本发明属于酶催化技术领域，具体涉及一种双酶一锅法合成2,3-二甲基-5烷氨基-1,4-苯醌的方法，即利用漆酶催化2,3-二甲基氢醌氧化生2,3-二甲基对苯醌，同时，在同一条件下脂肪酶催化2,3-二甲基对苯醌与脂肪伯胺发生成c-n交叉偶联反应，从而制得产物2,3-二甲基-5烷氨基-1,4-苯醌。
背景技术：
丝裂霉素是一类具有抗肿瘤活性的抗生素，其主要成员是丝裂霉素c(mitomycinc,mmc)，结构如式1所示。mmc抗肿瘤作用强，临床广泛用于胃、胰、结肠、直肠、乳腺、肺等部位的肿瘤的治疗,但毒副作用较大。丝裂霉素类化合物的抗肿瘤活性主要与其对苯醌母核结构有关，该类化合物合成的关键在于稳定的苯醌母核结构的形成和苯醌母核的氨基官能化。氨基对苯醌类化合物是丝裂霉素类似物，此类化合物的合成对于制备毒副作用小，安全性高的新型丝裂霉素类药物具有重要意义。
化学法合成丝裂霉素类化合物主要问题是选择性差、醌类化合物不稳定，操作不方便，且化学法反应步骤繁琐(jeffreym.schkeryantzandsamuelj.danishefsky,totalsynthesisof(a)-fr-90048,journaloftheam.chem.soc.1995,117,4722-4123)。尽管以伯胺和1,4-苯醌为原料可以合成相应的2,5二烷氨基/芳氨基-1,4苯醌(synthesis,structureandelectrochemicalpropertiesof2,5-bis(alkyl/arylamino)1,4-benzoquinonesand2-arylamino-1,4-naphthoquinones)，但苯醌价格较高，限制其大规模应用。酶催化法被认为是十分有潜力的环境友好的合成方法。漆酶(ec1.10.3.2)是一种含铜多酚氧化酶，可催化多种酚类和芳香胺类化合物及非酚类底物的氧化，并能耐受较苛刻的反应条件，已在食品、染织、有机合成、生物修复和药物合成等工业生物技术领域获得了广泛的应用。漆酶可以在较温和的条件下催化双酚类底物转化为相应稳定的苯醌，而苯醌中间体进一步和胺供体之间通过c-nmichael加成反应可生成氨基醌类化合物。尽管,单一漆酶可介导氨基醌类化合物的合成,但仍存在明显不足：选择性差,副产物多,产物收率较低。如herter等(susanneherter,dirkmichalik,annettmikolasch,etal.,j.mol.catal.b:enzym.2013,90:91–97.)利用嗜热毁丝霉漆酶催化1mol/l2-甲氧基-3-甲基对苯二酚和2mol/l辛胺的c-n偶联反应，得到氨基对苯醌，但收率较低，仅为32.9％。同时大约有30％副产物生成。
为了解决上述问题，我们进行了大量研究，发现漆酶催化酚氧化产生的对苯醌，对漆酶有较大产物抑制作用，严重影响其后续催化对苯醌与胺供体之间的c-n交叉偶联反应，是造成目前单一漆酶催化合成氨基醌类化合物效率较低的重要原因。因此，寻找有效的方法解决漆酶产物抑制问题是十分必要的。漆酶催化氢醌与胺供体合成氨基醌类化合物是包括酚氧化和c-n交叉偶联反应的一个典型的单酶催化的串联反应。多酶催化的串联反应是将多个反应条件相似的酶催化反应一锅法进行，将上一个酶促反应得到产物在合适的条件下用于下一个酶促反应。因此，寻找另外一种酶催化对苯醌与胺供体之间的c-n交叉偶联反应，将是解除对苯醌对漆酶的产物抑制的一条有效途径。
