褶纹冠蚌MafK蛋白及其编码序列和探针的制作方法

本发明涉及褶纹冠蚌环境胁迫响应过程中的一种重要的转录调控蛋白及其编码基因和探针，具体涉及一种褶纹冠蚌转录因子蛋白mafk及其编码基因和探针。

背景技术：

褶纹冠蚌(cristariaplicata)俗称鸡冠蚌、湖蚌、绵蚌、水蚌等，为蚌科、冠蚌属，淡水底栖贝类，是我国水产养殖中著名的淡水育珠蚌，具有很大的经济价值。然而近年来随着集约化养殖的发展和环境恶化，由病原体，化学物质引起的各种疾病频繁发生于褶纹冠蚌的养殖群体中，对其育珠能力产生了极大的影响。贝类属无脊椎软体动物，在体内缺乏t淋巴细胞和免疫球蛋白等特异抗体，其免疫主要靠细胞的吞噬作用，但在吞噬病原体的过程中同时会伴随着呼吸爆发，产生大量有强杀伤性的活性氧(ros)，造成宿主本身的氧化损伤。

maf家族蛋白作为重要的转录调控因子，参与细胞众多生命进程，在抗肿瘤、神经保护、抗炎性反应等方面具有广泛的细胞保护功能。。它能和其他具有转录活性的b-zip蛋白结合，如ap-1家族蛋白c-fos、c-jun，creb(campresponsiveelementbindingprotein)及cnc(cap-n.collar)家族蛋白nf-e2的大亚基p45、nrf1和nrf2等。它既可作为这些转录因子的伴侣蛋白形成异源二聚体与dna上的相应的反应元件结合，促进基因的转录，又可以自身形成同源二聚体作为转录的抑制者、抑制基因转录，从而调节机体的氧化平衡。

近年来，maf蛋白的调控机制在脊椎动物起着重要的调控作用并已发挥相应的诊断功能，如专利公开号cn104995313a公开了一种“使用c-maf的前列腺癌转移的诊断、预后和治疗的方法”，c-maf基因作为原发性肿瘤样品中是否被扩增的标志。然而在贝类免疫研究中maf蛋白的克隆、表达模式及功能作用尚不清楚，其作为免疫功能的相关指示基因功能标志也未见报道。

技术实现要素：

本发明的目的在于填补无脊椎动物贝类mafk基因的克隆、表达模式分析以及褶纹冠蚌mafk蛋白的空白，提供了一种褶纹冠蚌转录调控因子mafk蛋白，本发明还提供了一种编码上述蛋白质的核酸序列以及检测所述核酸序列的探针；本发明公开了褶纹冠蚌mafk蛋白组织表达情况以及经毒素刺激后的应急表达情况；并通过原核表达及启动子克隆技术，使用凝胶阻滞实验证明了mafk蛋白对下游gst启动子序列的识别作用及亲和性。从而为解毒和抗氧化免疫调控提供了理论基础，具有很大的应用价值。

在发明的前期研究中，通过转录组学及蛋白质组学的比较分析数据，筛选到褶纹冠蚌mafk蛋白在转录和蛋白水平层面对毒素刺激均具有积极的响应，随后又通过实时荧光定量技术进行证实褶纹冠蚌mafk蛋白在褶纹冠蚌免疫防御过程中起着重要的调控作用。

