检测融合基因MLL/CBP的表达情况及融合型别的寡核苷酸及应用的制作方法

本发明属生命科学和生物技术领域，具体涉及一种筛查用途的白血病融合基因mll/cbp检测的引物、探针和检测试剂盒。

背景技术：

随着化疗、放疗以及生物基因疗法在治疗恶性肿瘤中的广泛应用，使大部分恶性肿瘤得以有效治疗和控制，甚至部分获得治愈。但由于化、放疗在治疗的同时亦会损伤正常造血干细胞及免疫细胞，导致基因突变，从而诱发治疗相关性白血病(therapy-relatedleukemia)。治疗相关性白血病是一种综合症，具有原发性白血病的各种临床表现，主要发生于初发癌(血液恶性肿瘤、实体癌)治疗后，大约占各类白血病的7％。此外，治疗相关性白血病普遍存在潜伏期长，对治疗反应差，生存期短的临床特症，严重危害着肿瘤患者的生存。

混合谱系白血病(mixed-lineageleukemia,mll)基因与其融合伙伴因染色体易位而产生的融合基因是治疗相关性白血病中的常见类型，具有恶性程度高，对化疗不敏感，缓解率低的特点。其中共活化集合蛋白基因(creb,bingdingprotein，cbp)与mll结合产生的融合基因mll-cbp(t11；16)(q23；p13)是一种罕见的融合基因类型，主要有mllexon8/cbpexon3、mllexon9/cbpexon3和mllexon10/cbpexon3。研究表明mll-cbp融合蛋白能够引发骨髓增生和加强粒性白细胞与巨噬白细胞前体自我更新和增殖能力，而这些异常现象则可能进一步发展为白血病。经临床案例分析，mll-cbp被证实与治疗相关性急性粒单核白血病(therapy-relatedacutemyelomonocyticleukemia,t-amml)、慢性粒单核细胞白血病(therapy-relatedchronicmyelomonocyticleukemia,t-cmml)等具有密切联系，且常伴有高发性的骨髓异常增生综合症(therapy-relatedmyelodysplasticsyndrome,t-mds)。

实时荧光pcr综合生物学、酶学和荧光化学于一体，从扩增到结果分析均在封闭状态下的pcr反应管中进行，其结果用ct值表示，与普通pcr比较，具有特异度好，灵敏度高，操作简单，结果更直观等优点。实时荧光pcr中常见的方法有sybrgreeni染料法，双探针杂交法以及taqman技术等。其中sybrgreeni由于是非饱和染料，特异性不如双探针杂交法以及taqman法，必须通过观察溶解曲线来判断其特异性，而双探针法杂交法成本又较为昂贵。因此，本试剂盒采用实时荧光pcr中的taqman探针法检测融合基因mll/cbp以及对其型别进行鉴定。

技术实现要素：

本发明设计了检测内参/目的基因用引物、探针，采用实时荧光pcr，检测内参基因abl、目的基因mll/cbp的表达情况，鉴定mll/cbp融合型别。试剂盒通过调整内参/目的基因的引物探针比例，以及pcr反应条件，使扩增效率和速率均达到最佳。

用于mll/cbp的检验试剂盒中含有红细胞裂解液、trizol、氯仿、无水乙醇、revertraaceqpcrrtkit(toyobo公司)、检测体系pcr反应液1、检测体系pcr反应液2、检测体系pcr反应液3、检测体系pcr反应液4、阳性对照品1、阳性对照品2、阳性对照品3、阳性对照品4、阴性对照品和内参ablpcr反应液，其特征在于：

检测体系pcr反应液1包括thunderbirdqpcrmix(toyobo，qps-101)、检测目的基因用上下游引物分别为：mll/cbp-8-f、mll/cbp-8-r、mll/cbp-9-f、mll/cbp-10-f、mll/cbp-9-10-r，探针为mll/cbp-probe，用于初检是否存在mll/cbp融合。探针、引物序列如下，

mll/cbp-8-f:ccgcccaagtatccctgtaa

mll/cbp-8-r:atttggcacgttggtgactg

mll/cbp-9-f:ccaatggcaatagttctaagcaa

mll/cbp-10-f:ggcagtagtgggcatgtagagat

mll/cbp-9-10-r:ctgtagggaaggtgggcaa

mll/cbp-probe:fam-agccagcaaacagagcatggtcaaca–tamra

检测体系pcr反应液2包括thunderbirdqpcrmix(toyobo，qps-101)，用于鉴别mll/cbp-8的引物mll/cbp-8-f、mll/cbp-8-r以及探针mll/cbp-probe。探针、引物序列如下，

