水稻柱头外露率主效QTL及其定位方法与流程

本发明涉及分子生物学领域，特别是涉及水稻柱头外露率主效qtl及其定位方法。

背景技术：

水稻是全球最为重要的粮食作物，解决了全球超过半数人口的口粮问题。在全球大纬度、多环境下均可种植。种植杂交水稻被认为是解决全球不断增长的人口问题以及由此而引发的粮食短缺问题的有效策略。

柱头外露是影响水稻异交结实率的主要因子之一。水稻开花期间，多种环境因子对柱头外露均有所影响，例如风、温度、湿度、机械损伤等等。外露的柱头大约能保持6天，平均每天减少20％左右。因此，不管单柱头外露率还是双柱头外露率都和其他开花性状一样，在杂交稻制种过程中受到育种家以及育种科研者的持续关注。

由于栽培稻是严格的自交作物并且花期性状都不利于异交结实，因此在杂交稻制种过程中，要想办法通过改变两亲本的表型性状来提高天然的异交结实率。杂交稻制种过程中父母本的选择会因为各自目标性状的不同而选择不同。杂交稻中父本的选择会倾向于在杂交过程中具有高产量潜力的品种，而另一方面，母本的表型性状选择则会倾向于雄性不育性状。通过应用遗传雄性不育即光温敏核不育，目前在水稻生产上已得到成功运用。但作为育种家，仍需考虑影响杂交稻制种产量的诸多表型性状，例如水稻柱头外露率就是最重要的影响因子之一。具有更高柱头外露率的母本不仅可以从父本获取更多花粉，而且可以更容易越过父母本之间的开花异步(非同步化)障碍。

到目前为止，在水稻中已经定位到了多个柱头外露相关的qtl，并且在水稻全部12条染色体上都有分布。基于水稻种间以及种内多次杂交独立试验均检测到了与开花习性相关性状的数量性状位点(qtls)，染色体3、4、6、8、11和12上共检测到了9个控制柱头外露的qtl(yamamoto,t.,takemori,n.,sue,n.,nitta,n.(2003).qtlanalysisofstigmaexertioninrice.ricegenetnewsl20,33-34)。通过籼稻栽培稻peikuh和野生稻w1944杂交衍生而来的重组自交系(ril)群体，在第5和第10染色体上分别定位到了1个控制柱头外露的qtl(ugay,fukutay,caihw,iwatah,ohsawar,morishimah,fujimurat.2003.mappingqtlsinfluencingricefloralmorphologyusingrecombinantinbredlinesderivedfromacrossbetweenoryzasatival.andoryzarufipogongriff.theoreticalandappliedgenetics,107,218-226.doi:10.1007/s00122-003-1227-y.)。

rahman(mdhabiburrahman,yingxinzhang,lianpingsun,keqinzhang,md.sazzadurrahman,weixunwu，xiaodengzhan,liyongcao,shihuacheng.2016.geneticmappingofquantitativetraitlociforthestigmaexsertionrateinrice(oryzasatival).journalofintegrativeagriculture2017,16(0):1-10.)等利用一个来自于协青早b和中恢9308配组而成的134株系的重组自交系(ril)群体，定位柱头外露qtl以及每穗粒数的qtl，结果显示，在染色体1、6、10和11上共定位到了8个qtl。一些研究者通过表型以及基因型鉴定，在7号染色体上定位到了2个控制柱头外露率qtls的聚集区(yan,w.g.,li,y.,agrama,h.a.,luo,d.,gao,f.,lu,x.,ren,g.(2009).associationmappingofstigmaandspikeletcharacteristicsinrice(oryzasatival.).molbreed.24,277-292.http://dx.doi.org/10.1007/s11032-009-9290-y)，另一些学者则在第7染色体上定位到了一个控制柱头外露的qtl簇集区(louj,yuegh,yangwq,meihw,luolj,luhj.2014.mappingqtlsinfluencingstigmaexertioninrice.bulgarianjournalofagriculturalscience,20,1450-1456.)。

技术实现要素：

本发明提供一种水稻柱头外露率主效qtl。所述的主效qtl被定位于第7染色体上，位于分子标记rm5436-rm5499之间约1000kb物理距离上。

所述分子标记rm5436的引物为：上游引物tgagctgcacaagacagacaagc(seqidno.1所示)，下游引物accatttgaacaggatggactgg(seqidno.2所示)；所述分子标记rm5499的引物为：上游引物ggacgaaagggtatttgattgg(seqidno.5所示)，下游引物cctcaaggtggtctccttctcc(seqidno.6所示)。

