甲氨蝶呤与阿伦磷酸钠偶联物的制备方法与流程

本发明属于有机制药生产技术领域。

背景技术：

甲氨蝶呤（4-氨基-10-甲基叶酸，mtx）是叶酸类似物，甲氨蝶呤于1988年开始用于治疗类风湿关节炎（ra）。而甲氨蝶呤与阿达木单抗等生物制剂联合用药，可以更有效地缓解ra患者的疾病症状，减缓关节损伤的进展（x线显示），并且可以改善身体功能。与传统药物相比，阿达木单抗等生物制剂的疗效强且持久，且耐受性良好。

阿仑膦酸钠（简称：aln）1995年在美国以fosamax的名称上市，用于治疗骨质疏松症和变形性骨炎，1997年5月fda再次批准其预防骨质疏松和预防骨折的扩大适应症，成为第一个被fda批准用于预防骨质疏松症的非激素类药物，阿仑膦酸钠对骨的增重作用类似于雌激素，优于降钙素，能显著增加骨密度，降低骨折发生率，口服有效，作用持久，具有良好的耐受性和较高的安全性。

中国专利文献cn104371009a提供了一种gnrh多肽-甲氨蝶呤偶联物的制备方法，在gnrh多肽或其类似物含有d-lys单元中的氨基的情况下，通过使甲氨蝶呤活性酯与gnrh多肽或其类似物的d-lys上的氨基发生酰胺化反应制备。该发明提供一种含有甲氨蝶呤的药物组合物，增加药物的靶向性，但是，这些现有技术存在原料成本高，工艺制作复杂，操作要求繁琐等问题，因而无法大规模生产。

技术实现要素：

本发明旨在提供一种便于工业化生产的甲氨蝶呤与阿伦磷酸钠偶联物的制备方法。

本发明包括以下步骤：

1）将甲氨蝶呤与氯化亚砜混合加热，进行第一次回流反应，反应结束后，蒸出过量的氯化亚砜，得甲氨蝶呤的酰氯化产物；

2）在二氯甲烷存在下，将所述甲氨蝶呤的酰氯化产物与阿仑膦酸钠混和加热，进行第二次回流反应，反应结束后，蒸出二氯甲烷，即得纳米级甲氨蝶呤与阿伦磷酸钠偶联物。

通过以上步骤1），甲氨蝶呤分子上的羧基被氯化亚砜取代为酰氯，进而与步骤2）中阿仑膦酸钠分子上的氨基形成目标分子酰胺。

通过本发明以上方法，制得的甲氨蝶呤与阿伦磷酸钠偶联物为纳米级，这种偶联物可以获得一种新型骨科靶向药物，使得药物能够向骨科病炤部位富集，从而达到更好的治疗效果。

进一步地，本发明所述甲氨蝶呤与氯化亚砜的投料摩尔比为1∶2～4。过量的氯化亚砜有利于将甲氨蝶呤上的羧基酰化地更彻底。

所述甲氨蝶呤与阿仑膦酸钠的投料摩尔比为1∶1。该投料比节约原料，可控制甲氨蝶呤与阿仑膦酸钠按1∶1的比例耦合。

附图说明

图1为本发明的反应式。

图2为甲氨蝶呤、阿伦磷酸钠和制成的偶联物的红外表征对比图谱。

图3为甲氨蝶呤、阿伦磷酸钠和制成的偶联物的uv-vis对比图谱。

图4为甲氨蝶呤的核磁共振氢谱。

图5为阿伦磷酸钠的核磁共振氢谱。

图6为甲氨蝶呤与阿伦磷酸钠偶联物的核磁共振氢谱。

图7为通过trap染色，纯水（0毫摩尔每升甲氨蝶呤和阿仑膦酸盐的耦合物）对于破骨细胞分化的抑制作用的效果图。

图8为通过trap染色，0.2毫摩尔每升甲氨蝶呤和阿仑膦酸盐的耦合物对于破骨细胞分化的抑制作用的效果图。

图9为通过trap染色，0.4毫摩尔每升甲氨蝶呤和阿仑膦酸盐的耦合物对于破骨细胞分化的抑制作用的效果图。

图10为通过trap染色，0.8毫摩尔每升甲氨蝶呤和阿仑膦酸盐的耦合物对于破骨细胞分化的抑制作用的效果图。

图11为甲氨蝶呤-阿仑膦酸盐偶联物在二型胶原诱导的大鼠类风湿关节炎模型中，通过影像学microct的方法展示对脚部关节的骨质破坏及骨质溶解的治疗作用效果图。

图12为甲氨蝶呤-阿仑膦酸盐偶联物在二型胶原诱导的大鼠类风湿关节炎模型中，通过组织学trap染色的方法展示对脚部关节的骨质破坏及骨质溶解的治疗作用效果图。

具体实施方式

一、制备工艺：

例1：

取甲氨蝶呤3.41g与氯化亚砜1.785g于圆底烧瓶中，加热至70℃进行回流反应4小时。反应结束后，改回流装置为减压蒸馏装置，蒸出过量的氯化亚砜，取得3.52g甲氨蝶呤的酰氯化产物。

