本发明涉及到微生物菌种发酵领域，具体的说是一种乳酸菌冻干保护剂及其制备方法和使用方法。
背景技术：
乳酸菌具有多种生理功能，包括治疗乳糖不耐症；促进蛋白质、单糖及钙、镁等营养物质的吸收；分泌维生素b；改善人体肠道功能，抑制腐败菌的繁殖，降血脂、降血压；免疫调节以及抗肿瘤、预防癌症作用等。随着我国乳制品产业的飞速发展，市场对乳酸菌产品的需求增大。乳酸菌发酵剂的质量受到研究人员的关注。乳酸菌的保藏和乳酸菌发酵剂的制备是乳酸菌诸多功能得以利用。
目前乳酸菌发酵剂可采用真空干燥、喷雾干燥、冷冻干燥等方法制备。许多研究者发现冷冻干燥具有其他方法无法比拟的优点，是制备和保存生物材料最有效的方法，并得到越来越广泛的应用。乳酸菌细胞在冻干过程中会受到一定的损伤，包括机械损伤、溶质损伤、细胞膜损伤、细胞代谢调节作用损伤，从而造成细胞死亡。
研究发现，在冻干前加入适当的保护剂，可以改变菌体冷冻干燥时的物理、化学环境，减轻或防止冷冻干燥或复水对细胞的损害，尽可能保持原有的各种生理生化特性和生物活性，从而提高细胞的存活率。
技术实现要素：
本发明的目的是提供一种乳酸菌冻干保护剂及其制备方法和使用方法，本发明的方法冷冻干燥效果好，而且在乳酸菌的冷冻干燥中，能够大大提高菌体的存活率以及在贮藏过程中的活菌存活率。
本发明为实现上述技术目的所采用的技术方案为：一种乳酸菌冻干保护剂，按照质量份数，其有效成分由10-18份的海藻糖、10-18份的脱脂奶粉、2-6份的复合添加组分和1.2-6份的渗透稳定组分组成，其中，复合添加组分为甘油和山梨醇以1-6:1的重量比混合，渗透稳定组分由l-半胱氨酸、维生素c和乙酸钠以1-6:1-2:1-2的重量比混合。
本发明的一种优选方案为，所述复合添加组分中还含有甘油重量10-12%的聚乙烯吡咯烷酮。
本发明的一种优选方案为，所述复合添加组分中还含有甘油重量8-12%的甘露醇。
本发明的一种优选方案为，所述渗透稳定组分中还含有l-半胱氨酸重量4-8%的硫酸锰和l-半胱氨酸重量10-15%的天门冬氨酸。
上述乳酸菌冻干保护剂的制备方法，按照上述的比例分别称量各组分，然后将海藻糖、脱脂奶粉、复合添加组分溶于52-74份的水中，并在105℃的条件下灭菌20min，最后加入称量好的渗透稳定组分，混合均匀即制得产品。
利用上述乳酸菌冻干保护剂制备乳酸菌冻干发酵剂的方法为，将乳酸菌活化、培养，而后离心富集得到发酵液，向发酵液中加入与其等体积的上述制备的冻干保护剂后，在无菌条件下混合均匀，并在0-5℃的无菌环境中静置10-15h以增强菌体细胞的抗冻性，最后将上述混合液冻干即制得产品。
所述混合液冻干是指，将经过低温静置的混合液在-50℃、真空度为0.2mbar的条件下真空冷冻干燥为固态。
所述乳酸菌活化、培养是指，在mrs琼脂培养基中接种乳酸菌，再利用液体mrs培养基在37℃恒温培养箱中培养16h后收离心菌体，所得菌体用ph为7.4的pbs洗两遍得到发酵液。
本发明中，多糖、聚乙烯吡咯烷酮、糖醇等可以作为乳酸菌的冻干保护剂的组合成分，其中研究认为海藻糖的保护效果尤为明显。海藻糖是一种稳定的非还原性双糖，由于具有多个羟基，可以与菌体表面自由基联结起来，避免菌体暴露在介质中，还可与蛋白质形成氢键以取代水，保证蛋白质的稳定性；另一方面在溶液中易结合水分子，发生水合作用，减少了游离水的含量并增加了溶液的黏性，从而减缓晶核的生长过程，使形成的冰晶较细小，以达到保护细胞的目的；
脱脂奶粉是大多数乳品企业常用的冻干保护剂之一，因为它能够稳定细胞膜的成分，有利于再水化并且形成一层细胞保护膜，补充了额外的冻干保护剂的脱脂奶粉可提高其内在的保护作用；
