本发明属于微生物工程技术领域，具体涉及一种煤层厌氧产甲烷菌群的菌种保藏方法。
背景技术：
菌种作为从事微生物学研究的基本材料，是国家的重要资源。特别是对于利用微生物进行相关的生产，更是离不开菌种。故菌种保藏在微生物学研究及实际应用中必不可少。
目前，菌种保藏的方法主要有：甘油冷冻保藏法、液体石蜡保藏法、真空冷冻干燥保藏法、冷冻保藏法及载体保藏法等。生物煤层气的产生是由多种厌氧混合菌共同作用代谢煤基质产生的，故需保藏的作用混合菌群结构相对稳定性非常重要。
煤层气(coalbedmethane,cbm)是储存在煤层中、自发产生的一种非常规天然气，其主要成分为甲烷，并含有少量的co、co2、n2、h2s、h2等气体，以吸附态为主、游离态为辅储存在煤层基质表面或空隙中，是一种非常优质的清洁能源。目前，煤层气的开发及利用都受到了世界各国的重视，我国也大力提倡开发及利用煤层气。煤层气可分为热成因煤层气和生物成因煤层气。生物成因煤层气又可分为原生生物成因煤层气和次生生物成因煤层气，原生生物成因煤层气形成于煤化作用的早期阶段，难于大量保存，目前探测到的生物成因煤层气多为次生生物煤层气，次生生物煤层气是由产甲烷菌等厌氧菌（包括细菌及古菌等）代谢煤或煤层物质产生的以甲烷为主要成分的气体。目前，次生生物煤层气的基础地质研究及勘探开发已经成为煤层气地质界的研究热点。在微生物工程技术领域，实验模拟次生生物煤层气的产生被广泛应用于研究生物成因煤层气生成的机理中。大量煤层本源菌群的生物气生成模拟实验都证实了煤层气井中存在完整的产甲烷菌群生态系统。但煤层中贫瘠的营养条件限制了它们的活性，直接保藏煤层中的产甲烷菌群，其用于后续的生物产气模拟实验，产气效果不理想。现有的生物产气研究实验大都建立在对本源产甲烷菌群的富集驯化试验基础之上，即煤层本源菌群经厌氧富集驯化培养后，利用培养到的本源微生物进行生物产气模拟实验。如何对富集驯化到的厌氧产甲烷菌群进行菌种保藏对于后续模拟产气实验中研究生物成因煤层气的产气机理及获得较稳定的高甲烷产量具有重要意义。
技术实现要素：
本发明为了解决现有菌种保藏方法无法满足煤层气生成的产甲烷菌群的菌种短期和长期保藏，且能够保持菌种高产甲烷气的活性，提供了一种煤层厌氧产甲烷菌群的菌种保藏方法。
本发明由如下技术方案实现的：一种煤层厌氧产甲烷菌群的菌种保藏方法，包括如下步骤：
（1）筛选待保藏菌种：在煤层气产气井排水口采集煤层产出水，对产出水进行产甲烷菌群富集驯化培养，甲烷生成量达到30%以上的菌种培养液作为待保藏菌液；
（2）短期保藏：步骤（1）中获得的待保藏菌液加入到5ml的厌氧管中，然后加入等体积的灭菌甘油/除氧l-半胱氨酸溶液，将其混匀后保藏；
（3）长期保藏：100l的保藏罐中加入1/5容积的无烟煤块煤和50l灭菌的保藏营养液，保藏营养液在加入保藏罐前加入100ml浓度为20%的无菌l-半胱氨酸和50.6mg的刃天青，然后向保藏罐中加入500ml步骤（1）中获得的经富集驯化培养的菌液，保藏罐中持续通入纯n2，2h后间断取样，直至培养基颜色接近无色停止通入n2；室温密闭保藏，每周利用排水集气法收集保藏罐顶空的气体进行气相色谱分析，当气相色谱检测分析甲烷相对含量降低至7%-15%时，向保藏罐内取出25l的培养液，然后再向罐内加入25l含终浓度为0.04%的l-半胱氨酸和0.0001%的刃天青的保藏营养液。