本发明还提供所述的水稻柱头外露率主效qtl的定位方法，包括以下步骤：a.以协青早b为供体亲本，以中恢9308为受体亲本和轮回亲本，通过连续回交以及自交，最终在bc4f8代构建得到染色体片段代换系

cl-51，将所述代换系cl-51与中恢9308杂交，获得f1杂交种，自交后获得f2分离群体；b.考察f2分离群体的柱头外露率相关表型数据；c.开发分子标记并筛选出具有多态性的引物，再利用f2分离群体构建遗传连锁图谱；d.利用遗传连锁图谱，结合表型数据进行qtl分析，定位出所述柱头外露率主效qtl。

具体地，所述步骤b中的表型数据以及步骤c中遗传连锁图谱的作图群体来自于从所述代换系cl-51的4000株f2群体中随机选取的300株水稻植株。

具体地，所述步骤b中柱头外露率相关表型数据包括单柱头外露率、双柱头外露率和总柱头外露率。

具体地，所述步骤b中柱头外露率的表型数据是通过采集水稻植株的主穗样本后测算获得的，所述主穗样本在开花6-7天且等到主穗最底部也开花2-3天后进行采集。

由于采用上述技术方案，本发明至少具有以下优点：

本发明通过qtl定位将一种水稻柱头外露率主效qtl定位于第7染色体上标记rm5436-rm5499之间约1000kb物理距离上，上述主效qtl的区域在以往有关柱头外露的研究中从未见报道过，因此可以认为是发现了一个新基因。本发明的定位成果为今后精细定位及基因克隆提供了研究基础。

由于水稻育种上高的柱头外露率可明显提高杂交结实率，因此，通过开发该主效qtl紧密连锁的分子标记，来检测水稻品种或品系中是否具有柱头外露率相关qtl，可加快水稻优异品种的选育进程。例如，将来该主效qtl含有的新基因可通过mas手段育成带有遗传改良性质的细胞质雄性不育系，通过提高其柱头外露率来提升异交结实率，进而进一步增加杂交稻的制种效率。

附图说明

上述仅是本发明技术方案的概述，为了能够更清楚了解本发明的技术手段，以下结合附图与具体实施方式对本发明作进一步的详细说明。

图1是水稻柱头外露率主效qtl定位方法中遗传材料构建流程图。

图2是移栽80天后亲本表型性状图。其中(a)为中恢9308，(b)为cl-51，(c)为协青早b。

图3是f2群体柱头外露率的分布图。其中(a)为单柱头外露率，(b)为双柱头外露率，(c)为总柱头外露率。

图4是第7染色体上qpsse-7的遗传连锁分析，黑色箭头表示qpsse-7所在位置。

图5是用4000作图群体对qpsse-7所做的精细定位，黑色水平线下的数字代表标记和基因之间的重组子个数。

具体实施方式

本发明研究了一个在7号染色体上含有供体亲本(即协青早b)插入片段的染色体片段代换系(cssl-51)，而供体亲本(协青早b)可明显提升柱头外露的水平。初级qtl检测共定位了3个与开花习性相关的性状，包括psse(单柱头外露率)、pdse(双柱头外露率)以及ptse(总柱头外露率)，cl-51来自于亲本协青早b和中恢9308，协青早b具有高柱头外露率，而中恢9308柱头外露率则更低。结果，我们检测到了一个主效qtl并把它定位于第7染色体上的一个小区域内(按命名规则将之命名为qpsse-7)，并大胆推测该qtl同时控制psse以及pdse。

以下通过具体的实施例对本发明进行说明，应当理解，此处所描述的实施例仅用于说明和解释本发明，并不用于限定本发明。并且以下实施例中所涉及的药品或试剂，如无特殊说明，均能够通过正常商业途径进行购买。以下实施例中所涉及实验技术或操作方法，如无特殊说明，均为本领域已知的常规实验技术或操作方法。

1.1试验材料以及田间试验

如图1所示，通过协青早b与中恢9308配组，协青早b是具有高柱头外露率的母本保持系，中恢9308则是低柱头外露率的恢复系，利用这两者配组构建rils，并用此群体与中恢9308回交、再自交，发展成bc1f1，再回交、自交形成bc2f2……直至形成bc4f8，最终得到了75株系的cssls群体(染色体片段代换系群体)。本研究利用其中的一个株系(cl-51)来进行控制柱头外露率qtl的遗传定位，此株系第7染色体目标区段含来自于协青早b的插入片段。最终将含有qpsse-7的区间缩小至1000kb左右，介于rm5436和rm5499之间。

cssls的f2群体2015年12月10日种植于海南岛陵水，f2-3则与2016年6月15日种植于浙江省杭州市的中国水稻研究所试验田内。每株系种6行，每行种8株，30×20cm的行间距，标准田间管理。