以50ml二氯甲烷作为溶剂，将3.52g甲氨蝶呤的酰氯化产物与甲氨蝶呤等摩尔量的阿仑膦酸钠2.44g混合，加热至70℃进行回流反应4小时。反应结束后，再次改回流装置为减压蒸馏装置，蒸出二氯甲烷，即得5.09g目标产物。

图5为甲氨蝶呤的核磁共振氢谱。图6为阿伦磷酸钠的核磁共振氢谱。图7为甲氨蝶呤与阿伦磷酸钠偶联物的核磁共振氢谱。

可以看出在样品在2.89和1.87ppm出现信号，证明阿伦磷酸钠修饰了甲氨蝶呤。

例2：

取甲氨蝶呤0.682g与氯化亚砜0.357g于圆底烧瓶中，加热至70℃进行回流反应4小时。反应结束后，改回流装置为减压蒸馏装置，蒸出过量的氯化亚砜，取得0.697g甲氨蝶呤的酰氯化产物。

以20ml二氯甲烷作为溶剂，将0.697g甲氨蝶呤的酰氯化产物与甲氨蝶呤等摩尔量的阿仑膦酸钠0.488g混合，加热至70℃进行回流反应4小时。反应结束后，再次改回流装置为减压蒸馏装置，蒸出二氯甲烷，即得0.988g目标产物。

以上两例的反应过程如图1所示。

二、产物验证：

1、图2为例1方法所得样品与甲氨蝶呤和阿伦磷酸钠纯样对比的红外表征图谱。其中曲线a为甲氨蝶呤（mtx）的红外表征图谱；曲线b（aln）为阿伦磷酸钠的红外表征图谱；曲线c为例1制得的目标产物的红外表征图谱。

由图2的曲线c可以发现：在1569和1724cm^-1处发现酰胺-nh弯曲，从而推断出：例1所得的目标产物中甲氨蝶呤确实连接上了阿伦磷酸钠，例1得到了甲氨蝶呤与阿伦磷酸钠偶联物。

2、图3为例2方法所得样品与甲氨蝶呤和阿伦磷酸钠纯样对比的uv-vis表征结果，其中曲线a为甲氨蝶呤（mtx）的uv-vis表征图；曲线b（aln）为阿伦磷酸钠的uv-vis表征图；曲线c为例1制得的目标产物的uv-vis表征图。

由图3可见：阿伦磷酸钠纯样没有出现信号，而实施方案2所得样品出现了甲氨蝶呤的特征峰，可以推断出甲氨蝶呤确实偶联上了阿伦磷酸钠。

3、由图4的甲氨蝶呤的核磁共振氢谱可见：化学位移7～9ppm左右的峰为芳环的特征峰，为原料甲氨蝶呤独有。

4、由图5的阿伦磷酸钠的核磁共振氢谱可见：化学位移4.9ppm左右是磷酸的氢的出峰位置，为原料阿仑膦酸钠独有。

5、由图6的以上两例制成的目标产物——甲氨蝶呤与阿伦磷酸钠偶联物的核磁共振氢谱可见：目标产物在4.9ppm、7.8ppm和8.4ppm出现信号，证明阿伦磷酸钠修饰了甲氨蝶呤。

6、在体外，将甲氨蝶呤、阿仑膦酸盐和本发明制成的目标产物分别对骨髓来源巨噬细胞向破骨细胞分化进行抑制试验，通过trap染色，试验验证了甲氨蝶呤和阿仑膦酸盐的耦合物相比甲氨蝶呤和阿仑膦酸盐单独使用时的抑制结果。

本发明制成的目标产物对骨髓来源巨噬细胞向破骨细胞分化进行抑制试验结果如图7至10所示，由图7至10可以看出：本发明制成的耦合物对于破骨细胞分化的抑制作用更加明显，且浓度更低，达到了良好的低剂量药物抑制破骨细胞分化的效益。

7、通过影像学microct和组织学trap染色的方法，将本发明制成的目标产物作用于大鼠的类风湿关节炎模型中进行试验。

结果见图11、12，图11和图12显示了是在大鼠的类风湿关节炎模型中，甲氨蝶呤和阿仑膦酸盐的两者的耦合的药效应当是强于单独使用两者其中之一，并且耦合物在使用时，可以降低药物的使用剂量。