mll/cbp-8-f:ccgcccaagtatccctgtaa

mll/cbp-8-r:atttggcacgttggtgactg

mll/cbp-probe:fam-agccagcaaacagagcatggtcaaca–tamra检测体系pcr反应液3包括thunderbirdqpcrmix(toyobo，qps-101)，用于鉴别mll/cbp-9的引物mll/cbp-9-f、mll/cbp-9-10-r以及探针mll/cbp-probe。探针、引物序列如下，

mll/cbp-9-f:ccaatggcaatagttctaagcaa

mll/cbp-9-10-r:ctgtagggaaggtgggcaa

mll/cbp-probe:fam-agccagcaaacagagcatggtcaaca–tamra

检测体系pcr反应液4包括thunderbirdqpcrmix(toyobo，qps-101)，用于鉴别mll/cbp-10的引物mll/cbp-10-f、mll/cbp-9-10-r以及探针mll/cbp-probe。探针、引物序列如下，

mll/cbp-10-f:ggcagtagtgggcatgtagagat

mll/cbp-9-10-r:ctgtagggaaggtgggcaa

mll/cbp-probe:fam-agccagcaaacagagcatggtcaaca–tamra

内参ablpcr反应液包括thunderbirdqpcrmix(toyobo，qps-101)，检测abl的引物abl-f、abl-r以及探针abl-probe。探针引物序列如下，

abl-f:gatacgaagggagggtgtacca

abl-r:ctcggccagggtgttgaa

abl-probe:fam-gcttctgatggcaagctctacgtctcct-tamra

此外，所述阴性对照品为无mll/cbp融合基因的溶液。所述阳性对照品1为含mll/cbp-8、mll/cbp-9、mll/cbp-10融合基因质粒溶液；阳性对照品2为mll/cbp-8融合基因质粒溶液；阳性对照品3为mll/cbp-9融合基因质粒溶液；阳性对照品4分别为mll/cbp-10融合基因质粒溶液。

本发明的设计思路为：

1.引物、探针设计

针对mll/cbp融合概率较高的mllexon8/cbpexon3、mllexon9/cbpexon3和mllexon10/cbpexon3设计引物和探针。依据mllexon8、exon9、exon10序列设计上游引物，再参考cbpexon3序列设计下游引物，其中mllexon9/cbpexon3和mllexon10/cbpexon3共用同一条下游引物，但为了保证多重引物荧光反应体系中的反应效率和特异性，mllexon8/cbpexon3单独使用一条下游引物。此外，由于融合基因下游均为cbpexon3，因此探针设计在cbpexon3上，三种融合基因共用同一条探针。可以说该发明在最大限度考虑反应效率和特异性的同时，又极大地降低了成本。

2.检测和鉴定体系设计

由于mll/cbp的产生概率低，所以本发明先采用多重引物(一个反应体系中含有对应3种融合型别的引物)结合实时荧光pcr，对样本进行初步检测。若在初检结果中出现阳性，再分别以特异性引物(一个反应体系中只含1种融合型别的引物，引物为多重引物反应体系中的一种)对具体型别进行鉴定。

本发明提供了一种检测融合基因mll/cbp的表达情况及融合型别的寡核苷酸，包括引物mll/cbp-8-f、mll/cbp-8-r、mll/cbp-9-f、mll/cbp-10-f、mll/cbp-9-10-r和探针为mll/cbp-probe，所述引物和探针序列如下：

mll/cbp-8-f:ccgcccaagtatccctgtaa

mll/cbp-8-r:atttggcacgttggtgactg

mll/cbp-9-f:ccaatggcaatagttctaagcaa

mll/cbp-10-f:ggcagtagtgggcatgtagagat

mll/cbp-9-10-r:ctgtagggaaggtgggcaa

mll/cbp-probe:fam-agccagcaaacagagcatggtcaaca–tamra

进一步的，用于鉴别mll/cbp-8的引物mll/cbp-8-f、mll/cbp-8-r以及探针mll/cbp-probe；mll/cbp-9的引物mll/cbp-9-f、mll/cbp-9-10-r以及探针mll/cbp-probe；用于鉴别mll/cbp-10的引物mll/cbp-10-f、mll/cbp-9-10-r以及探针mll/cbp-probe。

