一种抗菌复合细菌纤维素膜的制备方法与流程

本发明涉及一种抗菌复合细菌纤维素膜的制备方法。

背景技术：

细菌纤维素(bacterialcellulose，简称bc)是由d-吡喃葡萄糖以β-1，4糖苷键连接而成的多糖，又称β-1，4葡聚糖。目前能够合成细菌纤维素的微生物有以下9个属：醋酸菌属(acetobacter)、固氮菌属(azotobacter)、无色杆菌属(achromobacter)、气杆菌属(aerobacter)、八叠球菌属(sarcina)、土壤杆菌属(agrobacterium)、产碱杆菌属(alcaligcncs)、根瘤菌属(rhizobium)、假单胞杆菌属(pseudomonas)。其中，木醋杆菌(gluconacetobacterxylinus)是目前人们在实验及生产中研究最为普遍的，而且它是应用到生产细菌纤维素最多的一种菌属。细菌纤维素由于其较好的持水性、机械强度、生物适应性、可降解性等特征，现已在各个领域中广泛应用。在商业领域的相关产品有轮胎、音响振动膜、面膜、减肥食品、纺织品；在医学领域可用作人造皮肤或者血管材料、支架材料、医疗垫、牙体材料。

壳聚糖是一类带氨基的纤维素，化学名为(1,4)-2-氨基-2-脱氧-β-d-葡聚糖，也被成为动物纤维素。羧甲基壳聚糖是一种水溶性壳聚糖衍生物。二者均具有较强的抗菌特性，但不具备吸液储液性能。此外，细菌纤维素由于没有抗微生物性质，细菌纤维素并不能防止伤口的感染，影响伤口的痊愈和愈后质量。

技术实现要素：

为了解决现有技术中存在的问题，本发明提供一种抗菌复合细菌纤维素膜的制备方法，克服现有技术中细菌纤维素并不能防止伤口的感染，影响伤口的痊愈和愈后质量的问题。

本发明的技术方案是：一种抗菌复合细菌纤维素膜的制备方法，包括如下步骤：

1)将木醋杆菌(gluconacetobacterxylinus)tju-s8接种于新鲜培养基中，30℃，静置培养7d，得到细菌纤维素膜；

2)用去离子水反复洗涤细菌纤维素膜，去除表面杂质及培养基；

3)将清洗后的细菌纤维素膜浸泡在naoh溶液中，80℃恒温水浴2h，去除细菌纤维素膜中残留的培养基及菌体，再次用去离子水洗涤，直至中性；

4)将处理后的细菌纤维素面膜进行干燥；

5)将干燥的细菌纤维素膜裁剪成圆形，于壳聚糖/羧甲基壳聚糖溶液中室温浸泡，得到抗菌复合细菌纤维素膜。

在步骤1)中，所述木醋杆菌(gluconacetobacterxylinus)tju-s8产细菌纤维素培养条件为葡萄糖20g/l，酵母膏10g/l，蛋白胨7g/l，磷酸氢二钠7.5g/l，柠檬酸0.5g/l，静置培养7d。细菌纤维素膜成型，呈浅褐色，有一定厚度并且质地柔韧，呈凝胶状，透明度较低。

在步骤2)中，所述用去离子水反复洗涤细菌纤维素膜，去除表面杂质及培养基。此时细菌纤维素表面光滑，颜色变浅。

在步骤3)中，所述细菌纤维素膜浸泡在0.1mol/l的naoh溶液中，80℃恒温水浴2h，再次用去离子水洗涤，直至中性。此时细菌纤维素表面光滑，呈乳白色半透明凝胶状。

在步骤4)中，所述将处理后的细菌纤维素面膜进行真空冷冻干燥。此时，膜质地相对更加均匀，结构较为疏松，呈白色膜状，厚度较大。

在步骤5)中，所述将干燥的细菌纤维素膜裁剪成直径为10mm的圆形，于0.6％壳聚糖/羧甲基壳聚糖溶液中室温浸泡，得到细菌纤维素复合膜。此时，膜表面不平整，分层并且多孔。