为此，本发明研究出了一条以交联漆酶/脂肪酶聚集体体系催化酚氧化/c-n交叉偶联串联反应制备2,3-二甲基-5烷氨基-1,4-苯醌的新方法，即利用漆酶催化2,3-二甲基氢醌1氧化生2,3-二甲基对苯醌，同时，在同一条件下，脂肪酶催化2,3-二甲基对苯醌与脂肪伯胺2发生成c-n交叉偶联反应，从而制得产物3。反应路线见式2。
技术实现要素：
本发明的目的是提供一种双酶一锅法合成2,3-二甲基-5烷氨基-1,4-苯醌的方法，以解决上述技术问题。
本发明的技术方案如下：
一种双酶一锅法合成2,3-二甲基-5烷氨基-1,4-苯醌的方法，具体步骤如下：向反应器中加入水互溶有机溶剂单相体系作为反应介质，并向其中加入2,3-二甲基氢醌和胺供体，使2,3-二甲基氢醌浓度为1.0-3.0mol/l，胺供体与2,3-二甲基氢醌摩尔比为1:1，加入双酶交联酶聚集体为催化剂进行反应制得产品，其中双酶交联酶聚集体的使用量为30-50g/mol氢醌。
所述水互溶有机溶剂单相体系为ph7.0磷酸盐缓冲液与5％(v/v)有机溶剂混合后形成的均相体系，所述有机溶剂为甲醇、异丙醇或二甲亚砜。
所述双酶交联酶聚集体为嗜热毁丝霉漆酶/黑曲酶脂肪酶双酶交联酶聚集体。
所述胺供体为正丙胺、正己胺、异丙胺或异辛胺。
所述反应于室温下，180rpm，通气量1.0-5.0vvm条件下进行2-5h。
如无特殊说明，本发明中所通气为无菌空气。
本发明还进一步包括后处理步骤，所述后处理为反应结束后滤出双酶交联酶聚集体，滤液经真空减压浓缩，用乙酸乙酯萃取产物。
所述萃取物用10％nahco3溶液洗涤，再用无水硫酸镁干燥，真空减压浓缩得粗产物，粗产物进一步用乙醇重结晶，得到红色晶体即为产物。
所述的嗜热毁丝霉漆酶/黑曲酶脂肪酶双酶交联酶聚集体的制备方法如下：将嗜热毁丝霉漆酶酶粉(≥800u/g)和黑曲酶脂肪酶酶粉(≥800u/g)混合物，用ph7.0缓冲液溶解，于4℃条件下150rpm慢速搅拌下加入硫酸铵,使其浓度为0.3-0.5kg/l,继续搅拌30min,再向此溶液中加入交联剂戊二醛，使其浓度为0.1-0.3％，交联1-2h，混合溶液于4℃,5000×g离心10min，去掉上清液，沉淀用去离子水洗涤，冷冻干燥，既得嗜热毁丝霉漆酶/黑曲酶脂肪酶双酶交联酶聚集体。
所述的嗜热毁丝霉漆酶/黑曲酶脂肪酶双酶交联酶聚集体的制备所加入的嗜热毁丝霉漆酶酶粉和黑曲酶脂肪酶酶粉的酶活力之比为1:10-1:5。
本发明采用的更具体的技术方案如下：
(1)制备嗜热毁丝霉漆酶/黑曲酶脂肪酶双酶交联酶聚集体。
将0.5-3.0kg嗜热毁丝霉漆酶酶粉(≥800u/g)和黑曲酶脂肪酶酶粉(≥800u/g)混合物(酶活力之比为1:10-1:5)，用3-20l的ph7.0磷酸盐缓冲液溶解，于4℃条件下150rpm慢速搅拌下加入硫酸铵使其浓度为0.3-0.5kg/l，继续搅拌30min，加入交联剂戊二醛使其浓度为0.1-0.3％，交联1-2h，混合溶液于4℃,5000×g离心10min，去掉上清液，沉淀用去离子水洗涤，冷冻干燥，即得嗜热毁丝霉漆酶/黑曲酶脂肪酶双酶交联酶聚集体。