本发明的目的是通过以下技术方案实现的：

第一方面，本发明提供了一种褶纹冠蚌mafk蛋白，其特征是，包括如下(a)或(b)的蛋白质：

(a)由如seqidno.4所示的氨基酸序列组成的蛋白质；

(b)seqidno.4所示的氨基酸序列经过取代、缺失或者添加一个或几个氨基酸且具有褶纹冠蚌mafk蛋白活性的由(a)衍生的蛋白质。

优选的，所述蛋白质为seqidno.4所示氨基酸序列经过1～50个氨基酸的缺失、插入、取代，或者在c末端/n末端添加1～20个以内氨基酸而得到的序列。

进一步优选的，所述蛋白质为seqidno.4所示氨基酸序列中1～10个氨基酸被性质相似或相近的氨基酸所替换而形成的序列。

第二方面，本发明提供了一种编码上述褶纹冠蚌mafk蛋白的核酸序列，其特征是，所述核酸序列具体为：

(a)碱基序列如seqidno.3第1～570位所示；

或(b)与seqidno.3第1～570位所示的核酸有至少70％的同源性的序列；

或(c)能与seqidno.3第1～570位所示的核酸进行杂交的序列。

优选的，所述核酸序列具体为seqidno.3第1～570位所示的核酸序列中1～90个核苷酸的缺失、插入、取代或者在5’和3’端添加60个以内核苷酸形成的序列。

第三方面，发明还提供了一种检测上述褶纹冠蚌mafk蛋白核酸序列的探针，所述探针为包含有所述核酸序列8～100个连续核苷酸的核酸分子，该探针可用于检测样品中是否存在编码褶纹冠蚌mafk蛋白相关的核酸分子。

第四方面，一种扩增所述褶纹冠蚌mafk蛋白的核酸序列的特异性引物对，其特征是，所述引物对如下所示：

orf-f(seqidno.9)：5’-atgagtaaaaagattttcttgtcac-3’，

orf-r(seqidno.10)：5’-tcagtttctgactaaattcacactt-3’.

第五方面，本发明还提供上述褶纹冠蚌蛋白编码基因的应用，所述基因的碱基序列如seqidno.3第1～570位所示，所述的应用包括改善贝类的抗氧化及解毒能力。

在本发明中，“分离的dna”、“纯化的dna”是指，该dna或片段已从天然状态下位于其两侧的序列中分离出来，还指该dna或片段已经与天然状态下伴随核酸的组分分开，而且已经与在细胞中相伴随的蛋白质分开。

本发明中，术语“褶纹冠蚌mafk蛋白编码序列”指编码具有褶纹冠蚌mafk蛋白活性的多肽的核苷酸序列，如seqidno.3所示的第1～570核酸序列及其简并序列。该简并序列是指，位于seqidno.3所示的第1～570核酸中，有一个或多个密码子被编码相同氨基酸的简并密码子所取代后而产生的序列。由于密码子的简并性，所以与seqidno.3所示的第1～570核酸序列同源性低至约70％的简并序列也能编码出seqidno.4所示的序列。该术语还包括与seqidno.3所示的核苷酸序列的同源性至少70％的核苷酸序列。

该术语还包括能编码天然褶纹冠蚌mafk蛋白的相同功能：seqidno.3所示序列的变异形式。这些变异形式包括(但并不限于)：通常为1～90个核苷酸的缺失、插入、取代以及在5’或3’端添加为60个以内核苷酸。

在本发明中，术语“褶纹冠蚌mafk蛋白”指具有褶纹冠蚌mafk蛋白活性的seqidno.4所示序列的多肽。该术语还包括具有与褶纹冠蚌mafk蛋白相同功能的、seqidno.4序列的变异形式。这些变异形式包括(但并不限于)：通常为1～50个氨基酸的缺失、插入、取代以及在c末端或n末端添加一个或为20个以内氨基酸。例如，在本领域中，用性能相近或相似的氨基酸进行取代时，通常不会改变蛋白质的功能。又比如，在c末端或n末端添加一个或数个氨基酸通常也不会改变蛋白质的功能。该术语还包括褶纹冠蚌mafk蛋白的活性片段和活性衍生物。

本发明的褶纹冠蚌mafk蛋白的变异形式包括：同源序列、保守性变异体、等位变异体、天然突变体、诱导突变体、在高或低的严谨条件下能与褶纹冠蚌mafk蛋白相关dna杂交的dna所编码的蛋白以及利用褶纹冠蚌mafk蛋白的抗血清获得的多肽或蛋白。

在本发明中，“褶纹冠蚌mafk蛋白保守性变异多肽”指与seqidno.4所示的氨基酸序列相比，有至多10个氨基酸被性质相似或相近的氨基酸所替换而形成多肽。这些保守性变异多肽最好根据表1进行替换而产生。

表1氨基酸替换表

本发明还包括褶纹冠蚌mafk蛋白或多肽的类似物。这些类似物与褶纹冠蚌mafk蛋白相关多肽的差别可以是氨基酸序列上的差异，也可以是不影响序列的修饰形式上的差异，或者兼而有之。这些多肽包括天然或诱导的遗传变异体。诱导变异体可以通过各种技术得到，如通过辐射或暴露于诱变剂而产生随机诱变，还可通过定点诱变法或其他已知分子生物学的技术。类似物还包括具有不同于天然l-氨基酸的残基(如d-氨基酸)的类似物，以及具有非天然存在的或合成的氨基酸(如β、γ-氨基酸)的类似物。应理解，本发明的多肽并不限于上述列举的代表性的多肽。