步骤（2）中所述甘油/l-半胱氨酸溶液中：甘油的质量分数为30%，l-半胱氨酸的终浓度为0.04%；
步骤（3）中保藏营养液配方为：（g/l）：酵母粉2g，k2hpo42.9g，kh2po41.5g，nh4cl1.8g，mgcl20.4g。
步骤（3）中l-半胱氨酸的终浓度为0.04%，刃天青的终浓度为0.0001%。步骤（2）中短期保藏温度为4℃或25℃，保藏时间为15-30天；步骤（3）的保藏温度为室温。
本发明采用甘油/l-半胱氨酸进行短期保藏，适合小量短期保藏；长期保藏适合大量长期保藏，且保藏效果较短期保藏好，保藏的菌种能长时间保持活性；长期保藏中用到的无烟煤块可以为保藏的菌种提供生长必需的碳源、可以作为产甲烷的底物及可作为菌种的粘附介质；l-半胱氨酸可以为保藏的菌种提供厌氧环境；刃天青的加入可以帮助观察培养基内的厌氧情况；用到的保藏营养液及据甲烷相对含量降低补加的保藏营养液可以使保藏的菌种维持在较高的活性。
本发明在长期保藏时，菌种保藏体系中加入无烟煤块煤，可以为所要保藏的菌种提供生长必须的碳源，同时也作为产甲烷的底物，也可以作为菌种粘附介质；而保藏营养液的加入，能够使得菌种活性维持在较高水平，而间歇性检测菌种所产甲烷的相对含量，当含量降低后继续补加保藏营养液，使得菌种活性随着保藏时间的延长而不降低，l-半胱氨酸可以为菌种提供厌氧环境，利于其生长繁殖。
本发明模拟煤层环境条件，优化保藏厌氧产甲烷菌群的方法，使得保藏的产甲烷菌群在后续的生物产气模拟实验中始终保持较高的活性及较稳定的菌群结构，以得到较理想的甲烷产量。同时本发明短期保藏所需温度为4℃或25℃，长期保藏温度为室温即可，因此不需要超低温设备等，不需特殊设备，方便快捷，适合不同量菌种长短期保藏，同时使菌种的活性保持相对稳定且较高，菌体保藏后存活率高，活性恢复迅速，对于大量菌体保藏经济方便，为生产、试验节约成本。
具体实施方式
实施例1：一种煤层厌氧产甲烷菌群的菌种保藏方法，包括如下步骤：
（1）筛选待保藏菌种：根据山西晋城无烟煤矿业集团有限责任公司煤与煤层气共采国家重点实验室前期实验经验，在煤层气产气井排水口采集煤层产出水，对产出水进行产甲烷菌群富集驯化培养，甲烷生成量达到30%以上的菌种培养液作为待保藏菌液；
（2）短期保藏：步骤（1）中获得的待保藏菌液加入到5ml的厌氧管中，然后加入等体积的灭菌甘油/除氧l-半胱氨酸溶液，甘油/l-半胱氨酸溶液中：甘油的质量分数为30%，l-半胱氨酸的终浓度为0.04%；将其混匀后置于-80℃低温保藏，15-30天后活化复苏，观察结果；
（3）复苏方法：从-80℃冰箱中取出厌氧管，立即放置38℃-40℃水浴中快速复苏并适当摇动，直到内部冰晶全部溶解为止，约需50-100秒。溶解后的菌液直接用作接种剂进行生物气产气实验。
实施例2：保藏方法同实施例1所述保藏方法，置于4℃保藏，15-30天后直接作为接种剂进行生物气产气实验，观察结果。
实施例3：保藏方法同实施例1所述保藏方法，置于25℃保藏，15-30天后直接作为接种剂进行生物气产气实验，观察结果。
