羊副结核病、羊布病、结核病、产气荚膜梭菌病和口蹄疫阳性血清)阳性血清进行检测，其od450值分别为：0.169、0.171、0.122、0.194、0.226，均小于临界值0.321，表明rmhf1蛋白与羊副结核病、羊布病、结核病、产气荚膜梭菌病和口蹄疫阳性血清均无交叉反应，步骤1的重组rmhf1优化间接elisa方法具有良好的特异性。4、敏感性试验将步骤1的优化间接elisa方法中的rmhf1替换为重组h蛋白rmh，其它操作不变，建立重组h蛋白rmh优化间接elisa方法。将步骤1的优化间接elisa方法中的rmhf1替换为重组f蛋白rmf，其它操作不变，建立重组f蛋白rmf优化间接elisa方法。其中，上述重组h蛋白rmh按照实施例1步骤4中rmhf1的可溶性表达及纯化方法制备，区别仅在于将进行可溶性诱导表达的重组大肠杆菌由重组大肠杆菌bl21(de3)/pet30a-rmhf1-y替换为重组大肠杆菌bl21(de3)/pet30a-rmh-y。重组大肠杆菌bl21(de3)/pet30a-rmh-y是将pet30a-rmh-y导入大肠杆菌bl21(de3)得到的重组菌。pet30a-rmh-y是用rmh-y替换pet30a(+)的ndei和xhoi识别位点间的片段(包括ndei识别位点和xhoi识别位点在内的小片段)，保持pet30a(+)的其它序列不变，得到的rmh-y基因重组表达载体，命名为pet30a-rmh-y。pet30a-rmh-y含有rmh-y基因，rmh-y基因是将seqidno.1第1852-3555位核苷酸缺失，其它核苷酸不变得到的dna，rmh-y基因编码蛋白质rmh。rmh是将seqidno.3的第617-1184位氨基酸残基缺失其它氨基酸残基不变得到的蛋白质。上述重组f蛋白rmf按照实施例1步骤4中rmhf1的可溶性表达及纯化方法制备，区别仅在于将进行可溶性诱导表达的重组大肠杆菌由重组大肠杆菌bl21(de3)/pet30a-rmhf1-y替换为重组大肠杆菌bl21(de3)/pet30a-rmf-y。重组大肠杆菌bl21(de3)/pet30a-rmf-y是将pet30a-rmf-y导入大肠杆菌bl21(de3)得到的重组菌。pet30a-rmf-y是用rmf-y替换pet30a(+)的ndei和xhoi识别位点间的片段(包括ndei识别位点和xhoi识别位点在内的小片段)，保持pet30a(+)的其它序列不变，得到的rmf-y基因重组表达载体，命名为pet30a-rmf-y。pet30a-rmf-y含有rmf-y基因，rmf-y基因是将seqidno.1第25-1896位核苷酸缺失，其它核苷酸不变得到的dna，rmf-y基因编码蛋白质rmf。rmf是将seqidno.3的第8-631位氨基酸残基缺失其它氨基酸残基不变得到的蛋白质。将经法国id-vet的小反刍兽疫抗体检测试剂盒(idpprcompetition小反刍兽疫抗体检测试剂盒，产品编号为pprc-4p)检测为pprv阳性的羊血清进行倍比稀释，采用步骤1的重组rmhf1优化间接elisa方法进行检测，同时采用重组h蛋白rmh优化间接elisa方法、重组f蛋白rmf优化间接elisa方法和该法国id-vet的小反刍兽疫抗体检测试剂盒作对比，得出阳性临界值时的最大稀释度。结果表明将pprv阳性的羊血清从1：25开始进行倍比稀释，采用步骤1的重组rmhf1优化间接elisa方法进行检测，pprv阳性的羊血清的稀释度为1∶1600时仍呈阳性；采用重组h蛋白rmh优化间接elisa方法进行检测，pprv阳性的羊血清的最大稀释度为1:800；采用重组f蛋白rmf优化间接elisa方法进行检测，pprv阳性的羊血清的最大稀释度为1:800；表明步骤1的重组rmhf1优化间接elisa方法敏感性较好，明显高于重组h蛋白rmh和重组f蛋白rmf作为包被抗原时检测方法的敏感性。5、重复性试验采用步骤1的重组rmhf1优化间接elisa方法对6份羊血清在同批次板和不同批次板上分别进行检测，平行测定5次，计算批内、批间变异系数(cv)。结果显示，批内重复变异系数在2％～8％之间，批间重复变异系数小于9％(表2)。结果表明，步骤1的重组rmhf1优化间接elisa方法具有良好的重复性。表2步骤1的重组rmhf1优化间接elisa方法重复性试验6、符合性试验采用步骤1的重组rmhf1优化间接elisa方法进行检测，同时采用步骤4的重组h蛋白rmh优化间接elisa方法、步骤4的重组f蛋白rmf优化间接elisa方法和法国id-vet的小反刍兽疫抗体检测试剂盒(idpprcompetition小反刍兽疫抗体检测试剂盒，产品编号为pprc-4p)对中国动物疫病预防控制中心草食动物与人畜共患病室保存的500份羊血清进行检测，计算前三者与法国id-vet的小反刍兽疫抗体检测试剂盒的符合率。结果表明采用步骤1的重组rmhf1优化间接elisa方法检测该500份羊血清的阳性率为44.19％；法国id-vet的小反刍兽疫抗体检测试剂盒检测阳性率为42.25％，步骤1的重组rmhf1优化间接elisa方法与法国id-vet的小反刍兽疫抗体检测试剂盒符合率为94.5％。而步骤4的重组h蛋白rmh优化间接elisa方法与法国id-vet的小反刍兽疫抗体检测试剂盒的符合率只有83.3％，步骤4的重组f蛋白rmf优化间接elisa方法与法国id-vet的小反刍兽疫抗体检测试剂盒的符合率只有72.6％。说明将rmhf1-y作为包被抗原建立的间接elisa检测小反刍兽疫病毒抗体的方法与法国id-vet的小反刍兽疫抗体检测试剂盒的符合率显著高于以重组pprvh蛋白rmh作为包被抗原建立的间接elisa检测小反刍兽疫病毒抗体的方法和以重组pprvf蛋白rmf作为包被抗原建立的间接elisa检测小反刍兽疫病毒抗体的方法。<110>中国动物疫病预防控制中心<160>5<170>patentinversion3.5<210>1<211>3564<212>dna<213>人工序列<220><221>cds<222>(4)..(3558)<223><400>1catatgcaccatcaccaccatcacatgagcgcacaacgcgaacgcatcaacgcgttctac60aaagacaacctgcacaacaaaacccatcgcgttatcctggatcgcgaacgtctgacc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