一种分支酶及其在抗性糊精制备中的应用的制作方法

本发明涉及一种分支酶及其在抗性糊精制备中的应用，属于生物工程技术领域。

背景技术：

抗性糊精又叫难消化糊精，它由玉米淀粉为原料加工制成，因为其含有抗性成分，能够抵抗人体消化酶的作用，在消化道中不会被消化吸收，能直接进入大肠。同时抗性糊精作为一种低分子水溶性膳食纤维，具有膳食纤维的生理作用，同时还具有食品原材料很多特点，易于添加到加工食品中。现在抗性糊精主要应用于清凉饮料、果汁饮料、调味料、果子酱等的生产；近年来国内外研究发现其在高血糖、高血脂疾病等方面也有治疗保健作用。抗性糊精的研究最早起源于日本，并很快申请发明专利，随后欧洲国家和美国也开始了对抗性糊精的研究，并且申请了专利，目前应用最多的抗性糊精仍然是日本生产的fibersol-2，其抗性含量能达90％以上，并且颜色为无色。我国在20世纪九十年代才开始对抗性糊精进行研究，1995年林勤保等以淀粉为原料制备焦糊精，并将焦糊精用α-淀粉酶处理后再用葡萄糖淀粉酶处理制备抗性糊精，并对影响产品组成成分的因素进行阐述。2006年，广东省食品研究所申请了一种抗性麦芽糊精的制备工艺的专利，它先对焦糊精用α-淀粉酶水解，然后用普鲁兰酶处理，后进行脱色离子交换和喷雾干燥得到抗性麦芽糊精，但产率都不高，基本上都是在40％45％左右。

分支酶(branchingenzyme，简称be，ec2.4.1.18)，属于糖苷水解酶家族(gh13)。该酶可以广泛应用于修饰淀粉，催化α-1,6糖苷键的生成；它的主要作用一方面催化供体线性α-1,4葡聚糖链的降解(直链淀粉和支链淀粉)，另一方面又可以通过α-1,6糖苷键将降解分子片段连接到受体上，形成更多的支链，从而改变淀粉的支化程度，具有重要的理化性质和生理功能。分支酶的来源主要有植物、动物和微生物。目前所发现的淀粉分支酶主要为植物来源，很难用于工业化生产。微生物来源的淀粉分支酶底物专一性高、酶活力强、分支化度大，在工业应用中具有无可比拟的优势。然而，天然菌株的产酶能力较低，限制了其在工业应用中的潜力。

技术实现要素：

本发明第一个目的是提供一种产分支酶基因工程菌，是以大肠杆菌为宿主，表达seqidno.2所示分支酶。

在本发明的一种实施方式中，所述分支酶由seqidno.1所示基因编码。

在本发明的一种实施方式中，所述宿主为e.colibl21、e.colijm109、e.colidh5α或e.colitop10。

在本发明的一种实施方式中，所述宿主为大肠杆菌e.colibl21(de3)。

在本发明的一种实施方式中，所述表达是以pt7-7为载体。

在本发明的一种实施方式中，所述基因工程菌按下述方法构建：将核苷酸序列为seqidno.1的淀粉分支酶基因连接到表达载体pt7-7上，然后再转化到大肠杆菌e.colibl21(de3)中，筛选正确的转化子，即得到基因工程菌pt7-7-t.fube/e.colibl21(de3)。

本发明的第二个目的是提供一种应用所述基因工程菌生产淀粉分支酶的方法，是将所述基因工程菌接种含有80-100mg/l卡那青霉素的lb中振荡培养8-10h，然后按体积计，以5％的接种量转接至含有卡那青霉素的tb培养基中培，加入终浓度为0.12-0.2mm/l的iptg，诱导36-48h。

在本发明的一种实施方式中，诱导后离心收集菌体，破壁后离心收集上清液即为淀粉分支酶。

在本发明的一种实施方式中，诱导培养阶段是当菌体细胞浓度达到od600为0.6-0.8时，加入终浓度为0.12-0.2mm/l的iptg。

在本发明的一种实施方式中，诱导培养阶段控制温度25-30℃。

本发明的第三个目的是提供一种抗性糊精制备方法，所述方法是以淀粉为底物，应用seqidno.2所示的分支酶进行酶法转化。

在本发明的一种实施方式中，所述的方法以淀粉为底物，先将底物进行高温酸解，再向酸解后的淀粉溶液中加入1000-1500u/g底物的淀粉分支酶，在35-50℃反应8-12小时。