本发明的创造点之一在于，将甘油和山梨醇以及甘露醇复合作为添加组分，由于甘油和山梨醇以及甘露醇具有多个羟基，在冻干过程中可取代水分子与菌体细胞膜磷脂中的磷酸基团或与菌体蛋白质极性基团形成氢键，从而保护了细胞膜和蛋白及结构与功能的完整性；
本发明的另一创造点在于，以l-半胱氨酸、维生素c和乙酸钠混合作为渗透稳定组分加入到冻干保护剂中，这三种成分能够渗入到细胞内部，在体系中结合水分子，发生水合作用，使体系的粘性增加，进而使冻干过程中体系的冰晶增长速度减缓，降低了水转化成冰的比例；同时，保护剂进入细胞内部，提高了细胞内部压力，降低了细胞外结冰引起的细胞脱水程度和速度，抑制了细胞内冰晶的生长，从而减少对细胞的伤害；而额外加入的硫酸锰和天门冬氨酸以及原有的l-半胱氨酸，均能够起到延长菌粉贮存稳定期的作用。
与现有技术相比，本发明具有以下有益效果：
1）本发明将甘油和山梨醇以及甘露醇复合作为添加组分，由于甘油和山梨醇以及甘露醇具有多个羟基，在冻干过程中可取代水分子与菌体细胞膜磷脂中的磷酸基团或与菌体蛋白质极性基团形成氢键，从而保护了细胞膜和蛋白及结构与功能的完整性，提高了乳酸菌的存活率；
2）本发明以l-半胱氨酸、维生素c和乙酸钠混合作为渗透稳定组分加入到冻干保护剂中，这三种成分能够渗入到细胞内部，在体系中结合水分子，发生水合作用，使体系的粘性增加，进而使冻干过程中体系的冰晶增长速度减缓，降低了水转化成冰的比例；同时，保护剂进入细胞内部，提高了细胞内部压力，降低了细胞外结冰引起的细胞脱水程度和速度，抑制了细胞内冰晶的生长，从而减少对细胞的伤害；而额外加入的硫酸锰和天门冬氨酸以及原有的l-半胱氨酸，均能够起到延长菌粉贮存稳定期的作用；
3）利用本发明的冻干保护剂来制备乳酸菌冻干发酵剂时，采用低温静置处理，能够大幅度增强乳酸菌菌体细胞的抗冻性，从而增强乳酸菌在冻干过程中的存活率，冻干后得到的发酵剂常温下可保存30天，活菌存活率达到75％以上，在保藏期内性能稳定。
具体实施方式
为使本发明实现的技术手段、创作特征、达成目的以及有益效果易于明白了解，下面结合具体实施方式，进一步阐述本发明。
实施例1
一种乳酸菌冻干保护剂，按照质量份数，其有效成分由18份的海藻糖、18份的脱脂奶粉、6份的复合添加组分和6份的渗透稳定组分组成，其中，复合添加组分为甘油和山梨醇以1:1的重量比混合，渗透稳定组分由l-半胱氨酸、维生素c和乙酸钠以1:2:2的重量比混合；
上述乳酸菌冻干保护剂的制备方法，按照上述的比例分别称量各组分，然后将海藻糖、脱脂奶粉、复合添加组分溶于52份的水中，并在105℃的条件下灭菌20min，最后加入称量好的渗透稳定组分，混合均匀即制得产品；
利用上述乳酸菌冻干保护剂制备乳酸菌冻干发酵剂的方法为，将乳酸菌活化、培养，而后离心富集得到发酵液，向发酵液中加入与其等体积的上述制备的冻干保护剂后，在无菌条件下混合均匀，并在0℃的无菌环境中静置10h以增强菌体细胞的抗冻性，最后将上述混合液冻干即制得产品。
以上为本发明的基本实施方式，可在以上基础上做进一步的改进、优化和限定：
本实施例的一种优选方案为，所述复合添加组分中还额外含有甘油重量10%的聚乙烯吡咯烷酮；
本实施例的另一种优选方案为，所述复合添加组分中还可以额外含有甘油重量8%的甘露醇；
本实施例的再一种优选方案为，所述渗透稳定组分中还含有l-半胱氨酸重量4%的硫酸锰和l-半胱氨酸重量10%的天门冬氨酸；
本实施例中所述混合液冻干是指，将经过低温静置的混合液在-50℃、真空度为0.2mbar的条件下真空冷冻干燥为固态；
本实施例中所述乳酸菌活化、培养是指，在mrs琼脂培养基中接种乳酸菌，再利用液体mrs培养基在37℃恒温培养箱中培养16h后收离心菌体，所得菌体用ph为7.4的pbs洗两遍得到发酵液。