步骤5)后还包括两个步骤：

6)抗菌复合细菌纤维素复合膜结构和形貌观察；

7)抗菌复合细菌纤维素复合膜抗菌特性研究。

在步骤6)中，所述利用采用扫描电镜、傅里叶红外色谱、x-射线衍射观察细菌纤维素复合膜结构和形貌。此时，细菌纤维素膜呈超微细网状结构，孔隙均匀分布，加入壳聚糖/羧甲基壳聚糖并未改变其纤维网状结构。

在步骤7)中，所述细菌纤维素复合膜抗菌特性研究，发现细菌纤维素复合膜对大肠杆菌、金黄色葡萄球菌均表现出良好的抗性。

本发明的有益效果是：本发明通过现代分离纯化技术得到细菌纤维素膜，并制备细菌纤维素复合膜，研究其结构特性及抗菌性能。经过系列实验验证，说明所获的细菌纤维素复合膜具有纤维素的特性，在适宜条件下，产生高透明度、质地柔韧细菌纤维素，并且可以有效抑制大肠杆菌、金黄色葡萄球菌的生长。因此，利用木醋杆菌(gluconacetobacterxylinus)tju-s8产生的细菌纤维素膜制备成抗菌复合膜，具有绿色环保、简单易行、成本低廉、抗菌效果好等优点。

附图说明

图1细菌纤维素膜的扫描电镜结果；其中a为纯细菌纤维素素膜放大5000倍；b为纯细菌纤维素素膜放大20000倍；c为壳聚糖纤维素膜放大50倍；d为壳聚糖纤维素膜放大20000倍；e为羧甲基壳聚糖纤维放大50倍；f为羧甲基壳聚糖纤维放大20000倍；

图2抗菌复合细菌纤维素膜的红外谱图；

图3抗菌复合细菌纤维素膜的x-射线衍射图；

图4抗菌复合细菌纤维素膜的抗菌性能结果；其中a为壳聚糖对大肠杆菌(escherichiacoli)的抑菌效果；b为羧甲基壳聚糖对大肠杆菌(escherichiacoli)的抑菌效果；c为壳聚糖对金黄色葡萄球菌(staphylococcusaureus)的抑菌效果，d为羧甲基壳聚糖对金黄色葡萄球菌(staphylococcusaureus)的抑菌效果。

具体实施方式

下面结合附图和具体实施方式对本发明进行详细描述。

实施例1：细菌纤维素膜的发酵与处理

1)培养基

种子培养基：葡萄糖10g，酵母膏10g，蒸馏水1000ml，115℃灭菌20min，冷却至50℃左右时加入无水乙醇3％(v/v)。

发酵培养基：葡萄糖20g，酵母膏10g，蛋白胨7g，磷酸氢二钠7.5g，柠檬酸0.5g，蒸馏水1000ml，115℃灭菌20min。

2)木醋杆菌纤维素发酵

用与斜面中挑取木醋杆菌(gluconacetobacterxylinus)tju-s8接于100ml种子培养基中，30℃，120r/min振荡培养18h，制备种子液。

将种子液按照10％的比例接入发酵培养基中，30℃静置培养7d，得到细菌纤维素膜。

3)细菌纤维素的提取

用去离子水反复洗涤细菌纤维素，除去表面的杂质和培养基。之后浸泡在0.1mol/l的naoh中，80℃处理2h，去除纤维素中残留的培养基和菌体，再次用去离子水洗涤，直至中性。将经过预处理后的细菌纤维素，用滤纸吸干表面的水分，置于-20℃冰箱中预冷，直到其完全冷冻，然后于真空冷冻干燥机进行过夜冷冻干燥。本实施例获得乳白色半透明凝胶状的细菌纤维素膜。

实施例2：细菌纤维素复合膜制备

将干燥后的细菌纤维素膜，裁剪成直径为10mm的圆片。置于0.6％壳聚糖/羧甲基壳聚糖-柠檬酸水溶液中，室温下搅拌孵育24h后，取出进行真空冷冻干燥12h，并保存在吸湿器中。本实施例获得了超微细网状结构、孔隙均匀分布的细菌纤维素复合膜。