进一步的，还包括用于内参基因abl检测的引物abl-f、abl-r以及探针abl-probe，所述引物和探针序列为：

abl-f:gatacgaagggagggtgtacca

abl-r:ctcggccagggtgttgaa

abl-probe:fam-gcttctgatggcaagctctacgtctcct-tamra

本发明还提供了一种检测融合基因mll/cbp的表达情况及融合型别的寡核苷酸的试剂盒，包括引物mll/cbp-8-f、mll/cbp-8-r、mll/cbp-9-f、mll/cbp-10-f、mll/cbp-9-10-r和探针为mll/cbp-probe，所述引物和探针序列如下：

mll/cbp-8-f:ccgcccaagtatccctgtaa

mll/cbp-8-r:atttggcacgttggtgactg

mll/cbp-9-f:ccaatggcaatagttctaagcaa

mll/cbp-10-f:ggcagtagtgggcatgtagagat

mll/cbp-9-10-r:ctgtagggaaggtgggcaa

mll/cbp-probe:fam-agccagcaaacagagcatggtcaaca–amra

进一步的，还含有红细胞裂解液。

进一步的，还包括阳性对照品和阴性对照品。

一种降低融合基因mll/cbp检测成本的方法，包括以下步骤：

(1)抽提血液样本中的总rna；

(2)将步骤1中提取的rna反转录为cdna；

(3)采用检测体系pcr反应液1结合实时荧光pcr，对样本进行初步检测，若初步检测结果显示为阴性，则停止检测；

(4)若步骤3中的检测结果显示为阳性，分别以检测体系pcr反应液2、检测体系pcr反应液3、检测体系pcr反应液4结合实时荧光pcr对检测样本进行具体型别的进行鉴定；

(5)结果判断：将阈值线调整至背景信号及阴性扩增线以上，得出ct值；1)内参阳性时，检测结果才认为有效；2)阳性判断标准：ct<36，为阳性；35≤ct≤38，为疑似阳性，需要再次验证；ct＞38，为阴性。

本发明还提供了一种检测融合基因mll/cbp的表达情况及融合型别的方法，包括：

(1)抽提血液样本中的总rna；

(2)将步骤1中提取的rna反转录为cdna；

(3)采用检测体系pcr反应液1结合实时荧光pcr，对样本进行初步检测，若初步检测结果显示为阴性，则停止检测；若初步检测结果显示为阳性则判断为mll/cbp融合基因型；

(4)为可选步骤，若步骤3中的检测结果显示为阳性，分别以检测体系pcr反应液2、检测体系pcr反应液3、检测体系pcr反应液4结合实时荧光pcr对检测样本进行具体型别的进行鉴定；

(5)结果判断：将阈值线调整至背景信号及阴性扩增线以上，得出ct值；1)内参阳性时，检测结果才认为有效；2)阳性判断标准：ct<36，为阳性；35≤ct≤38，为疑似阳性，需要再次验证；ct＞38，为阴性。

本发明的有益效果是：本发明采用实时荧光pcrtapman探针法，检测和鉴别受测者体内融合基因mll/cbp，相比于以往的荧光原位杂交和传统的逆转录pcr法，该试剂盒具有全称监控、敏感度高、防污染、结果便于判读等优点。再由于该试剂盒采用多重引物体系初检和特异性引物相结合的方法，在减少初检成本的同时又提高了检测通量。加之该试剂盒将反应体系所需的引物、探针进行合理配比和优化，使实验条件达到最佳，从而省去了繁琐的条件摸索环节，大大提升了实验效率。因此该试剂盒能够快速准确地检测大量样本中mll/cbp，对于白血病诊断、调整治疗方案、评价治疗效果、预测预后、预防临床复发都具有重要意义。