修饰(通常不改变一级结构)形式包括：体内或体外的多肽的化学衍生形式如乙酰化或羧基化。修饰还包括糖基化，如那些在多肽的合成和加工中或进一步加工步骤中进行糖基化修饰而产生的多肽。这种修饰可以通过将多肽暴露于进行糖基化的酶(如哺乳动物的糖基化酶或去糖基化酶)而完成。修饰形式还包括具有磷酸化氨基酸残基(如磷酸酪氨酸，磷酸丝氨酸，磷酸苏氨酸)的序列。还包括被修饰从而提高了其抗蛋白水解性能或优化了溶解性能的多肽。

在本发明中，用实时荧光定量pcr的方法分析mafk蛋白基因在褶纹冠蚌各组织中的生理效应表达模式，即分析mafk蛋白基因在褶纹冠蚌中的mrna转录物的存在与否和数量。并经微囊藻毒素胁迫后检测mafk蛋白基因在血淋巴及肝胰脏组织中的表达变化。

本发明检测样品中是否存在褶纹冠蚌mafk蛋白相关核苷酸序列的检测方法，包括用上述的探针与样品进行杂交，然后检测探针是否发生了结合。该样品是pcr扩增后的产物，其中pcr扩增引物对应于褶纹冠蚌mafk蛋白相关核苷酸编码序列，并可位于该编码序列的两侧或中间。引物长度一般为15～50个核苷酸。

此外，根据本发明的褶纹冠蚌mafk蛋白的核苷酸序列和氨基酸序列，可以在核酸同源性或表达蛋白质的同源性基础上，筛选褶纹冠蚌mafk蛋白相关同源基因或同源蛋白。

为了得到与褶纹冠蚌mafk蛋白相关基因的点阵，可以用dna探针筛选褶纹冠蚌cdna文库，这些探针是在低严谨条件下，用³²p对褶纹冠蚌mafk蛋白相关的全部或部分做放射活性标记而得的。适合于筛选的cdna文库是来自褶纹冠蚌的文库。构建来自感兴趣的细胞或者组织的cdna文库的方法是分子生物学领域众所周知的。这种筛选方法可以识别与褶纹冠蚌mafk蛋白相关的基因家族的核苷酸序列。

本发明的褶纹冠蚌mafk蛋白相关核苷酸全长序列或其片段通常可以用pcr扩增法、重组法或人工合成的方法获得。对于pcr扩增法，可根据本发明所公开的有关核苷酸序列，尤其是开放阅读框序列来设计引物，并用市售的cdna库或按本领域技术人员已知的常规方法所制备的cdna库作为模板，扩增而得有关序列。

当获得了有关序列后，就可以用重组法来大批量地获得有关序列。这通常是将其克隆入载体，再转入细胞，然后通过常规方法从增殖后的宿主细胞中分离得到有关序列。

此外，还可通过化学合成将突变引入本发明蛋白序列中。

除了用重组法产生之外，本发明蛋白的片段还可用固相技术，通过直接合成肽而加以生产。在体外合成蛋白质可以用手工或自动进行。例如，可以用appliedbiosystems的431a型肽合成仪(fostercity，ca)来自动合成肽。可以分别化学合成本发明蛋白的各片段，然后用化学方法加以连接以产生全长的分子。

利用本发明的褶纹冠蚌mafk蛋白通过各种常规筛选方法，可筛选出与mafk蛋白相关发生相互作用的物质，或抑制剂与拮抗剂等。

褶纹冠蚌是我国重要的淡水育珠蚌，具有很大的经济价值，又可以作为人类的食材，其市场需求越来越大。

与现有技术相比，本发明具有如下的有益效果：

本发明首次克隆褶纹冠蚌mafk蛋白的编码序列，并通过实时荧光定量pcr技术检测其在生理条件下各组织中及毒素胁迫后在血淋巴及肝胰脏中的表达情况。通过原核表达及下游基因gst启动子的克隆，使用凝胶阻滞实验又证明了mafk蛋白对下游解毒基因启动子序列的识别作用及亲和性。本发明为褶纹冠蚌等淡水育珠蚌的相关免疫功能的发生提供了指示依据，为珍珠蚌辅助育种和疾病防治研究奠定了理论和应用基础。

