一种高效液相色谱固定相的制备方法与流程

本发明属于高分子化合物的制备技术领域，特别涉及一种高效液相色谱固定相的制备方法。

背景技术：

色谱固定相即为在色谱分离中固定不动、对样品产生保留的一相。目前，在色谱分析中，通常将分子印迹聚合物做为色谱固定相，因为分子印迹聚合物可模拟仿真生物学中酶和底物之间或者抗体和抗原之间的特异亲和作用而建立起一种特异性的分子识别。

在利用分子印迹聚合物进行分子识别的技术中，当印迹分子与聚合物单体接触时会形成多重相互作用的空间位点，这种相互作用包括氢键作用、共价键作用等。这些空穴的尺寸大小与模板分子空间构型相匹配，借助于空穴中各功能位点的多重相互作用就可以用于对特定目标物及其类似物进行选择性识别与富集。george等1993年在《nature》上发表了茶碱和安定的分子印迹技术，该研究鉴定了分子印迹识别技术的研究基础，极大地促进了该项分离、分析新技术的迅速发展和应用。目前，分子印迹识别技术已经在生物学研究、食品分析、环境分析、天然产物和医学等方面均存在一定的应用，如对葡萄皮或其他物质中白藜芦醇成分的分离提取，即利用白藜芦醇分子印迹聚合物来分离葡萄皮或其他物质中的白藜芦醇成分。

然而，现有制备白藜芦醇分子印迹聚合物的方法制备的白藜芦醇分子印迹聚合物相对分子质量分布宽，相对分子质量和结构不可控，并造成一定程度的错配而使聚合物的选择性降低，导致对白藜芦醇的分离效率低，分离效果不理想。

技术实现要素：

本发明意在提供一种液相色谱固定相的制备方法，该方法制备出的固定相对白藜芦醇成分的分离效果好。

为了解决上述技术问题，本发明提供如下技术方案：

一种高效液相色谱固定相的制备方法，该液相色谱固定相为白藜芦醇分子印迹聚合物，其特征在于，所述白藜芦醇分子印迹聚合物的制备步骤如下：

1)、按照摩尔比为1:6～1:2的量取白藜芦醇、丙烯酰胺溶解于乙腈中，乙腈的质量按照白藜芦醇质量的0.2～0.3倍称取；

2)、向步骤1)得到的溶液中加入摩尔比为80:1～100:1的二醇二甲基丙烯酸酯和偶氮二异丁腈，采用可逆加成-断裂链转移自由基聚合法在55～65℃的水浴中聚合反应23～26h，得到块状聚合物；

3)、将所述块状聚合物研磨、烘干、去杂，得到白藜芦醇分子印迹聚合物。

本发明的技术原理及技术效果在于：

通过实验及相应分析，发明人发现现有白藜芦醇分子印迹聚合物的缺陷是制备过程中自由基聚合的不可控性而导致的，从而导致聚合反应慢引发、快增长、速终止，进而导致了生成的聚合产物相对分子质量分布宽，相对分子质量和结构不可控，并造成一定程度的错配。发明人经过研究分析并通过多次实验，发现在特殊的条件参数下，采用可逆加成-断裂链转移自由基聚合法可以解决上述问题。本发明的制备方法中，反应速率可以得到控制，使反应更加温和可控，从实验可以看出，本发明制备的白藜芦醇分子印迹聚合物，相较于现有技术而言，其表面发生了较大的变化，出现了丰富的孔隙和通道，有着较为致密的形貌和更为均匀膨松的结构，能够提供的结合位点更多，对目标分子的富集量更大。因此，相较于现有技术而言，本发明制备出的白藜芦醇分子印迹聚合物做为液相色谱固定相时，对白藜芦醇成分的分离效果更好。

进一步，所述步骤3)中的去杂步骤中，先用摩尔比为9:1的甲醇和乙酸的混合液进行索式提取，再用甲醇洗脱。甲醇和乙酸的混合液可去除模板分子及未反应的物质，甲醇洗脱可去除乙酸。

