基于近红外光谱快速测定的氨基葡萄糖发酵补料控制方法与流程

本发明涉及基于近红外光谱快速测定的氨基葡萄糖发酵补料控制方法，属于生物工程技术领域。

背景技术：

氨基葡萄糖(glcn)，又名氨糖，是葡萄糖的一个羟基被一个氨基取代后的化合物，又名葡萄糖胺，广泛存在于自然界中，对人体具有重要的生理功能，参与肝肾解毒，发挥抗炎护肝作用，对治疗风湿性关节炎症和胃溃疡有良好的疗效，还可应用于食品、化妆品和饲料添加剂中。而氨基葡萄糖在微生物细胞内主要以n-乙酰氨基葡萄糖(glcnac)的形式存在。氨基葡萄糖几乎分布于人体所有组织，参与构造人体组织和细胞膜，是蛋白多糖大分子合成的中间物质，它可合成黏多糖、糖蛋白和蛋白聚糖，特别是合成那些关节软骨以及滑液分子的中间物，是人体及动物体内关节组织中糖蛋白的天然成分，在动物和人体内由葡萄糖氨基化内源性生物合成。体外研究也已显示，氨基葡萄糖能激化蛋白多糖的合成以及通过关节软骨增加硫酸盐的吸收，大量的临床研究表明，氨基葡萄糖具有抗骨关节炎作用和抗肿瘤活性等。

近年来，氨基葡萄糖发酵产品国内相继地研制成功，并作为原料药大量出口，但其发酵生产工艺各异，产品质量参差不齐。目前，生产glcn的方法主要有3种，即酸水解法、酶解法及微生物发酵法。前两种方法的生产原料基本上来源于虾蟹的外骨骼，即从虾蟹壳中提取甲壳素与壳聚糖，再经酸解或酶解获得glcn。高浓度的盐酸在一定的反应条件下能够将虾蟹壳中的甲壳素与壳聚糖降解为glcn，但由于浓盐酸的大量使用会带来严重的环境问题，将逐步受到国家相关政策的限制；酶解法是利用壳聚糖酶对虾蟹壳进行降解，现在面临的最大问题是环境污染。微生物发酵法生产氨基葡萄糖，主要采用大肠杆菌基因工程菌的方法发酵生产，发酵过程中涉及测定参数众多，特别是发酵控制补料工艺，是决定氨基葡萄糖工艺水平的关键，补料工艺参数会较大影响发酵结果和产品质量。而近红外光谱主要反映分子中含氢基团(c-h,n-h,o-h)振动的合频与各级倍频的吸收信息，具有丰富的化学信息量，近红外光谱以此为基础对有机物组成和性质信息进行分析。现代近红外光谱分析充分利用全谱段或多波长光谱信息进行定性或定量分析。该技术是多种组分同时测定，且具有量化、无损、实时监控的特点。国内氨基葡萄糖发酵法工艺主要建立在传统的在线ph、溶解氧控制；离线测定过程参数，如发酵液中氨基葡萄糖含量、培养基中残糖(葡萄糖)含量以及副产物谷氨酸含量等指标。传统的发酵补料参数控制存在滞后，对氨基葡萄糖发酵工艺不稳定，造成产量和产品质量也不稳定的不良后果。目前还未见基于近红外光谱分析的氨基葡萄糖发酵工艺。