1.2性状检测

共检测了柱头外露率的3个性状值：单柱头外露率psse、双柱头外露率pdse以及总柱头外露率ptse。开花6-7天后，亲本以及群体中每行每植株取3个主穗进行分别取样，等到主穗最底部也开花2-3天后开始取样，用于测算柱头外露率值。

柱头外露率值用以下公式计算：

单柱头外露率(％)＝[单柱头外露率/(单柱头外露率+双柱头外露率+无柱头外露率)]×100；

双柱头外露率(％)＝[双柱头外露率/(单柱头外露率+双柱头外露率+无柱头外露率)]×100；

总柱头外露率(％)＝[总柱头外露率/(单柱头外露率+双柱头外露率+无柱头外露率)]×100。

1.3dna提取以及pcr产物分析

参照娄等的方法(lou,q.j.,l.chenandl.j.luo,2005.comparisonofthreerapidmethodsofdnaextractionfromrice.molecularplantbreeding,3:749-752.)，用ctab法分别提取f2群体及其亲本新鲜叶片的总dna。提取后的总dna溶于te缓冲液中，并用du640核酸蛋白分析仪(贝克曼计算公司)进行质量及浓度分析。所有dna样品用超纯水稀释至25ng/μl，-20℃保存用于pcr检测。

参照娄等(lou,q.j.,l.chenandl.j.luo,2005.comparisonofthreerapidmethodsofdnaextractionfromrice.molecularplantbreeding,3:749-752.)的方法在pcr热循环仪(美国费希尔科技公司生产)上进行pcr反应。

所得产物在8％变性聚丙烯酰胺凝胶上跑胶，并用银染法染色检测。

1.4开发新标记

我们在先的研究利用cssl群体在第7染色体上rm5436和rm5875之间定位了一个控制水稻柱头外露的qtl。此qtl在我们先前的初定位工作中被定位于第7染色体ssr标记rm5436和rm5875之间(图4)。

具体地，先前的初定位工作中，通过在bc4f8代换系cl-51的4000株f2群体中随机选取300株水稻植株，考察基因型和表型数据，利用作图软件windowsqtlcartographerv2.5(wangs,bastencj,zengzb(2012)windowsqtlcartographer2.5.departmentofstatistics.available:http://statgen.ncsu.edu/qtlcart/wqtlcart.htm.)处理计算相应数据,lod值取2.0，计算所得数据显示此处存在qtl，并得到相应表型变异等数据。用了9个ssr标记和1个indel标记检测到包含qpsse-7的区段位于rm5436-rm5875之间。其中，分子标记rm5436的引物为：上游引物tgagctgcacaagacagacaagc(seqidno.1所示)，下游引物accatttgaacaggatggactgg(seqidno.2所示)；分子标记rm5875的上游引物为：aataaagcgagatggacgaacc(seqidno.3所示)，下游引物为：tttcccaccagaggaagatgg(seqidno.4所示)。

在进一步地研究中，我们在qtl初定位区间rm5436和rm5875之间发掘ssr新标记(http://www.gramene.org/)。参照文献(mccouchsr.2002.developmentandmappingof2240newssrmarkersforrice(oryzasatival.).naturednaresearch9:199–207(2002).)，每隔上一段物理距离合成3-4对ssr引物，在亲本协青早b和中恢9308之间筛多态，筛到多态的ssr标记则可直接应用于该群体。

新开发的ssr标记均在擎科生物技术公司合成。

1.5目标区段的精细定位及其验证

定位了目标区间之后，结合新开发标记的杂合子以及目标基因座位的信息，最终锚定了目标基因区间以及与之连锁的分子标记信息。

从整个群体的所有4000株植株中，随机选取300株作为对初期定位结果的验证以及目标区间的尽可能缩短。为验证此区间，我们总共在rm5476和rm5875之间检测了58对新ssr引物。这些引物中仅有8对引物在父母亲本间呈现多态性。因此我们在这300个随机植株中应用了此8个多态性标记建立了连锁图，结合基因型及表型数据做了qtl的初定位。用软件windowsqtlcartographerv2.5计算，lod值取2.0。

2结果

2.1cssl群体及其父母本的柱头外露率

cssl群体父母本的柱头外露率为：p-51(cl-51亲本)具低柱头外露率，为6.24％，而中恢9308柱头外露率则更高，为11.07％。协青早b则具有明显更高的柱头外露率，为36.8％(表1，图2)。为何此cl-51亲本相对父本材料中恢9308而言，其柱头外露率反而更低？我们大胆推测，该区间含有控制水稻柱头外露率qtl的染色体片段来自于协青早b，且具有负向调控作用，降低了植株的柱头外露率，能有效降低柱头外露率高达43.63％。f2群体所有柱头外露率的性状表型值分布图示于图3。