附图说明

图1为本发明褶纹冠蚌mafk基因扩增结果示意图，图中m：dl2000marker，1：pcr产物。

图2为本发明的褶纹冠蚌mafk蛋白氨基酸序列与其他11种maf蛋白同源序列的比对结果，1：sumo保守序列，2：extendedhomology区域，3：碱性活性区域(包含亮氨酸拉链)，4：核定位信号基序，▲标注的为保守的亮氨酸残基。

图3为mafk基因在褶纹冠蚌不同组织中的表达情况。

图4为微囊藻毒素胁迫后mafk基因在褶纹冠蚌血淋巴及肝胰脏组织中的表达情况。

图5为sds-page鉴定褶纹冠蚌mafk蛋白重组质粒在e.colirossetta中的表达，图中m：premixedproteinmarker(low)，1：rossetta/pet-32a(+)-mafk诱导0h，2：rossetta/pet-32a(+)-mafk诱导2h，3：rossetta/pet-32a(+)-mafk诱导4h，4：rossetta/pet-32a(+)-mafk诱导6h，5：rossetta/pet-32a(+)-mafk诱导8h，6：pet-32a(+)-mafk诱导后重组质粒的超声上清、7：pet-32a(+)-mafk诱导后重组质粒的超声沉淀。

图6为褶纹冠蚌mafk蛋白纯化结果示意图，图中m：premixedproteinmarker(low)，1-4：纯化后重组蛋白。

图7为褶纹冠蚌mafk重组蛋白浓度测定结果(注：根据实验中记录的吸光值得到的bsa标准曲线方程y＝0.0209x-0.0547，根据测定得到的样品od595值计算蛋白含量，按照公式：蛋白的浓度＝蛋白含量/所加的样品体积计算出重组蛋白浓度为0.719mg/ml)。

图8为两个sigma型gst启动子序列作用原件的预测图，其中“are”为mafk蛋白识别结合位点。

图9为mafk蛋白与gst启动子序列亲和性分析结果，图中m：dnaladdermaker，1-5为凝胶阻滞系统：20ng启动子序列分别加0、0.2、0.4、0.8、1.0μgmafk蛋白。

具体实施方式

下面结合具体实施例，进一步阐述本发明。这些实施例仅用于说明本发明而不用于限制本发明的范围。下列实施例中未注明具体条件的实验方法，通常按照常规条件。应当指出的是，对本领域的普通技术人员来说，在不脱离本发明构思的前提下，还可以做出若干变形和改进。

实施例1：褶纹冠蚌mafk基因的克隆

1.实验材料的获得

选取健康的褶纹冠蚌，在水族箱中持续充氧暂养1周，取血淋巴组织，用于提取rna。

2.rna的抽提

参照trizol提取试剂盒说明书的方法，抽提总rna，用1％琼脂糖电泳检测rna的完整性，然后用分光光度计(thermoscientificnanodrop1000spectrophotometer)上测定rna的纯度及浓度。

3.基因的全场克隆

根据褶纹冠蚌转录组测序(rna-seq)的蛋白功能注释结果，筛选获得褶纹冠蚌mafk基因核心片段。采用race方法进行cdna全长克隆，分三个阶段进行：

(1)rcr获得基因中间片段

将mafka蛋白基因核心片段通过在ncbi网站进行blast(http：//blast.ncbi.nlm.nih.gov/)比对已有的数据库(genbank)，知其核酸序列及编码蛋白与已知的mafk蛋白基因的同源性很高，初步认为它是一个mafk基因。

mafk-f1：5’-gaacccagtacgaagccatca-3’(seqidno.1)

mafk-r1：5’-gacgtgaatggtgcatatggtt-3’(seqidno.2)

以上述引物对mafk基因核心片段进行扩增，得到382bp片段。回收并连接到pmd18-t载体上，转化大肠杆菌dh5a感受态，并送上海生工进行测序。

(2)3’末端的扩增

以3’racesmartcdna为模板，二轮巢式pcr完成3’末端序列的扩增。

第一轮：upm+mafk-f2：5’-gtgatgaaagcagggtatgaactg-3’(seqidno.5)