(2)以上述嗜热毁丝霉漆酶/黑曲酶脂肪酶双酶交联酶聚集体为催化剂，交联酶聚集体的使用量为30-50g/mol氢醌。向带夹套搅拌反应器中加入反应介质，反应介质为水互溶有机溶剂单相体系，具体为ph7.0磷酸盐缓冲液与5％(v/v)有机溶剂混合后形成的均相体系，所述有机溶剂为甲醇、异丙醇或二甲亚砜。再向其中加入2,3-二甲基氢醌和胺供体，使2,3-二甲基氢醌浓度为1.0-3.0mol/l，胺供体与2,3-二甲基氢醌摩尔比为1:1，加入嗜热毁丝霉漆酶/黑曲酶脂肪酶双酶双酶交联酶聚集体为催化剂开始反应。反应于室温下，180rpm，通气量1.0-5.0vvm条件下进行2-5h。反应结束后滤出双酶交联酶聚集体，滤液经真空减压浓缩，用等体积乙酸乙酯萃取产物，萃取物用10％nahco3溶液洗涤，再用无水硫酸镁干燥，真空减压浓缩得粗产物，粗产物进一步用乙醇重结晶，得到红色晶体即为产物。用hplc分析产物组成。结果，氢醌转化率为95-97％，2,3-二甲基-5烷氨基-1,4-苯醌产率为92-95％。反应结束后滤出双酶交联酶聚集体，经乙酸乙酯、水洗涤后，可以重复使用8-12次。
本发明提供的方法能够利用嗜热毁丝霉漆酶/黑曲酶脂肪酶体系有效解决单一漆酶催化时存在的对苯醌产物抑制问题，即在脂肪酶存在下，脂肪酶催化对苯醌与胺供体之间的加成反应，有效降低了苯醌浓度，大幅度减少了对漆酶的抑制，从而大幅提高反应体系的催化效率。
本发明制备嗜热毁丝霉漆酶/黑曲酶脂肪酶双酶交联酶聚集体所用的酶，均有商品化酶供应，可方便的用于本发明的双酶交联酶聚集体的制备。
本发明的优点如下：
(1)原料简单，易得，避免使用价格较贵、不稳定的醌类原料；
(2)漆酶/脂肪酶协同催化，有效解决单一漆酶体系存在的对苯醌产物抑制问题，从而大幅提高反应体系的催化效率；
(3)本发明氢醌转化率为95-97％，2,3-二甲基-5烷氨基-1,4-苯醌产率为92-95％，远超现有制备方法的转化率和收率；
(4)本发明的方法较传统的化学法更安全、易操作同时反应条件更加温和，以嗜热毁丝霉漆酶/黑曲酶脂肪酶双酶交联酶聚集体为催化剂，酶催化剂制备简单，稳定性好，可多次重复使用，是一种绿色友好的2,3-二甲基-5烷氨基-1,4-苯醌合成方法。
具体实施方式
下面将对本发明实施例中的技术方案进行清楚、完整的描述。显然，所描述的实施例仅仅是本发明一部分实施例，而不是全部的实施例。基于本发明中的实施例，本领域普通技术人员在没有作出创造性劳动前提下所获得的所有其他实施例，都属于本发明保护的范围。
实施例1
一种双酶一锅法合成2,3-二甲基-5烷氨基-1,4-苯醌的方法，具体步骤如下：(1)制备嗜热毁丝霉漆酶/黑曲酶脂肪酶双酶交联酶聚集体，其过程如下：将1.0kg嗜热毁丝霉漆酶酶粉(≥800u/g)和黑曲酶脂肪酶酶粉(≥800u/g)混合物(酶活力之比为1:10)，用6l的ph7.0磷酸盐缓冲液溶解，于4℃条件下150rpm慢速搅拌下加入硫酸铵使其浓度为0.3kg/l，继续搅拌30min，加入交联剂戊二醛使其浓度为0.2％，交联2h，混合溶液于4℃,5000×g离心10min，去掉上清液，沉淀用去离子水洗涤，冷冻干燥，即得嗜热毁丝霉漆酶/黑曲酶脂肪酶双酶交联酶聚集体。