实施例3：细菌纤维素复合膜结构特性分析

1)扫描电镜分析

将处理后的细菌纤维素裁剪成5mm²左右的小方块，于离子镀金仪上喷金镀膜。镀膜后的样品用扫描电子显微镜观察微结构。

2)傅里叶红外光谱分析

利用傅里叶变换红外光谱仪，测定细菌纤维素的红外吸收光谱。将干燥后的细菌纤维素样品与kbr混匀并研磨，压成薄片检测，范围为4000-500cm^-1。

2)x-射线衍射分析

利用x射线衍射仪，将干燥后的细菌纤维素固定于框架上，保持平整，铜靶，测试电压为40kv，测试电流为15ma，速率10°/min，布宽0.02°，2θ为10-80°大范围扫描；然后以衍射角(2θ)为横坐标，衍射强度为纵坐标形成x-射线衍射图。根据文献，样品结晶度由以下公式计算：

cri＝(i200-iam)/i200

i200为2θ＝22.5°的衍射强度，即结晶纤维的强度值；

iam为2θ＝18°的衍射强度，即无定形纤维的强度值。

本实施例获得的细菌纤维素复合膜具有相似的微观结构，呈超微细网状，孔隙均匀分布，结构紧凑，壳聚糖/羧甲基壳聚糖没有破坏细菌复合膜的纤维网状结构。傅里叶红外光谱分析结果如图2所示，表明细菌纤维素复合膜均可观察到细菌纤维素的特征峰(～3400cm^-1、～2900cm^-1、～2800cm^-1)，经过复合之后，壳聚糖或者羧甲基壳聚糖的引入并未影响细菌纤维素的分子结构。x-射线衍射分析结果如图3所示，当与壳聚糖复合后，在14.52°和22.68°处出现了两处主要的衍射峰，与细菌纤维素纯膜相对比，少了16.84°处的衍射峰。羧甲基壳聚糖纤维素膜的x-射线衍射图谱则与壳聚糖纤维素膜类似。另外，抑菌复合膜的衍射峰峰值相较于细菌纤维素纯膜都有一定程度的下降，这可能是由于抑菌剂会与纤维素分子形成分子间氢键，使纤维素分子间原有的氢键遭到破坏，使结晶程度降低。经计算，壳聚糖纤维素膜的结晶度为52.23％，羧甲基壳聚糖纤维素膜的结晶度为57.51％，均比纯膜低，证实了上述推测。

实施例4：细菌纤维素复合膜抗菌特性研究

1)培养基

酵母膏5g，大豆蛋白胨10g，氯化钠10g，蒸馏水1000ml，115℃灭菌20min。

2)抑菌圈法来表征复合膜的抗菌性能

挑取斜面指示菌大肠杆菌、金黄色葡萄球菌分别接入lb培养基中，37℃下培养12h制得菌体悬浮液。将固体lb培养基高温灭菌后，冷却至40℃左右时按1％的接种量添加指示菌的悬浮液，充分混匀后迅速倒入平板中，等到培养基凝固，用灭过菌的镊子将直径为10mm的复合膜材料置于平板培养基上，并且轻压样品，保证样品和培养基完全接触。37℃恒温培养18h。以未复合的细菌纤维素纯膜材料为对照。

抑菌圈直径(mm)＝材料和抑菌圈的总直径—材料的直径

本实施例获得的壳聚糖细菌纤维素复合膜经对大肠杆菌(escherichiacoli)和金黄色葡萄球菌(staphylococcusaureus)均有抑制，抑菌圈直径分别为2.4mm和1.2mm，如图4a和b所示；羧甲基壳聚糖纤维素复合膜同样抑制大肠杆菌(escherichiacoli)和金黄色葡萄球菌(staphylococcusaureus)的生长，抑菌圈直径分别为5.4mm和2.6mm，如图4c和d所示。在相同条件下，细菌纤维素复合膜对金黄色葡萄球菌的抑菌圈直径要小于大肠杆菌，这是因为金黄色葡萄球菌属于革兰氏阳性菌，细胞壁较厚，对复合材料抑菌作用的抵抗性能更强。

以上所述仅是本发明的优选实施方式，应当指出，对于本技术领域的普通技术人员来说，在不脱离本发明原理的前提下，还可以做出若干改进和润饰，这些改进和润饰也应视为本发明的保护范围。