附图说明

图1多重引物荧光pcrmll/cbp11号样本图例，其中1阳性对照；2内参；3阴性对照；411号样本多重引物荧光曲线。

图2mll/cbp-8荧光pcr11号样本图例，其中1mll/cbp-8阳性对照；2内参；3阴性对照；411号样本mll/cbp-8荧光曲线。

图3mll/cbp-9荧光pcr11号样本图例，1mll/cbp-9阳性对照；2内参；3阴性对照；411号样本mll/cbp-9荧光曲线。

图4mll/cbp-10荧光pcr11号样本图例，1mll/cbp-10阳性对照；2内参；3阴性对照；411号样本mll/cbp-10荧光曲线。

具体实施方式

实施例1

本方法的操作流程：

(1)抽提血液中的总rna:在洁净的1.5ml的离心管中加入1ml红细胞裂解液，取抗凝血0.5ml混匀。室温静置10min；5000rpm离心5min，弃上清，收集底部的细胞；再次加入0.5ml红细胞裂解液，5000rpm离心5min，弃上清，收集底部的细胞；向细胞中加入1mltrizol，反复吹打直至沉淀完全溶解，室温静置5min；加入0.2ml氯仿，震荡均匀；14000rpm4℃离心10min，吸取上清层转移至另一新的离心管中；加入等体积的异丙醇，上下充分混匀，室温静置10min；14000rpm4℃离心10min，弃上清，加入75％乙醇1ml，轻轻上下颠倒洗涤管壁；14000rpm4℃离心5min，弃乙醇；室温干燥10-15min，加入20μlrnase-free水溶解沉淀。

(2)参考toyobo公司的revertraaceqpcrrtkit试剂盒说明书，将rna反转为cdna。

(3)试剂配制：按初检或型别鉴定所需，配制检测体系pcr反应液xul，每人份23μl分装：

x＝23μl反应液×(n份标本+1份阳性对照+1份阴性对照+1份空白对照)；

(4)加样：向检测体系pcr反应液中加入2μlcdna；阳性对照或阴性对照检测时，向检测反应体系pcr反应液中加入2μl阳性对照品或阴性对照品；空白对照检测时，向检测反应体系pcr反应液中加入加2μl生理盐水或不加任何物质。

所述检测反应体系pcr反应液选自检测体系pcr反应液1、检测体系pcr反应液2、检测体系pcr反应液3、检测体系pcr反应液4其中的一种(具体组成见表1)。

所述阳性对照品选自阳性对照品1、阳性对照品2、阳性对照品3、阳性对照品4其中的一种。

表1.检测体系pcr反应液配制组分

(5)检测：检测在实时荧光pcr仪上进行，可用仪器包括abi7300，7500(美国appliedbiosystems公司)等。反应条件：95℃预变性1min；95℃15s，58℃35s，反应40个循环，荧光信号于58℃35s时采集。

若仅需获得检测样本中融合基因mll/cbp的表达情况，无需型别鉴定，采用检测体系pcr反应液1。

若要获得检测样本中融合基因mll/cbp的具体型别，采用检测体系pcr反应液1结合实时荧光pcr，对样本进行初步检测。若初步检测结果显示为阴性，则停止检测。若初步检测结果中显示为阳性，再分别以检测体系pcr反应液2、检测体系pcr反应液3、检测体系pcr反应液4结合实时荧光pcr对检测样本进行具体型别的进行鉴定。

(6)结果判断：将阈值线调整至背景信号及阴性扩增线以上，得出ct值。

1)内参阳性时，检测结果才认为有效；

2)阳性判断标准：ct<36，为阳性；35≤ct≤38，为疑似阳性，需要再次验证；ct＞38，为阴性。

实施例2白血病标本初检

取送检的白血病患者抗凝血标本共10例，按实施例1所述方法提取基因组rna、配制试剂并检测。

每份标本加2μl至检测体系pcr反应液1中。同时做阳性，阴性，空白对照。由于融合基因mll/cbp在白血病患者当中较为罕见，10例白血病样本均为阴性结果。结果如下表1：

表1

实施例3临床样品初检

随机取待检的临床样品11份，按实施例1所述方法提取基因组、配制试剂并检测。每份样品加2μl至检测体系pcr反应液1中。同时做阳性，阴性，空白对照各一份。结果如下表2。

表2

实施例4mll/cbp型别鉴定

随机取经实施例3初检后的临床样品5份，按实施例1所述方法提取基因组、配制试剂并检测。每份样品分别加2μl至鉴定检测体系pcr反应液2-4中。同时做阳性，阴性，空白对照各一份。由于mll/cbp的发生概率低，结果同实施例3一致，无一阳性。结果如下表3

表3

序列表

<110>济南艾迪康医学检验中心有限公司

<120>检测融合基因mll/cbp的表达情况及融合型别的寡核苷酸及应用

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