(2)以上述嗜热毁丝霉漆酶/黑曲酶脂肪酶双酶交联酶聚集体为催化剂，交联酶聚集体的使用量为30g/mol氢醌。向500l带夹套搅拌反应器中加入350l含5％(v/v)甲醇的ph7.0磷酸盐缓冲液，再向其中加入2,3-二甲基氢醌和胺供体，使2,3-二甲基氢醌浓度为1.0mol/l，胺供体与2,3-二甲基氢醌摩尔比为1:1，加入嗜热毁丝霉漆酶/黑曲酶脂肪酶双酶双酶交联酶聚集体为催化剂开始反应。反应于室温下，180rpm，通气量1.0vvm条件下进行3h。反应结束后滤出双酶交联酶聚集体，滤液经真空减压浓缩，用等体积乙酸乙酯萃取产物，萃取物用10％nahco3溶液洗涤，再用无水硫酸镁干燥，真空减压浓缩得粗产物，粗产物进一步用乙醇重结晶，得到红色晶体即为产物。用hplc分析产物组成。结果，氢醌转化率为95.5％，2,3-二甲基-5烷氨基-1,4-苯醌产率为92.8％。反应结束后滤出双酶交联酶聚集体，经乙酸乙酯、水洗涤后，可以重复使用10次。
实施例2
一种双酶一锅法合成2,3-二甲基-5烷氨基-1,4-苯醌的方法，具体步骤如下：(1)制备嗜热毁丝霉漆酶/黑曲酶脂肪酶双酶交联酶聚集体，其过程如下：将0.5kg嗜热毁丝霉漆酶酶粉(≥800u/g)和黑曲酶脂肪酶酶粉(≥800u/g)混合物(酶活力之比为1:9)，用3l的ph7.0磷酸盐缓冲液溶解，于4℃条件下150rpm慢速搅拌下加入硫酸铵使其浓度为0.5kg/l，继续搅拌30min，加入交联剂戊二醛使其浓度为0.3％，交联2h，混合溶液于4℃,5000×g离心10min，去掉上清液，沉淀用去离子水洗涤，冷冻干燥，即得嗜热毁丝霉漆酶/黑曲酶脂肪酶双酶交联酶聚集体。
(2)以上述嗜热毁丝霉漆酶/黑曲酶脂肪酶双酶交联酶聚集体为催化剂，交联酶聚集体的使用量为40g/mol氢醌。向带夹套搅拌反应器中加入反应介质，反应介质为水互溶有机溶剂单相体系，具体为ph7.0磷酸盐缓冲液与5％(v/v)有机溶剂混合后形成的均相体系，所述有机溶剂为甲醇、异丙醇或二甲亚砜。再向其中加入2,3-二甲基氢醌和胺供体，使2,3-二甲基氢醌浓度为3.0mol/l，胺供体与2,3-二甲基氢醌摩尔比为1:1，加入嗜热毁丝霉漆酶/黑曲酶脂肪酶双酶双酶交联酶聚集体为催化剂开始反应。反应于室温下，180rpm，通气量2.0vvm条件下进行4h。反应结束后滤出双酶交联酶聚集体，滤液经真空减压浓缩，用等体积乙酸乙酯萃取产物，萃取物用10％nahco3溶液洗涤，再用无水硫酸镁干燥，真空减压浓缩得粗产物，粗产物进一步用乙醇重结晶，得到红色晶体即为产物。用hplc分析产物组成。结果，氢醌转化率为96.6％，2,3-二甲基-5烷氨基-1,4-苯醌产率为94.3％。反应结束后滤出双酶交联酶聚集体，经乙酸乙酯、水洗涤后，可以重复使用8次。
实施例3
一种双酶一锅法合成2,3-二甲基-5烷氨基-1,4-苯醌的方法，具体步骤如下：(1)制备嗜热毁丝霉漆酶/黑曲酶脂肪酶双酶交联酶聚集体，其过程如下：将3.0kg嗜热毁丝霉漆酶酶粉(≥800u/g)和黑曲酶脂肪酶酶粉(≥800u/g)混合物(酶活力之比为1:5)，用20l的ph7.0磷酸盐缓冲液溶解，于4℃条件下150rpm慢速搅拌下加入硫酸铵使其浓度为0.4kg/l，继续搅拌30min，加入交联剂戊二醛使其浓度为0.1％，交联1h，混合溶液于4℃,5000×g离心10min，去掉上清液，沉淀用去离子水洗涤，冷冻干燥，即得嗜热毁丝霉漆酶/黑曲酶脂肪酶双酶交联酶聚集体。