实施例2
一种乳酸菌冻干保护剂，按照质量份数，其有效成分由10份的海藻糖、10份的脱脂奶粉、2份的复合添加组分和1.2份的渗透稳定组分组成，其中，复合添加组分为甘油和山梨醇以6:1的重量比混合，渗透稳定组分由l-半胱氨酸、维生素c和乙酸钠以6:1:1.5的重量比混合；
上述乳酸菌冻干保护剂的制备方法，按照上述的比例分别称量各组分，然后将海藻糖、脱脂奶粉、复合添加组分溶于74份的水中，并在105℃的条件下灭菌20min，最后加入称量好的渗透稳定组分，混合均匀即制得产品；
利用上述乳酸菌冻干保护剂制备乳酸菌冻干发酵剂的方法为，将乳酸菌活化、培养，而后离心富集得到发酵液，向发酵液中加入与其等体积的上述制备的冻干保护剂后，在无菌条件下混合均匀，并在5℃的无菌环境中静置15h以增强菌体细胞的抗冻性，最后将上述混合液冻干即制得产品。
以上为本发明的基本实施方式，可在以上基础上做进一步的改进、优化和限定：
本实施例的一种优选方案为，所述复合添加组分中还额外含有甘油重量12%的聚乙烯吡咯烷酮；
本实施例的另一种优选方案为，所述复合添加组分中还可以额外含有甘油重量12%的甘露醇；
本实施例的再一种优选方案为，所述渗透稳定组分中还含有l-半胱氨酸重量8%的硫酸锰和l-半胱氨酸重量15%的天门冬氨酸；
本实施例中所述混合液冻干是指，将经过低温静置的混合液在-50℃、真空度为0.2mbar的条件下真空冷冻干燥成固态；
本实施例中所述乳酸菌活化、培养是指，在mrs琼脂培养基中接种乳酸菌，再利用液体mrs培养基在37℃恒温培养箱中培养16h后收离心菌体，所得菌体用ph为7.4的pbs洗两遍得到发酵液。
实施例3
一种乳酸菌冻干保护剂，按照质量份数，其有效成分由14份的海藻糖、14份的脱脂奶粉、4份的复合添加组分和3.6份的渗透稳定组分组成，其中，复合添加组分为甘油和山梨醇以3.5:1的重量比混合，渗透稳定组分由l-半胱氨酸、维生素c和乙酸钠以3.5:1.5:1的重量比混合；
上述乳酸菌冻干保护剂的制备方法，按照上述的比例分别称量各组分，然后将海藻糖、脱脂奶粉、复合添加组分溶于63份的水中，并在105℃的条件下灭菌20min，最后加入称量好的渗透稳定组分，混合均匀即制得产品；
利用上述乳酸菌冻干保护剂制备乳酸菌冻干发酵剂的方法为，将乳酸菌活化、培养，而后离心富集得到发酵液，向发酵液中加入与其等体积的上述制备的冻干保护剂后，在无菌条件下混合均匀，并在3℃的无菌环境中静置13h以增强菌体细胞的抗冻性，最后将上述混合液冻干即制得产品。
以上为本发明的基本实施方式，可在以上基础上做进一步的改进、优化和限定：
本实施例的一种优选方案为，所述复合添加组分中还额外含有甘油重量11%的聚乙烯吡咯烷酮；
本实施例的另一种优选方案为，所述复合添加组分中还可以额外含有甘油重量10%的甘露醇；
本实施例的再一种优选方案为，所述渗透稳定组分中还含有l-半胱氨酸重量6%的硫酸锰和l-半胱氨酸重量12.5%的天门冬氨酸；
本实施例中所述混合液冻干是指，将经过低温静置的混合液在-50℃、真空度为0.2mbar的条件下真空冷冻干燥成固态；
本实施例中所述乳酸菌活化、培养是指，在mrs琼脂培养基中接种乳酸菌，再利用液体mrs培养基在37℃恒温培养箱中培养16h后收离心菌体，所得菌体用ph为7.4的pbs洗两遍得到发酵液。
为了验证本发明冻干保护剂的效果，特作以下实验进行比较验证：
实验材料1：以上实施例3制备的乳酸菌冻干保护剂作为保护剂a；
实验材料2：常规的冻干保护剂作为保护剂b，其成分为：12份脱脂奶粉，12份蔗糖，1.5份谷氨酸钠，0.3份甘油，0.2份维生素c；