第二轮：nup+mafk-f3：5’-ccaccaggtgctaatcaaagatttg-3’(seqidno.6)

upm和nup为试剂盒提供。3’race得到褶纹冠蚌mafk基因的3’末端序列(527bp)，连接到pmd18-t载体后用同步骤(1)一样进行测序。

(3)5’末端的扩增

以5’racesmartcdna为模板，二轮巢式pcr完成5’末端序列的扩增。

第一轮：upm+mafk-r2：5’-tttggtgatggcttcgtactg-3’(seqidno.7)

第二轮：nup+mafk-r3：5’-gtacttcgtcgtttcactaaatcctg-3’(seqidno.8)

upm和nup为试剂盒提供。5’race得到褶纹冠蚌mafk基因的5’末端序列(1261bp)，连接到pmd18-t载体后用同步骤(1)一样进行测序。

将通过上述步骤1-3方法获得的序列的测序结果进行拼接，将拼接序列提交blast分析，结果证明从褶纹冠蚌中新得到的的确为一个mafk的基因，将测序拼接结果结合ncbi的orf(openreadingframe)finder(https：//www.ncbi.nlm.nih.gov/orffinder/)预测，找到了mafk基因的起始密码子与终止密码子。根据获得的序列，分别从起始密码子和终止密码子处设计特异性引物，对orf区进行扩增：

orf-f(seqidno.9)：5’-atgagtaaaaagattttcttgtcac-3’，(seqidno.9)

orf-r(seqidno.10)：5’-tcagtttctgactaaattcacactt-3’(seqidno.10)

如图1所示，以褶纹冠蚌cdna为模板进行pcr，扩增得到570bp编码褶纹冠蚌mafk蛋白的全长编码序列(seqidno.3)。

实施例2：褶纹冠蚌mafk基因的序列信息与同源性分析

本发明的褶纹冠蚌mafk基因全长开放读码框序列为570bp，详细序列见seqidno.3所示序列。根据开放读码框序列推导出褶纹冠蚌mafk蛋白的氨基酸序列，共189个氨基酸残基，分子量为21.92kda，等电点(pi)为9.56，详细序列见seqidno.4所示序列。

clustalx软件比对结果表明各序列同源保守性在54～63％，包括四个保守的氨基酸基序：sumo保守序列、extendedhomology区域、碱性活性区域(包含亮氨酸拉链)和核定位信号基序，还包括5个保守的亮氨酸残基(图2)。

由此可见，褶纹冠蚌mafk基因与其它已知物种的maf蛋白基因存在较高的同源性。

实施例3：褶纹冠蚌mafk基因mrna水平的实时定量表达

1.生理条件下褶纹冠蚌mafk基因在各组织中中的表达

选取健康的褶纹冠蚌，按实施例1的方法提取每个蚌的血淋巴、肝胰脏、腮、外套膜和闭壳肌的总rna，并反转成所需的cdna进行实时定量分析(图3)。

实时定量pcr中mafk基因定量引物：

rt-mafk-f：5’-agaatgatgtggtcagaatgg-3’(seqidno.11)

rt-mafk-r：5’-aagatgaggacgtgaatggt-3’(seqidno.12)

内参基因为：

β-actin-f：5’-cttgacttggcaggtagaga-3’(seqidno.13)

β-actin-r：5’-cagacagcacagtgttagca-3’(seqidno.14)

2.微囊藻毒素胁迫后褶纹冠蚌mafk基因在血淋巴和肝胰脏组织中的表达变化

选取健康的褶纹冠蚌，随机分为对照组和实验组俩组。对照组每只褶纹冠蚌闭壳肌注射0.1ml的0.8％生理盐水，实验组每只蚌注射200μg微囊藻毒素(溶于0.1ml的0.8％生理盐水)。分别在0、3、6、12、24、48h在对照组和实验组各取4只蚌。按实施例1的方法提取总rna。反转为所需的cdna进行实时定量分析(图4)。

3.数据处理和统计分析

本实施例中的测定每次取4个重复样，每次测定均有3次重复。统计分析采用spssstatistics13.0软件进行统计学处理，数据以平均值±s.d计算。当p值低于0.05时，差异被认为是统计学显着的。