(2)以上述嗜热毁丝霉漆酶/黑曲酶脂肪酶双酶交联酶聚集体为催化剂，交联酶聚集体的使用量为50g/mol氢醌。向带夹套搅拌反应器中加入反应介质，反应介质为水互溶有机溶剂单相体系，具体为ph7.0磷酸盐缓冲液与5％(v/v)有机溶剂混合后形成的均相体系，所述有机溶剂为甲醇、异丙醇或二甲亚砜。再向其中加入2,3-二甲基氢醌和胺供体，使2,3-二甲基氢醌浓度为2.0mol/l，胺供体与2,3-二甲基氢醌摩尔比为1:1，加入嗜热毁丝霉漆酶/黑曲酶脂肪酶双酶双酶交联酶聚集体为催化剂开始反应。反应于室温下，180rpm，通气量3.0vvm条件下进行4h。反应结束后滤出双酶交联酶聚集体，滤液经真空减压浓缩，用等体积乙酸乙酯萃取产物，萃取物用10％nahco3溶液洗涤，再用无水硫酸镁干燥，真空减压浓缩得粗产物，粗产物进一步用乙醇重结晶，得到红色晶体即为产物。用hplc分析产物组成。结果，氢醌转化率为97％，2,3-二甲基-5烷氨基-1,4-苯醌产率为94.8％。反应结束后滤出双酶交联酶聚集体，经乙酸乙酯、水洗涤后，可以重复使用12次。
实施例4
一种双酶一锅法合成2,3-二甲基-5烷氨基-1,4-苯醌的方法，具体步骤如下：(1)制备嗜热毁丝霉漆酶/黑曲酶脂肪酶双酶交联酶聚集体，其过程如下：将2.0kg嗜热毁丝霉漆酶酶粉(≥800u/g)和黑曲酶脂肪酶酶粉(≥800u/g)混合物(酶活力之比为1:8)，用12l的ph7.0磷酸盐缓冲液溶解，于4℃条件下150rpm慢速搅拌下加入硫酸铵使其浓度为0.3-0.5kg/l，继续搅拌30min，加入交联剂戊二醛使其浓度为0.1-0.3％，交联1-2h，混合溶液于4℃,5000×g离心10min，去掉上清液，沉淀用去离子水洗涤，冷冻干燥，即得嗜热毁丝霉漆酶/黑曲酶脂肪酶双酶交联酶聚集体。
(2)以上述嗜热毁丝霉漆酶/黑曲酶脂肪酶双酶交联酶聚集体为催化剂，交联酶聚集体的使用量为30-50g/mol氢醌。向带夹套搅拌反应器中加入反应介质，反应介质为水互溶有机溶剂单相体系，具体为ph7.0磷酸盐缓冲液与5％(v/v)有机溶剂混合后形成的均相体系，所述有机溶剂为甲醇、异丙醇或二甲亚砜。再向其中加入2,3-二甲基氢醌和胺供体，使2,3-二甲基氢醌浓度为1.0-3.0mol/l，胺供体与2,3-二甲基氢醌摩尔比为1:1，加入嗜热毁丝霉漆酶/黑曲酶脂肪酶双酶双酶交联酶聚集体为催化剂开始反应。反应于室温下，180rpm，通气量1.0-5.0vvm条件下进行2-5h。反应结束后滤出双酶交联酶聚集体，滤液经真空减压浓缩，用等体积乙酸乙酯萃取产物，萃取物用10％nahco3溶液洗涤，再用无水硫酸镁干燥，真空减压浓缩得粗产物，粗产物进一步用乙醇重结晶，得到红色晶体即为产物。用hplc分析产物组成。结果，氢醌转化率为95-97％，2,3-二甲基-5烷氨基-1,4-苯醌产率为92-95％。反应结束后滤出双酶交联酶聚集体，经乙酸乙酯、水洗涤后，可以重复使用8-12次。
实施例5