进一步，所述可逆加成-断裂链转移自由基聚合法中加入的试剂为二苄基三硫代碳酸酯。发明人经过研究合成了二苄基三硫代碳酸酯，并通过实验证明其可以解决本发明的技术问题。

进一步，所述步骤2)中可逆加成-断裂链转移自由基聚合法的具体操作步骤如下：加入所述二苄基三硫代碳酸酯，使用超声混合均匀，并通氮气后真空密封，再置于55～65℃的水浴中聚合反应23～26h。本方案是基础方案较为优选的方案，其制备出的白藜芦醇分子印迹聚合物对白藜芦醇成分的分离效果好。

进一步，所述步骤2)采用如下加料装置进行加料，所述加料装置包括密封盖板，密封盖板上设有排气孔，密封盖板上还贯穿有多根倾斜设置的加料管，多根加料管交汇于一点，并于交汇处连通，每根加料管包括位于交汇处上方的进料段和位于交汇处下方的出料段，所述进料段内设有带有网孔的拦板，所述出料段呈大端面朝外的锥形状，出料段内设有与出料段匹配的锥形塞，出料段内位于锥形塞内侧设有可使锥形塞将出料段密封的拉簧；

基于所述加料装置，所述步骤2)的具体操作如下：

a、将所述加料装置放入至步骤1)得到的溶液上方，将盛放溶液的反应器上端密封，

且使各个出料段的下端浸没于溶液中；

b、将待加入的二醇二甲基丙烯酸酯、偶氮二异丁腈和二苄基三硫代碳酸酯分散地放于各个进料段内；

c、轮流地向各个进料段内鼓入高压氮气，直至将所有物料加入至溶液中，并保证鼓入高压氮气的时间总和在10min以上，将排气孔和各个进料段的上端密封；

d、将步骤c的溶液混合物超声震荡3～5min后，再置于55～65℃的水浴中聚合反应23～26h。

在进行聚合反应之前，需要先将加入的二苄基三硫代碳酸酯以及其他原料搅拌均匀，如此才有利于二苄基三硫代碳酸酯发挥作用，使得聚合效果好。然而，目前聚合加料的方式都是直接将待加入的物料投入进去，所有的物料都聚集在一处，难以分散。为了使物料混合均匀，需要较长时间的超声波处理。但是，超声波混合的过程中，溶液局部会产生高温高压，而偶氮二异丁腈在高温高压下会急剧分解，容易引起燃烧、爆炸，因此，长时间的超声波混合会有明显的安全隐患存在。

本方案中，各物料会分散地置于各个进料段内，向其中一个进料段鼓入高压氮气时，在气流的震动下，物料会穿过拦板上的网孔，并随着气流沿直线进入至出料段中。气流进入至出料段内后，对锥形塞形成一个向外的冲击，锥形塞向外移动，出料段打开，物料随着气流进入至溶液中，此时由于出料段内气压较大，溶液不会过多地进入至出料段内。当停止向该加料管内鼓入高压氮气时，锥形塞会在拉簧的作用下回复，将出料段重新密封。

本方案中，设置拦板，可避免物料快速地向下滑入至出料段，将多根加料管的交汇处封堵，有了拦板，即使有网孔的存在，物料也不会快速地向下滑动，只有在震动下才会大量地穿过网孔，向下滑动，而氮气的进入正好实现了这一点。

本方案的技术效果在于：

1)、物料在氮气的带动下进入至溶液中，氮气可以对物料形成搅拌的作用，有利于物料的混合均匀；

2)、多根倾斜设置的加料管交汇于一点，可以将物料从最原始就分散至溶液的不同部位处，有利于物料的混合均匀；

3)、轮流地向各个加料管中鼓入氮气，可以避免同时向各个加料管中鼓入氮气而造成的不同加料管之间气流的相互影响，导致物料难以顺利地进入，影响效率。

4)、原本在聚合之前就需要充氮气排氧，以在真空条件下聚合。本方案利用氮气将物料加入至溶液中，并对物料进行搅拌，同时还可以实现排氧，节约了后续充氮气的时间，一举两得，整体效率高。