表1.cssl群体亲本的柱头外露性状数据

注：表中xqzb指协青早b，zh9308指中恢9308，p-51指cl-51亲本。

2.2缩小qtlqpsse-7区间

qpsse-7的遗传分析及其精细定位。

结合表型数据，将包含qpsse-7的染色体区段进一步定位于rm5436到indel103之间，可解释1.51％的表型变异。最终通过进一步分析群体杂合子数据，包含qpsse-7的染色体区段被进一步定位于rm5436和rm5499之间，大约涵盖1000kb物理距离。所述分子标记rm5499的引物为：上游引物ggacgaaagggtatttgattgg(seqidno.5所示)，下游引物cctcaaggtggtctccttctcc(seqidno.6所示)。

为缩小qpsse-7区间，我们共检测了58对ssr引物，其中仅有8对引物在cl-51两亲本间显示多态性。引物检测结果显示于表2中(表2中ind103是indel，即插入缺失标记)。

表2.用于进一步缩短qpsse-7区间所使用的引物

注：表中rm5499、rm21360、rm542、rm214、ind103、rm21470、rm6449、rm5543的上下游引物分别对应序列表中seqidno.5和no.6，seqidno.7和no.8，seqidno.9和no.10，seqidno.11和no.12，seqidno.13和no.14，seqidno.15和no.16，seqidno.17和no.18，seqidno.19和no.20所示。

从cl-51的4000株群体中随机选取300株，并用带有多态性的上述8个标记进行监测，结合表型数据，在第7染色体区段上定位到了一个控制柱头外露率的qtl(图4)，命名为qpsse-7，具有1.82％的显性效应，并可解释1.51％的表型变异，增效等位基因来自于协青早b，可降低43.63％的柱头外露率值。包含此位点qpsse-7的物理距离约为1000kb，介于rm5436和rm5499之间。

结合300个随机选取植株的表型及基因型数据。卡方检测显示单柱头外露率的分离比符合孟德尔因子3：1的分离比(x²＝0.25＜x²0.05＝3.19)(图4)。

将ssr标记rm5436和rm5875应用于cl-51的4000群体植株中，结果检测出了95个杂合子。进一步应用新开发的8个ssr标记，我们发现越来越少的杂合子个数，诸如65、63、58以及38个(图5)。

综上所述，本发明利用一个次级分离群体，对先前已检测到的柱头外露率主效qtl进行进一步的遗传定位。该次级分离群体供体亲本为协青早b，受体亲本为中恢9308，群体由134个自交株系组成，并且不断回交、自交，最终衍生而成bc4f8，仅在目标区段杂合。

在先前的研究中，用了9个ssr标记和1个indel标记检测到包含qpsse-7的区段位于rm5436-rm5875之间。结合表型数据，包含qpsse-7的染色体区段进一步定位于rm5436到indel103之间，可解释1.51％的表型变异。在本研究中，通过进一步分析群体杂合子数据，包含qpsse-7的染色体区段被进一步定位于rm5436和rm5499之间，大约涵盖1000kb物理距离。

3、讨论

通过研究，我们在第7染色体上定位到了一个控制柱头外露率的qtl。利用cl-51群体，将包含此qtl的区间进一步缩小定位并命名为qpsse-7。此前从未报道过此区间，因此可认为该区间包含新基因。我们将包含此qpsse-7的区域定位于约1000kb左右的物理距离上。众所周知，水稻外露的柱头非常脆弱，在开花期间极易受环境所影响，例如温度、风、水压以及物理折损等等。本研究中，我们在以往的研究基础之上对柱头外露的测量方法进行了一系列的改进。一些学者的研究中，集中于开花期收集主穗，以避免外露的柱头遭遇不测并保证数据的准确性，然而另一些学者则倾向于在抽穗7-10天后就收集主穗。尽管外露的柱头非常脆弱，但直至灌浆前，雌蕊形状还是保持不变的。在我们以往的研究中，通常于大约开花6天左右收集父母本的3个主穗以及cssl群体每行每株系的3个主穗以做记录。本发明中，我们采用在开花6-7天，且等到主穗最底部也开花2-3天后选取主穗样本。