在本发明的一种实施方式中，所述高温酶解后的淀粉溶液浓度为200g/l-300g/l。

在本发明的一种实施方式中，所述高温酸解是：淀粉加入5％的1mol/l的hcl溶液后在160-200℃进行高温反应，冷却过筛后抗性成分已有40％-45％。

在本发明的一种实施方式中，所述分支酶为酶液、酶粉或表达seqidno.2所示分支酶的细胞。

在本发明的一种实施方式中，所述分支酶是由表达seqidno.2所示分支酶的基因工程菌发酵生产的酶液。

在本发明的一种实施方式中，所述基因工程是表达所述分支酶的重组大肠杆菌。

在本发明的一种实施方式中，所述基因工程是携带重组质粒且表达编码所述分支酶基因的大肠杆菌e.colibl21(de3)。

在本发明的一种实施方式中，所述重组质粒是pt7-7。

本发明还提供所述方法在制备含抗性糊精的产品中的应用。

本发明的有益效果：本发明将来源于thermobifidafusca的淀粉分支酶异源表达到大肠杆菌中，构建了一种基因工程菌，以pt7-7为表达载体，以e.colibl21(de3)为表达宿主，提供了一种高产淀粉分支酶的重组大肠杆菌，本发明菌株生产的淀粉分支酶的最适ph6-7、最适温度为35-50℃、在40℃条件下半衰期可达200h。利用本发明的淀粉分支酶以淀粉为底物，经过高温酸解后，配成200g/l-300g/l的底物浓度，然后在35℃-45℃条件下进行酶转化，反应时间为8-12小时，抗性糊精含量达60％。可用于食品添加剂行业。

附图说明

图1为5od重组菌发酵破壁上清(摇瓶)sds-page电泳图；m:分子量标准蛋白；1，e.colibl21(de3)/pt7-7-t.fube细胞破壁上清；

图2为淀粉分支酶在不同温度下的酶活；

图3为淀粉分支酶在40℃下的热稳定性；

图4为淀粉分支酶在不同ph值下的酶活；

图5为淀粉中α-1.4糖苷键与α-1.6糖苷键比例；

图6为抗性糊精中α-1.4糖苷键与α-1.6糖苷键比例。

具体实施方式

1、酶活测定方法：

(1)配置50mm，ph6.5的磷酸缓冲液(na2hpo4.12h2o和nah2po4.2h2o)；

鲁戈碘液(母液)：0.26g碘与2.6g碘化钾溶于10ml的容量瓶中(提前3天配置，确保碘完全溶解)，避光室温保存(6个月)。

终止反应液：0.1ml的鲁戈碘液+50ul的2mol/l盐酸溶液，定容到26ml(现配现用)；

底物：0.01g直链淀粉(0.1g支链淀粉)+0.2ml96％乙醇。3-4分钟后加入0.5ml，2mol/l的naoh溶液，加入10ml的水，搅拌10min溶解淀粉，再加入0.5ml2mol/l的hcl溶液，加入ph6.5的缓冲液定容到10ml调节ph为6.5。

(2)测定方法：50ul的酶液+50ul的底物，在40℃下水浴30min，在加入2ml的终止反应液，室温放置20min后660nm(直链淀粉)或530nm(支链淀粉)处测吸光值。

(3)酶活定义:常温下在660nm或530nm处，吸光值每分钟降低1％为一个酶活单位。

2、抗性糊精含量的测定方法：测定方法参照国标gb/t22224-2008《食品中膳食纤维的测定-酶重量法》，测定结果为质量占比，采用百分比表示，例如60g/l表示为60％。

抗性糊精的得率(％)＝干燥后物质重量/反应前焦糊精重量*100。

实施例1：基因工程菌的构建

1、根据tfu_0582的基因序列(genbank登陆号nc_007333.1：663757-666006)设计一对引物p1和p2。下划线为酶切位点ndeⅰ和hindⅲ，

p1：5’-ccatatgaccgcccggcctgcagt-3’

p2：5’-caagctttcacgtcccgtcgaacaccagc-3’

以thermuobifidafuscawsh03-11(公开于2008年，题为identificationandcharacterizationofbacterialcutinase的论文中)总dna为模板，以p1、p2为引物，pcr扩增编码分支酶的基因(genbank登陆号nc_007333.1：663757-666006)，然后克隆到pmd18-tsimple载体(商业化工具载体)，连接产物转化大肠杆菌jm109，转化产物涂布含100mg/l氨苄青霉素的lb平板。经37℃培养过夜，挑选菌落，接入lb液体培养基，8-10h后提取质粒，命名为tfu_0582/pmd18-tsimple，将此质粒进行序列测定。结果表明插入片段为一个2250bp的dna片段，编码seqidno.2所示的酶。