实验材料3：将实施例3中的冻干保护剂去除复合添加组分后的剩余成分作为保护剂c；
实验材料4：将实施例3中的冻干保护剂去除渗透稳定组分后的剩余成分作为保护剂d；
实验用培养基：mrs培养基，mrs琼脂培养基；
实验用主要仪器：德国christ真空冷冻干燥机，spx-250bs-ⅱ型生化培养箱；sw-cj-ifd型单人单面净化工作台，gi54dw型高压灭菌器，高速冷冻离心机；
一、乳酸菌活化与培养方法：
乳酸菌的活化培养：将甘油冻存管中保藏菌种乳酸菌（干酪乳杆菌）用接种针在mrs琼脂培养基平板中划线，37℃恒温培养16h，挑单菌落于液体培养基中培养16h，液体传两代后用于后续实验；
将活化后的干酪乳杆菌以2%接种量接种到液体mrs培养基中进行扩大培养，在37℃恒温培养箱中培养16h后收离心菌体，所得菌体用ph7.4的pbs洗两遍，用于后续试验；
培养干酪乳杆菌所用的mrs液体培养基配方如下：蛋白胨10.0g/l、牛肉膏8.0g/l、酵母膏4.0g/l、葡萄糖20.0g/l、吐温801ml/l、磷酸氢二钾2.0g/l、三水乙酸钠5.0g/l、柠檬酸三铵2.0g/l、七水硫酸镁0.2g/l、硫酸锰0.05g/l，ph6.2±0.2；
mrs琼脂培养基是在mrs液体培养基的基础上添加琼脂15g/l。
二、实验方法如下：
(1)保护剂的准备
将上述的保护剂a、保护剂b、保护剂c和保护剂d按相同配比浓度用蒸馏水溶解，105℃灭菌20min后备用；
(2)冻干前乳酸菌计数
采用菌落平板计数法，即在无菌操作条件下，取lml的菌液，加9ml的灭菌生理盐水．制成1:10的均匀稀释液，再依次进行10倍递增稀释，至适当稀释度10-6、10-7、l0-8后，分别取各稀释浓度100μl于固体培养皿中，用涂玻棒使菌体分散均匀，倒置，放人37℃恒湿的培养箱中培养48h，记录每个平皿中形成的菌落数量，依据稀释倍数，计算出每毫升原始样品中所含细菌菌落总数，来表示活菌数，每个稀释度做3个平行，重复3次；
(3)菌体的收集及保护剂的添加
取30ml菌液于已灭菌且编号的离心管4000rpm离心20min，去上清，加入30ml的已灭菌的pbs清洗两遍；再于各管中分别加入已灭菌的30ml保护剂a、保护剂b、保护剂c和保护剂d重悬，将重悬液以lml分装于5ml西林瓶中，并对应编号；
(4)乳酸菌冻干及存活率计算
将已分装的冻干保护剂菌悬液在温度为4℃的环境中储藏12h后，开盖，放入真空冷冻干燥机，冻干条件为：真空度0.2mbar，冷冻温度-50℃，冻干时间24h；将盖子压紧，取出，即获得乳酸菌冻干菌粉。
将冻干菌粉用无菌生理盐水还原到冻干前体积，用菌落平板计数法进行冻干后乳酸菌计数。
细胞存活率（%）=冻干复水后1ml样液的活菌数（cfu/ml）/冻干前1ml样液的活菌数（cfu/ml）×100%。
三、实验结果
加入保护剂a的样品中细胞存活率为89.5%；
加入保护剂b的样品中细胞存活率为72.3%；
加入保护剂c的样品中细胞存活率为66.8%；
加入保护剂d的样品中细胞存活率为61.7%；
由此可知，本发明的冻干保护剂相比较于市面上常见的保护剂来说，其效果更好，而且由于保护剂a的细胞存活率远大于保护剂c和保护剂d，也就是说，同时加入复合添加组分和渗透稳定组分能够起到复合增效作用，能够进一步的提高细胞存活率。
以上显示和描述了本发明的主要特征、基本原理以及本发明的优点。本行业技术人员应该了解，本发明不受上述实施例的限制，上述实施例和说明书中描述的只是说明本发明的原理，在不脱离本发明精神和范围的前提下，本发明还会根据实际情况有各种变化和改进，这些变化和改进都落入要求保护的本发明范围内。本发明要求保护范围由所附的权利要求书及其等效物界定。