水稻中有关sse、dse以及tse的qtl研究都有报道。在一些研究中(liwh,donggj,huxm,tengs,guolb,zhengdl,qianq.2003.qtlanalysisforpercentageofexertedstigmainrice(oryzasatival.).yichuanxuebao,30,637-640)，第2和第3染色体上共发现了5个qtl；1、2、5和8号染色体上报道发现了9个qtl；1、5、6、7、8、9、10和11染色体上发现了15个qtl，其中第7染色体上发现的3个qtl分别是控制柱头长/宽比、双柱头外露率以及总柱头外露率的。控制水稻柱头长宽比的qtl与rm118连锁，另两个控制双柱头外露率以及总柱头外露率的qtl与rm455连锁，在第7染色体底部物理距离为22298054bp的位置，与本研究中包含qpsse-7位点的区间距离非常遥远。li等(lip,fengf,zhangq,chaoy,gaog,hey.2014.geneticmappingandvalidationofquantitativetraitlociforstigmaexertionrateinrice.molecularbreeding,34,2131-2138.http://dx.doi.org/10.1007/s11032-014-0168-2)在染色体1、3、6、7、9、10和12上共检测到11个qtl。在这些qtl中，li将在第7染色体上定位到的qtl命名为qsse-7，其位置在第7染色体的底部，与yan等人(yan,w.g.,li,y.,agrama,h.a.,luo,d.,gao,f.,lu,x.,ren,g.(2009).associationmappingofstigmaandspikeletcharacteristicsinrice(oryzasatival.).molbreed.24,277-292.http://dx.doi.org/10.1007/s11032-009-9290-y)发现的qtl位置接近。lou等人(louj,yuegh,yangwq,meihw,luolj,luhj.2014.mappingqtlsinfluencingstigmaexertioninrice.bulgarianjournalofagriculturalscience,20,1450-1456；lip,fengf,zhangq,chaoy,gaog,hey.2014.geneticmappingandvalidationofquantitativetraitlociforstigmaexertionrateinrice.molecularbreeding,34,2131-2138.)发现的qtl位置距离此区间不很近，在第7染色体上19530534bp处，同样也距离本研究中的qpsse-7位置非常遥远，本研究所涉及的区域在以往报道中从未提及，因此可认为qpsse-7是个新基因。

在以往研究中，人们往往将具有较大效应的qtl作为数量性状遗传改良的重要资源。本研究中，我们在第7染色体上定位到一个基因簇，并利用cl-51群体，将此区域精细定位于标记rm5436和rm5499之间，覆盖大约1000kb。qpsse-7、qpdse-7和qptse-7是紧密连锁的qtl，假设此3个qtl能结合在一起那么就可以同时提升sse、dse以及tse，从而提高杂交稻的制种潜力。水稻中双柱头相比较于单柱头而言，两者一样重要，即dse和sse一样，在水稻杂交稻制种中起到非常重要的作用，可以提升制种的异交结实潜力。sse、dse和tse三者具有极显著正相关。

本研究中qpsse-7来自于协青早b，具有负向效应，能降低sse达43.63％。协青早b的单柱头外露率要显著高于中恢9308，这一现象的原因是这是协青早b上所有12条染色体基因位点共同综合协同作用的结果。尽管协青早b上所有基因位点共同综合作用的结果是正向的，但qpsse-7位点是负向效应。因此，对育种家而言，可以通过mas(分子标记辅助育种)手段避免使用协青早b第7染色体上qpsse-7区段的位置，进而在育种实践中通过提升柱头外露率有效提高杂交稻的育种产量潜力。

4、结论：

本研究中，我们利用cl-51在第7染色体上定位到了一个qtl，将其命名为qpsse-7，并定位于标记rm5436和rm5499之间约1000kb的物理距离内。此区域在以往有关柱头外露的研究中从未见报道过，因此可以认为是发现了一个新基因。水稻育种上高的柱头外露率可明显提高杂交结实率。因此，将来可通过mas手段育成带有遗传改良性质的cms(细胞质雄性不育系)，通过提高其柱头外露率来提升异交结实率，进而进一步增加杂交稻的制种效率。此研究将qpsse-7精细定位于第7染色体上约320kb物理距离的位置，并为将来进一步利用mas手段遗传改良新作物以及克隆等后续工作提供依据。伴随杂交稻育种高新技术的不断发展，通过提升cms的柱头外露率来提高杂交稻制种效率的技术策略将在未来杂交稻育种工作中得到越来越广泛的应用。

以上所述，仅是本发明的较佳实施例而已，并非对本发明作任何形式上的限制，本领域技术人员利用上述揭示的技术内容做出些许简单修改、等同变化或修饰，均落在本发明的保护范围内。

sequencelisting

<110>中国水稻研究所

<120>水稻柱头外露率主效qtl及其定位方法

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