2、用于构建大肠杆菌表达载体的质粒是pt7-7，将pt7-7质粒和tfu_0582/pmd18-tsimple分别进行ndeⅰ和hindⅲ双酶切，酶切产物割胶回收后，再用t4连接酶连接，连接产物转化e.colijm109感受态细胞，经37℃培养8h，挑转化子在含有100mg/l卡那青霉素的lb中振荡培养，提取质粒，酶切验证得到表达质粒tfu_0582/pt7-7。

3、将质粒tfu_0582/pt7-7转化e.colibl21(de3)宿主菌，涂布含卡那青霉素(100mg/l)的lb平板上，37℃培养8h。挑单菌落至液体lb中，37℃培养过夜，保存甘油管。

实施例2：发酵生产分支酶

1、将甘油管菌株转接lb培养基中37℃液体培养过夜，后接入tb发酵液体培养基(甘油5g/l，蛋白胨12g/l，酵母膏24g/l，k2hpo412.54g/l，kh2po42.31g/l)，37℃培养至od600达0.6后用终浓度0.12-0.2mm/l异丙基硫代-β-d-半乳糖苷(iptg)诱导，然后转移至25℃培养48小时，离心菌体，用ph6.50.05mol/l磷酸钠缓冲液悬浮细胞，超声破碎，离心后测定上清液中分支酶活力，重组分支酶发酵活力达到2500u/ml，重组分支酶蛋白sds-page电泳图见图1。

以直链淀粉为底物，在不同的温度下测酶活，结果表明淀粉分支酶的最适温度为40℃(图2)，且在40℃的半衰期为200h(图3),然后在最适温度条件下设置不同ph梯度测淀粉分支酶的酶活，得出该酶的最适ph为6.5(图4)。

实施例3：淀粉分支酶在抗性糊精制备中的应用

以淀粉为底物，向淀粉加入5％的1mol/l的hcl溶液后在160-200℃进行高温反应，冷却过筛后抗性成分已有40％-45％。经过高温酸解后配制成200g/l-300g/l的底物浓度在不同温度下进行酶转化，酶转化的温度在35-45℃，在不同ph条件下进行酶转化，发现酶转化的ph在6-7效率较高，再检测了加酶量和酶转化反应时间，得出加酶量为1000-1500u/g，酶转化反应时间为8-12h时，抗性糊精含量达到60％，较高温酸解后提高了10％以上。

将所得到的抗性糊精粗品和淀粉用核磁共振法检测前后的α-1.4糖苷键与α-1.6糖苷键的比例变化，如图5～6(相同信号强度下的两个局部图谱)，未加入淀粉分支酶前，α-1.4糖苷键：α-1.6糖苷键＝17.30:1，加入分支酶后，α-1.4糖苷键：α-1.6糖苷键＝7.95:1，α-1.4糖苷键在减少，而α-1.6糖苷键在增加。

实施例4：thermusthermophiles的淀粉分支酶ttbe在抗性糊精中的应用

以淀粉为底物，经过高温酸解后配制成200g/l-300g/l的底物浓度，在60℃-65℃加入ttbe分支酶进行酶转化，当ph为6-7，加酶量为2500-3000u/g，反应时间为10-12h时，(抗性成分较高温酸解后增量仅为5％。

实施例5：aquifexaeolicus的淀粉分支酶aabe在抗性糊精中的应用

以淀粉为底物，经过高温酸解后配制成200g/l-300g/l的底物浓度，在70℃-80℃加入aabe分支酶进行酶转化，当ph为7.0-7.5，加酶量为3000u/g左右，反应时间为10-12h时，抗性糊精增量(相比于高温酸解后的含量)仅为3％。

对照例1

具体实施方式同实施例3，区别在于，酶反应温度为30℃，抗性糊精增加量仅为高温酸解后抗性成分含量的6％-7％。

对照例2

具体实施方式同实施例3，区别在于，酶反应ph为5或8，抗性糊精增量为高温酸解后抗性成分含量的2.5％-3％。

对照例3

具体实施方式同实施例3，区别在于，酶反应时间小于8h，抗性糊精增量为高温酸解后抗性成分含量的2％-8％，而当酶反应时间大于12h时，抗性糊精增量基本不变。

对照例4

具体实施方式同实施例2，区别在于不进行iptg诱导，结果显示，分支酶酶活约500u/ml。

虽然本发明已以较佳实施例公开如上，但其并非用以限定本发明，任何熟悉此技术的人，在不脱离本发明的精神和范围内，都可做各种的改动与修饰，因此本发明的保护范围应该以权利要求书所界定的为准。

sequencelisting

<110>江南大学

<120>一种分支酶及其在抗性糊精制备中的应用

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