值得注意的是，对于液态的二醇二甲基丙烯酸酯而言，虽然拦板不能将其拦截，其会汇集于各个出料段内以及所述交汇处，但由于其流动性好，不会将交汇处封堵，且各个加料管轮流地鼓入氮气，能使得二醇二甲基丙烯酸酯从不同的出料段进入至溶液中，即进入至溶液的不同部位处，同样能达到分散、混合的效果，而且通入氮气也能对其起到搅拌的作用。

本方案在前期就将物料分散至了溶液的不同部位处，减少了后期超声波混合的时间，也就减少了高温高压产生的机率，进而减少了由此带来的安全隐患。同时，还能节约后续充氮气的时间，整体效率高。

进一步，所述加料管的倾斜角度为30°～60°。倾斜角度太大，物料会集中于溶液中部，倾斜角度太小，物料会过多地分散于溶液边缘。

进一步，所述加料装置还包括内部为中空的加料盘，加料盘侧壁上设有与加料管一一对应且连通的第一开口，加料盘内转动设有转筒，转筒的外壁与加料盘的内壁相贴，且转筒的侧壁上设有一个可依次与所述第一开口连通的第二开口。由此可以通过转动转筒，使转筒上的第二开口轮流地与不同的第一开口连通，来实现轮流地向不同的加料管内鼓入氮气。

附图说明

图1为本发明实施例中加料装置的结构示意图；

图2为本发明实施例及对比例的扫描电镜图；

图3为本发明实施例及对比例的吸附性能曲线图；

图4为本发明实施例的萃取测试结果曲线图。

具体实施方式

下面通过具体实施方式进一步详细的说明：

本发明一种高效液相色谱固定相的制备方法，该液相色谱固定相为白藜芦醇分子印迹聚合物，而该白藜芦醇分子印迹聚合物的制备步骤如下：

1)、分别称取1824mg(8mmol)的白藜芦醇(纯度98％,上海阿拉丁生化科技股份有限公司生产)和2240mg(32mmol)的丙烯酰胺(am,分析纯,天津市福晨化学试剂厂生产)，置于1000ml烧杯中，用640ml(约640mg)的乙腈(色谱纯,成都市科龙化工试剂厂生产)溶解，超声5min，放置1h。

2)、采用特殊的加料装置向步骤1)得到的溶液中加入二醇二甲基丙烯酸酯、偶氮二异丁腈和二苄基三硫代碳酸酯。如图1所示，该加料装置包括密封盖板2，密封盖板2的侧壁上套有密封圈1，密封盖板2上设有排气孔5，密封盖板2上还贯穿有四根倾斜设置的加料管，每个加料管的倾斜角度均为45°。四根加料管交汇于一点，并于交汇处连通，每根加料管包括位于交汇处上方的进料段6和位于交汇处下方的出料段8，进料段6内设有带有网孔的拦板7，所述出料段8呈大端面朝外的锥形状，出料段8内设有与出料段8匹配的锥形塞9，出料段8内位于锥形塞9内侧设有可使锥形塞9将出料段8密封的拉簧。加料装置还包括内部为中空的加料盘3，加料盘3侧壁上设有与加料管一一对应且连通的第一开口，加料盘3与加料管可拆卸连接，加料盘3内转动设有转筒4，转筒4的外壁与加料盘3的内壁相贴，且转筒4的侧壁上设有一个可依次与所述第一开口连通的第二开口。