由此可见，褶纹冠蚌mafk基因在被检测的组织中均有表达，而在肝胰脏组织中表达量最高，肝胰脏是软体动物免疫防御的重要组织。经微囊藻毒素胁迫后，在血淋巴及肝胰脏组织中表达量均有上升，说明褶纹冠蚌可以通过调控应急反应来抵御外界的毒素胁迫。

实施例4：褶纹冠蚌mafk基因原核表达及蛋白纯化

1.目的基因表达载体的构建

根据本发明之前获得的褶纹冠蚌mafk基因orf核酸序列，通过prime5.0软件设计表达引物：上游引物cgcggatccatgagtaaaaagattttcttgtcac(seqidno.15)，下划线所标为bamhi酶切位点；下游引物ccgctcgagtcagtttctgactaaattcacactt(seqidno.16)，下划线所标为xhoi酶切位点，该引物的退火温度为58℃。首先将褶纹冠蚌mafk基因连接至中间载体(pmd18-t)中进行测序，再将测出正确的mafk基因的编码区序列进一步克隆到表达载体(pet-32a)中。

2.重组蛋白的诱导表达

将测序正确的重组质粒转化rossetta(de3)感受态中，涂布于含kana⁺和氯霉素抗性的固体lb培养基中，37℃培养过夜，挑取单克隆菌落，pcr检测，将筛选到的含阳性克隆的rossetta(de3)菌株接种到含有kana⁺和氯霉素抗性的lb液体培养基内，在37℃，200rpm/min条件下培养至od600为0.5～0.6时，加入iptg至终浓度为1.0mmol/l，以相同条件继续振荡培养8h(图5)。

3.重组蛋白的纯化

将收集得到的菌体重悬于裂解缓冲液(20mmol/l磷酸盐，0.5mol/l氯化钠，ph7.4)缓冲液重悬，超声裂菌(功率70w，破2s停2s，超声15min，冰浴)后收集上清。将上清流过已经平衡好的(his)镍离子亲和层析预装柱，第一步：10倍柱体积的1×bindingbuffer(300mmol/lnacl，50mmol/lnah2po4，10mmol/l咪唑)洗涤柱子；第二步：6倍柱体积的1×washingbuffer(300mmol/lnacl，50mmol/lnah2po4，50mmol/l咪唑)洗脱杂蛋白；第三步：6倍柱体积的1×elutebuffer(300mmol/lnacl，50mmol/lnah2po4，300mm咪唑)洗脱目的蛋白；第四步：用sds-page电泳分析各管收集液(图6)，将含有目的蛋白的收集液合并在一起置于透析袋，用聚乙二醇20000浓缩，得到纯化的噬菌体型溶菌酶重组蛋白，检测重组蛋白浓度达到0.76mg/ml(图7)。

实施例5：褶纹冠蚌mafk蛋白与下游解毒基因gst启动子序列的亲和性分析

1.褶纹冠蚌2个sigma型gst启动子序列的克隆

设计褶纹冠蚌gst启动子引物gst-pro-f1：

5’-tcacataaaggtcaagtaagatcc-3’(seqidno.17)

和gst-pro-r1：acccttgctcattttctgtaa(seqidno.18)；

gst-pro-f2：aatgtattgatgctagaattg(seqidno.19)

和gst-pro-r2：cgcaaacaaaatacgggcaggt(seqidno.20)

pcr扩增获得褶纹冠蚌俩个启动子序列(图8)，图中标出的are为mafk蛋白的识别结合位点，还标出了转录起始位点及其它作用元件。

2.凝胶阻滞实验

将20ng的启动子片段与不同浓度梯度(0、0.2、0.4、0.8、1.0μg)的mafk蛋白冰上孵育30min，低压电泳进行凝胶阻滞实验(图9)。两个gst启动子序列证中找到了mafk蛋白的识别的are作用原件，并通过凝胶阻滞实验检测证明了mafk蛋白可以识别并结合gst启动子序列，从而证明mafk蛋白可以通过调控下游解毒基因的转录，对褶纹冠蚌的免疫血研究具有重要的作用。