一种双酶一锅法合成2,3-二甲基-5烷氨基-1,4-苯醌的方法，具体步骤如下：(1)制备嗜热毁丝霉漆酶/黑曲酶脂肪酶双酶交联酶聚集体，其过程如下：将1.5kg嗜热毁丝霉漆酶酶粉(≥800u/g)和黑曲酶脂肪酶酶粉(≥800u/g)混合物(酶活力之比为1:7)，用10l的ph7.0磷酸盐缓冲液溶解，于4℃条件下150rpm慢速搅拌下加入硫酸铵使其浓度为0.4kg/l，继续搅拌30min，加入交联剂戊二醛使其浓度为0.25％，交联2h，混合溶液于4℃,5000×g离心10min，去掉上清液，沉淀用去离子水洗涤，冷冻干燥，即得嗜热毁丝霉漆酶/黑曲酶脂肪酶双酶交联酶聚集体。
(2)以上述嗜热毁丝霉漆酶/黑曲酶脂肪酶双酶交联酶聚集体为催化剂，交联酶聚集体的使用量为45g/mol氢醌。向带夹套搅拌反应器中加入反应介质，反应介质为水互溶有机溶剂单相体系，具体为ph7.0磷酸盐缓冲液与5％(v/v)有机溶剂混合后形成的均相体系，所述有机溶剂为甲醇、异丙醇或二甲亚砜。再向其中加入2,3-二甲基氢醌和胺供体，使2,3-二甲基氢醌浓度为2.5mol/l，胺供体与2,3-二甲基氢醌摩尔比为1:1，加入嗜热毁丝霉漆酶/黑曲酶脂肪酶双酶双酶交联酶聚集体为催化剂开始反应。反应于室温下，180rpm，通气量4.0vvm条件下进行5h。反应结束后滤出双酶交联酶聚集体，滤液经真空减压浓缩，用等体积乙酸乙酯萃取产物，萃取物用10％nahco3溶液洗涤，再用无水硫酸镁干燥，真空减压浓缩得粗产物，粗产物进一步用乙醇重结晶，得到红色晶体即为产物。用hplc分析产物组成。结果，氢醌转化率为97％，2,3-二甲基-5烷氨基-1,4-苯醌产率为95％。反应结束后滤出双酶交联酶聚集体，经乙酸乙酯、水洗涤后，可以重复使用12次。
实施例6
一种双酶一锅法合成2,3-二甲基-5烷氨基-1,4-苯醌的方法，具体步骤如下：(1)制备嗜热毁丝霉漆酶/黑曲酶脂肪酶双酶交联酶聚集体，其过程如下：将2.0kg嗜热毁丝霉漆酶酶粉(≥800u/g)和黑曲酶脂肪酶酶粉(≥800u/g)混合物(酶活力之比为1:6)，用3-20l的ph7.0磷酸盐缓冲液溶解，于4℃条件下150rpm慢速搅拌下加入硫酸铵使其浓度为0.3-0.5kg/l，继续搅拌30min，加入交联剂戊二醛使其浓度为0.3％，交联1h，混合溶液于4℃,5000×g离心10min，去掉上清液，沉淀用去离子水洗涤，冷冻干燥，即得嗜热毁丝霉漆酶/黑曲酶脂肪酶双酶交联酶聚集体。
(2)以上述嗜热毁丝霉漆酶/黑曲酶脂肪酶双酶交联酶聚集体为催化剂，交联酶聚集体的使用量为50g/mol氢醌。向带夹套搅拌反应器中加入反应介质，反应介质为水互溶有机溶剂单相体系，具体为ph7.0磷酸盐缓冲液与5％(v/v)有机溶剂混合后形成的均相体系，所述有机溶剂为甲醇、异丙醇或二甲亚砜。再向其中加入2,3-二甲基氢醌和胺供体，使2,3-二甲基氢醌浓度为1.5mol/l，胺供体与2,3-二甲基氢醌摩尔比为1:1，加入嗜热毁丝霉漆酶/黑曲酶脂肪酶双酶双酶交联酶聚集体为催化剂开始反应。反应于室温下，180rpm，通气量3.0vvm条件下进行4h。反应结束后滤出双酶交联酶聚集体，滤液经真空减压浓缩，用等体积乙酸乙酯萃取产物，萃取物用10％nahco3溶液洗涤，再用无水硫酸镁干燥，真空减压浓缩得粗产物，粗产物进一步用乙醇重结晶，得到红色晶体即为产物。用hplc分析产物组成。结果，氢醌转化率为96.8％，2,3-二甲基-5烷氨基-1,4-苯醌产率为95％。反应结束后滤出双酶交联酶聚集体，经乙酸乙酯、水洗涤后，可以重复使用11次。