基于以上加料装置，加料、聚合的具体操作如下：

a、将加料装置放入至烧杯内，密封盖板2将烧杯上端密封，且上下移动密封盖板2，使得各个出料段8的下端浸没于溶液中；

b、将待加入的二醇二甲基丙烯酸酯、偶氮二异丁腈和二苄基三硫代碳酸酯分散地放于各个进料段6内；

c、向转筒4内通入高压氮气，并间歇地转动转筒4，使转筒4上的第二开口轮流地与各个第一开口连通，从而轮流地向各个进料段6内鼓入高压氮气，直至所有物料加入至溶液中，并保证鼓入高压氮气的时间总和在10min以上，以保证将烧杯内的空气排尽，然后将排气孔5和转筒4密封；

此处加入的乙二醇二甲基丙烯酸酯(edma,分析纯,山东烟台云开化工有限责任公司生产,使用前用10％氢氧化钠除去阻聚剂)的量为32000ul(160mmol)，偶氮二异丁腈(aibn,化学纯,上海试四赫维化工有限公司生产)的量为296mg(1.8mmol)，二苄基三硫代碳酸酯的量为625mg，二苄基三硫代碳酸酯的制备方法如下：

取20ml33％的naoh水溶液置于100ml锥形瓶中，强力搅拌下加入20ml二硫化碳，15min后加入0.19g相转移催化剂，体系变为深红色；继续搅拌10min后，加入2ml苄氯，体系由红色变为橘红色；室温下反应24h后停止反应。将反应物转移至分液漏斗中，静置分层。体系下层为血红色的naoh水溶液，仍含有少量产物；上层为含有大部分产物的二硫化碳溶液。分出下层naoh水溶液，用60ml二硫化碳萃取(20ml×3)。合并萃取液及上层二硫化碳溶液，转入250ml分液漏斗中，用去离子水洗涤至中性。转移至锥形瓶中，加入无水硫酸钠干燥24h。过滤后，常压蒸馏除去二硫化碳，得到橘红色的液态初产物。用石油醚萃取后，旋转蒸发除去石油醚，得到淡黄色针状晶体产物，用甲醇洗涤3次，过滤，得二苄基三硫代碳酸酯。

d、将步骤c的溶液混合物超声震荡4min后，再置于60℃的水浴中聚合反应24h。

3)、将反应完成后得到的块状聚合物在60℃烘干，研磨后过80目筛,用摩尔比为9:1的甲醇和乙酸的混合液进行索氏提取24h以去除模板分子及未反应的物质，再用甲醇洗脱去除乙酸，晾干后于60℃下真空干燥,存于干燥器中备用，即得白藜芦醇分子印迹聚合物，也即得到本发明的液相色谱固定相。

值得注意的是，具体实施时，上述步骤中，若白藜芦醇、丙烯酰胺、乙腈、二醇二甲基丙烯酸酯、偶氮二异丁腈、二苄基三硫代碳酸酯的用量，以及水浴的温度和聚合反应的时间有一些改变，只要满足白藜芦醇、丙烯酰胺的摩尔比在1:6～1:2范围内，乙腈的质量为白藜芦醇质量的0.2～0.3倍，二醇二甲基丙烯酸酯和偶氮二异丁腈的摩尔比在80:1～100:1范围内，水浴温度在55～65℃范围内，聚合反应时间在23～26h内，都是可以达到本发明的技术效果的。

实验：

实验例：按照上述实施例制备的产物；

对比例1：除不加二苄基三硫代碳酸酯外，按照上述实施例同样的步骤制备的产物；

对比例2：按照上述同样的步骤制备的非分子印迹聚合物。

实验一：表面形貌分析

分别对实验例和对比例1进行电镜扫描，如图2所示，其中，a、b、c为实施例的扫描电镜图，a为5000倍，b、c为2000倍；d为对比例1的2000倍扫描电镜图。从b、c、d的对比可以看出，与对比例1相比，实施例的表面出现了丰富的孔隙和通道，有较为致密的形貌，结构更均匀膨松，空隙和通道更丰富。而在进行液相色谱分析时，目标分子可以通过这些孔隙进入“设定”的空穴，并与之发生识别作用，因此，相比于对比例1，实施例对白藜芦醇成分的分离效果更好，即本发明制备出的固定相对白藜芦醇成分的分离效果好。