氨基葡萄糖采用微生物大肠杆菌基因工程菌发酵，利用高密度发酵技术，发酵过程中菌体浓度与产量极大相关，因此，过程控制成为提高氨基葡萄糖发酵产量的重要因素。江南大学陈欣(江南大学博士论文：代谢工程改造大肠杆菌发酵生产氨基葡萄糖及过程优化与控制，陈欣)提出了氨基葡萄糖发酵过程中分阶段葡萄糖流加策略，即在发酵的前2h内不流加，2-10h采用指数流加，10-16h之后变换为恒速流加，提高了氨基葡萄糖的产量和生产强度，同时也研究了不同溶氧do水平(10、20、30、40％)对重组大肠杆菌发酵生产氨基葡萄糖的影响，对发酵过程中动力学参数进行了比较，发现do与发酵产物氨基葡萄糖和乙酰氨基葡萄糖比合成速率之间的规律，并进行了溶氧水平控制的优化，在此基础上也提出了分阶段溶氧水平控制策略，即在发酵的前2h内控制do水平为20％，2-8h控制do水平为30％，8-12h控制do水平为40％，12-18h控制水平do为30％，在此条件下，氨基葡萄糖的产量和生产强度较不控制溶氧时有了明显提高。除此之外，目前有关氨基葡萄糖发酵补料(补糖)方法并未见报道，然而，该方法只是在理论上可行，在实际生产中难以实现如此精确的控制。常见的比较现实的控制补糖方法是控制残糖浓度、控制菌体生长速率，然后确定在适当的od值开始补糖。但现有的菌体浓度(od)和残糖测定采用是紫外分光光度法，测定时间比较长，往往测定数据需要几个小时以上，这对快速生长的大肠杆菌控制比较滞后，耽误控制的关键时间和关键点。因此，为了快速准确控制氨基葡萄糖生产过程中补料(补糖)工艺，最直接明显的方法是控制生长速度与od值、氨基葡萄糖产物、残糖含量、ph等。本发明利用近红外光谱建立菌体浓度(od)、残糖浓度及产物含量之间的模型，从而建立了氨基葡萄糖的发酵补料工艺方法。

技术实现要素：

针对上述现有技术，本发明提供了一种基于近红外光谱快速测定的氨基葡萄糖发酵补料控制方法。本发明采用近红外光谱快速分析的方法，利用快速分析检测(可快速测定od、残糖浓度、产物浓度等关键控制参数)优势，及时反映发酵过程参数变化，确定了氨基葡萄糖发酵补糖依据或关键因子，建立了氨基葡萄糖发酵补料工艺方法，氨基葡萄糖发酵生产水平和产品质量得到明显提升。

本发明是通过以下技术方案实现的：

基于近红外光谱快速测定的氨基葡萄糖发酵补料控制方法，包括采用大肠杆菌基因工程菌发酵生产氨基葡萄糖，其中，发酵过程中，采用近红外光谱分析方法实时在线检测发酵液的od600nm值，当od600nm＝20～30时，开始补糖，采用近红外光谱分析方法实时在线检测并控制葡萄糖底物浓度≤0.20g/l，采用近红外光谱分析方法实时在线检测并控制ph值在6.75～6.95，控制补糖速率：od600nm值每小时的增加量(菌体生长速率)为1.5～3，至发酵结束；发酵周期为48～72小时。

本发明的基于近红外光谱快速测定的氨基葡萄糖发酵补料控制方法，采用近红外光谱快速分析方法建立了od、残糖浓度、产物浓度等关键控制参数之间的关系，解决了氨基葡萄糖发酵补料依据(既不是单一的根据od值补料，也不是单一的根据残糖含量补料)，建立了氨基葡萄糖的补糖方法。本发明利用快速分析检测(可快速测定od、残糖浓度、产物浓度等关键控制参数)优势，及时反映发酵过程参数变化，确定了氨基葡萄糖发酵补糖依据或关键因子，建立了氨基葡萄糖的发酵补料工艺方法，氨基葡萄糖发酵生产水平和产品质量得到明显提升。

附图说明

图1：氨基葡萄糖定标曲线。

图2：葡萄糖(残糖)定标曲线。

图3：发酵过程中菌体浓度od值定标曲线。

具体实施方式

下面结合实施例对本发明作进一步的说明。

下述实施例中所涉及的仪器、试剂、材料等，若无特别说明，均为现有技术中已有的常规仪器、试剂、材料等，可通过正规商业途径获得。下述实施例中所涉及的实验方法，检测方法等，若无特别说明，均为现有技术中已有的常规实验方法，检测方法等。