实施例4：一种煤层厌氧产甲烷菌群的菌种保藏方法，筛选待保藏菌种方法同实施例1所述方法；获得的待保藏菌液加入到5ml的厌氧管中，然后加入等体积灭菌的保藏营养液、再加入终浓度为0.04%的除氧l-半胱氨酸，其中保藏营养液配方为：（g/l）：酵母粉2g，k2hpo42.9g，kh2po41.5g，nh4cl1.8g，mgcl20.4g；上述混合均匀后25℃保藏，15-30天后直接作为接种剂进行生物气产气实验，观察结果。
实施例5：一种煤层厌氧产甲烷菌群的菌种保藏方法，包括如下步骤：
（1）筛选待保藏菌种：在煤层气产气井排水口采集煤层产出水，对产出水进行产甲烷菌群富集驯化培养，甲烷生成量达到30%以上的菌种培养液作为待保藏菌液；
（2）长期保藏：100l的保藏罐中加入1/5容积的无烟煤块煤、50l灭菌的保藏营养液，保藏营养液加入保藏罐前于保藏营养液中加入100ml的浓度为20%的l-半胱氨酸及50.6mg的刃天青，向保藏罐中加入500ml步骤（1）中获得的经富集驯化培养的菌液，向保藏罐中持续通入高纯n2，2h后间断取样，直至培养基颜色接近无色停止通入n2。室温密闭保藏罐保藏2年；保藏营养液配方为：（g/l）：酵母粉2g，k2hpo42.9g，kh2po41.5g，nh4cl1.8g，mgcl20.4g；l-半胱氨酸的终浓度为0.04%。
在密闭保藏的2年内，每周利用排水集气法收集保藏罐顶空的气体进行气相色谱分析，当气相色谱检测分析甲烷相对含量降低至7%-15%时，向保藏罐内取出25l的培养液，然后再向罐内加入25l的保藏营养液（含终浓度为0.04%的l-半胱氨酸和0.0001%的刃天青）。
实验例1：各保藏方法保藏的菌种进行活力检测：
培养基准备：向1l密闭培养瓶中加入250g小块无烟煤、350ml保藏营养液及0.408mg刃天青，121℃高压蒸汽灭菌30分钟。
在yqx-п型厌氧手套箱（上海跃进医疗器械厂）内向1l密闭培养瓶中加入800μl无菌的20%l-半胱氨酸，然后向密闭培养瓶中持续通入高纯n2，直至培养基颜色近无色。
在厌氧手套箱中，上述密闭培养瓶内直接接种保藏15-30天后的实施例1-4所述保藏菌种，接种量为50ml菌液；实施例5所述保藏菌种，先用无菌培养瓶在保藏罐内接取50ml菌液，然后以此为接种剂在厌氧手套箱内将其接种于1l的密闭培养瓶内。
接种好的密闭培养瓶于室温下静置培养1-2个月，期间每周抽取培养瓶顶空的气体进行气相色谱分析，在测样品甲烷含量时，进行甲烷标样测定。根据标样甲烷的保留时间进行定性，根据甲烷标样浓度已知，标样及样品甲烷的峰面积由气相色谱测得，根据公式：甲烷标样浓度/峰面积=样品中甲烷浓度/峰面积，从而计算样品中甲烷气的浓度，依此来获得甲烷生成相对含量，以甲烷相对含量作为混合菌群保藏活力的衡量指标，即甲烷生成量越高，保藏的菌种活性越高。
所有实验均在山西晋城无烟煤矿业集团有限责任公司煤与煤层气共采国家重点实验室进行，实验结果见表1，由表1结果可知，4℃及25℃条件下进行的短期甘油菌种保藏，保藏的菌种活性较低，产气实验中有甲烷气生成。-80℃保藏的菌种不利于后续的产气实验。实施例4所述方法保藏的菌种在产气实验中没有甲烷生成，只生成h2。实施例5所述方法保藏的菌种在产气实验中甲烷产气量最高，是最适合保存厌氧产甲烷菌群的一种菌种保藏方法。
显然，采用甘油/l-半胱氨酸进行短期保藏，适合小量短期保藏；而实施例5所述方法进行菌种中长期保藏，适合大量进行长期保藏，并且可长时间维持微生物的活力，具有较长的保藏期。