实验二：吸附性能测试

称取6份等量(50mg)的实验例,分别置于5ml离心管中,加入2ml20μg/ml白藜芦醇的甲醇溶液,置于恒温(20℃)水浴振荡器中,分别振荡0,0.5,1,2,3,4h,然后离心10min,取上层清液,用hplc测定白藜芦醇的浓度,由此可得聚合物对白藜芦醇分子的饱和吸附量。根据结合前后溶液中白藜芦醇浓度的变化,计算出白藜芦醇的结合量q(μg/g),同时考察聚合物吸附白藜芦醇随时间的变化情况。

按照上述同样的操作，测量分别测量对比例1和对比例2对白藜芦醇的结合量q(μg/g),同时得出结合量随时间的变化情况。测量的结果如图3所示，其中a代表实施例，b代表对比例1，c代表对比例2。

从图2可以看出，对比例2对白藜芦醇的吸附能力较小,推断是由于其聚合物结构中无相应的选择性结合位点,对白藜芦醇的吸附能力较差；对比例2对白藜芦醇有一定数目的结合位点,其吸附率相对较大；而用实施例由于在制备过程中反应速度可控，大孔、中孔分布较均匀，比表面较大，因此，能提供更多的结合位点,对白藜芦醇具有更高的吸附效率。

实验三：萃取测试

样品的处理：选择市售的和田红葡萄，分别用自来水、二次蒸馏水各洗三次，自然干后剥皮，准确称取葡萄皮5.0g，用20.0ml甲醇浸泡2h,超声提取20min，提取液经0.45μm微孔滤膜过滤,滤液置于冰箱中备用。

取150mg实施例，置于底部事先装有筛板的固相萃取柱(3ml)中，用筛板盖住，用2ml甲醇(ar)分两次活化，将2.0ml样品溶液以0.5ml/min的流速通过萃取柱，收集萃后液。用2.0ml甲醇-乙酸(体积比9:1)溶液进行柱洗脱，收集洗脱液。

将提取原液、萃后液和洗脱液分别在以下色谱条件下采用hplc进行检测。色谱条件：安捷伦hc-c18柱(5μm,250mm×4.6mm)，流动相为甲醇40％-0.2％乙酸60％，流速为0.8ml/min，检测波长为305nm，柱温30℃，进样量10μl。

测试的结果如图4所示，其中(a)代表葡萄皮提取液，(b)代表萃后液，(c)代表柱洗脱液，a代表白藜芦醇。

从图3可以看出，在固相萃取之前,葡萄皮提取液中白藜芦醇与样品中其它组分得到了明显的分离；由图(b)、(c)可以看出,当样品提取液通过聚合物萃取后,提取液中的基质成分几乎未被吸附,而白藜芦醇绝大部分被吸附。用甲醇-乙酸洗脱液洗脱后，对流出液进行色谱分析，从图(c)可以看出，色谱图中除了很少一部分基质成分外，得到了高纯度的白藜芦醇峰。

结果表明，实施例对白藜芦醇具有特殊的亲和作用,当葡萄皮样品溶液通过本发明的固定相时,白藜芦醇被吸附在印迹聚合物与其相匹配的空隙中,经甲醇冲洗时样品中的其它组分很容易被冲洗下来，而大部分白藜芦醇不被冲洗下来,当改用9：1的甲醇-乙酸洗脱时,只有白藜芦醇被洗脱,从而达到很好的分离富集目的。

综上所述，相对于现有技术而言，本发明制备的液相色谱固定相对白藜芦醇的吸附能力强，吸附效率高，整体分离效果好。