实验近红外快速测定的可行性验证

采用福斯近红外分析仪ds2500f预测氨基葡萄糖发酵液中的od、氨糖，葡萄糖，谷氨酸等指标，并进行可行性验证，具体如下：

1.建立数据库：

发酵液样品性状：样品为发酵液(大肠杆菌发酵生产氨基葡萄糖的发酵液)，发酵液经过离心后的上清液为土黄色清亮液体。

样品扫描：使用液体杯加0.1mm镀金反射板扫描样品，扫描有效数据如表1所示。

表1

2.定标准曲线：

氨基葡萄糖发酵周期一般为60小时左右，根据氨基葡萄糖发酵特性，分成两个阶段，即30小时之前(发酵的前30小时)和30小时之后(发酵的后30小时)。

定标效果如表2、表3、图1、图2、图3所示(图1、2、3，主要表示实际测定的值和预测值的相关性，由这些图结果得出，相关性很高，可以用来检测和预测实验过程中的值)。

表2

表3

3.盲样验证准确度结果，如表4、表5所示。

从表中可看出，采用近红外快速测定与传统手工测定值验证相比，不论氨基葡萄糖还是残糖(以葡萄糖计)偏差都很小。

从ph和od值来看，ph近红外测定与手工测定几乎无偏差，od值近红外与手工值(紫外取样再测定)有较大偏差，但是从发酵理论来看，手工测定受样品取样部位、放置时间等影响因素较大，od值近红外与手工值测定两者之间要根据实际情况而定。理论上近红外预测结果误差为手工值误差的1.2-1.5倍，从盲样验证结果来看，使用fossds2500近红外光谱仪预测发酵液中各指标的标准偏差分别为：氨糖1.2，谷氨酸0.02，葡糖糖0.02，od值12.12，ph值0.05，满足误差要求。

od值偏差较大，分析原因为：od值测定为发酵液原液，而近红外光扫描为离心上清液，样品性状有变化，导致od值偏差加大，后续使用原液建立od定标，大大提高od的预测准确度，并且利用近红外快速测定能较为准确指导氨基葡萄糖的发酵补料工艺。

表4

表5

从以上结果可以看出，氨基葡萄糖的预测值与实测值存在非常大的相关性，说明使用近红外方法能快速预测发酵液中的氨糖含量变化趋势，提供生产决策所需要的数据信息。

实施例1：采用大肠杆菌基因工程菌发酵生产氨基葡萄糖，其中，发酵过程中，采用近红外快速测定方法(采用福斯近红外分析仪ds2500f测定)确定补糖工艺，补料工艺为：od600nm＝28时开始补糖(约6小时左右)，ph＝6.85恒定，葡萄糖底物浓度≤0.20g/l，控制菌体生长速率：每小时增加2.5光密度(即：od600nm值每小时的增加量为2.5)，至发酵结束(发酵结束3小时后，放罐)；最终发酵液中氨基葡萄糖浓度达到122g/l。

实施例2：采用大肠杆菌基因工程菌发酵生产氨基葡萄糖，其中，发酵过程中，采用近红外快速测定方法确定补糖工艺，补料工艺为：od600nm＝30开始补糖，ph＝6.90恒定，葡萄糖底物浓度≤0.15g/l，控制菌体生长速率：每小时增加2光密度，最终发酵液中氨基葡萄糖浓度达到127g/l。

实施例3：采用大肠杆菌基因工程菌发酵生产氨基葡萄糖，其中，发酵过程中，采用近红外快速测定方法确定补糖工艺，补料工艺为：od600nm＝32开始补糖，ph＝6.95恒定，葡萄糖底物浓度≤0.10g/l，控制菌体生长速率：每小时增加2光密度，最终发酵液中氨基葡萄糖浓度达到112g/l。

同时，与常规的补糖方法(常规的补糖方法是指：采用紫外分光光度法测定残糖浓度、菌体生长速率，然后在适当的od值开始补糖)进行对比，如表6所示。

表6

实施例4：采用大肠杆菌基因工程菌发酵生产氨基葡萄糖，其中，发酵过程中，采用近红外快速测定方法确定补糖工艺，补料工艺为：od600nm＝25开始补糖，ph＝6.85恒定，葡萄糖底物浓度≤0.10g/l，控制菌体生长速率：每小时增加2光密度，最终发酵液中氨基葡萄糖浓度达到134g/l。

上述虽然结合实施例对本发明的具体实施方式进行了描述，但并非对本发明保护范围的限制，所属领域技术人员应该明白，在本发明的技术方案的基础上，本领域技术人员不需要付出创造性劳动即可做出的各种修改或变形仍在本发明的保护范围以内。