sequencelisting

<110>南昌大学

<120>褶纹冠蚌mafk蛋白及其编码序列和探针

<130>ncu1103

<160>20

<170>patentinversion3.5

<210>1

<211>21

<212>dna

<213>人工序列

<400>1

gaacccagtacgaagccatca21

<210>2

<211>22

<212>dna

<213>人工序列

<400>2

gacgtgaatggtgcatatggtt22

<210>3

<211>570

<212>dna

<213>褶纹冠蚌（cristariaplicata）

<400>3

atgagtaaaaagattttcttgtcacatgtgaagtcagagggtttgtgcaatatatcttcg60

gaacccagtacgaagccatcaccaaatgtaacagatgatgaactggttgccctttcagtg120

aaggagctcaacaagctcctcaaaggactgaaccgcgaggatgtccaaaagcttaaacag180

cgtcggagaaccctaaaaaacagaggctatgctgctaactgtcgagagaaaaggatctca240

caaaaggaagaactggaaggagaaaaggacagattacgcgaggaagtacacagacttcag300

cgggagaatgatgtggtcagaatggaacttaattcgctgaaaagcagatatgatgcactt360

caaagatttgcagaagcaaataaaattcacgttttaacagcgcaacccctttatttgggg420

aaccatatgcaccattcacgtcctcatcttcctcttgaatccatgcgtacagaacccatg480

catcacgagtctgtcattgttaaagcagaaccccacacggagcacaaaagtgtaggacat540

ttctcaagtgtgaatttagtcagaaactga570

<210>4

<211>189

<212>prt

<213>褶纹冠蚌（cristariaplicata）

<400>4

metserlyslysilepheleuserhisvallyssergluglyleucys

151015

asnilesersergluproserthrlysproserproasnvalthrasp

202530

aspgluleuvalalaleuservallysgluleuasnlysleuleulys

354045

glyleuasnarggluaspvalglnlysleulysglnargargargthr

505560

leulysasnargglytyralaalaasncysargglulysargileser

65707580

glnlysglugluleugluglyglulysaspargleuargglugluval

859095

hisargleuglnarggluasnaspvalvalargmetgluleuasnser

100105110

leulysserargtyraspalaleuglnargphealaglualaasnlys

115120125

ilehisvalleuthralaglnproleutyrleuglyasnhismethis

130135140

hisserargprohisleuproleuglusermetargthrglupromet

145150155160

hishisgluservalilevallysalagluprohisthrgluhislys

165170175

servalglyhispheserservalasnleuvalargasn

180185

<210>5

<211>24

<212>dna

<213>人工序列

<400>5

gtgatgaaagcagggtatgaactg24

<210>6

<211>25

<212>dna

<213>人工序列

<400>6

ccaccaggtgctaatcaaagatttg25

<210>7

<211>21

<212>dna

<213>人工序列

<400>7

tttggtgatggcttcgtactg21

<210>8

<211>26

<212>dna

<213>人工序列

<400>8

gtacttcgtcgtttcactaaatcctg26

<210>9

<211>25

<212>dna

<213>人工序列

<400>9

atgagtaaaaagattttcttgtcac25

<210>10

<211>25

<212>dna

<213>人工序列

<400>10

tcagtttctgactaaattcacactt25

<210>11

<211>21

<212>dna

<213>人工序列

<400>11

agaatgatgtggtcagaatgg21

<210>12

<211>20

<212>dna

<213>人工序列

<400>12

aagatgaggacgtgaatggt20

<210>13

<211>20

<212>dna

<213>人工序列

<400>13

cttgacttggcaggtagaga20

<210>14

<211>20

<212>dna

<213>人工序列

<400>14

cagacagcacagtgttagca20

<210>15

<211>34

<212>dna

<213>人工序列

<400>15

cgcggatccatgagtaaaaagattttcttgtcac34

<210>16

<211>34

<212>dna

<213>人工序列

<400>16

ccgctcgagtcagtttctgactaaattcacactt34

<210>17

<211>24

<212>dna

<213>人工序列

<400>17

tcacataaaggtcaagtaagatcc24

<210>18

<211>21

<212>dna

<213>人工序列

<400>18

acccttgctcattttctgtaa21

<210>19

<211>21

<212>dna

<213>人工序列

<400>19

aatgtattgatgctagaattg21

<210>20

<211>22

<212>dna

<213>人工序列

<400>20

cgcaaacaaaatacgggcaggt22