一种敲除胶质母细胞瘤DHC2基因的试剂盒的制作方法

本发明涉及一种敲除胶质母细胞瘤细胞dhc2基因的试剂盒，以及该试剂盒的应用，以及一种敲除胶质母细胞瘤细胞的dhc2等位基因的方法。

背景技术：

胶质瘤是最常见的原发性恶性脑肿瘤，而所有组织类型的胶质瘤中，又以胶质母细胞瘤（glioblastoma,gbm）最为常见、恶性程度最高、预后最差，其中位无进展生存期仅为6.9个月，中位总体生存期仅为14.6个月。尽管胶质瘤研究在基因分析水平取得了巨大进步，分子靶向药物、免疫疗法等在gbm治疗中尚无明显进展。目前国际上治疗胶质瘤依然主要采用最大安全范围的手术全切除，术后辅以规范的同步放化疗，替莫唑胺（temozolomide，tmz）为首选化疗药物。然而，gbm会对tmz产生治疗抵抗，这是治疗gbm面临的最大困难。gbm对tmz耐药，最为重要的是o6-甲基鸟嘌呤-dna-甲基转移酶（mgmt）介导的dna修复；此外，许多其他dna损伤修复途径通过协同作用，修复损伤dna双链，亦可以导致gbm对tmz产生抵抗。临床上，有近半数的gbm为mgmt表达阴性，仍会产生诱导性耐药，具体机制尚不清楚。因此，gbm对于tmz治疗抵抗的具体机制亟待揭示。

dhc2（又名dync2h1;dyneincytoplasmic2heavychain1）是胞浆动力蛋白的一条重链，一端与货物结合，另一端则可沿着微管运动，将货物逆转运细胞核内。本发明人的前期研究发现，dhc2蛋白可以通过逆转运多种dna损伤修复蛋白进入细胞核，从而导致mgmt阴性gbm发生诱导耐药；这就提示：如果干预dhc2逆转运途径，将同时阻断多种dna损伤修复途径，达到满意的治疗效果（wangh,fengw,luy,lih,xiangw,chenz,hem,zhaol,sunx,leib,qis,liuy.expressionofdynein,cytoplasmic2,heavychain1(dhc2)associatedwithglioblastomacellresistancetotemozolomide.scirep.20164;6:28948.）。

最新发现的规律成簇间隔短回文重复（clusteredregularlyinterspacedshortpalindromicrepeats）crispr/cas9技术是一个理想的选择。crispr/cas9系统是由一个特异性向导rna（guidingrna，grna）和核酸酶cas9蛋白构成，grna能够识别特异性的dna序列，向导cas9蛋白对dna双链进行剪切，从而达到基因剪切、编辑的效果。与其他一些基因编辑技术相比，该系统具有显著优点：（1）载体构建简单，cas9蛋白相同，只需设计特异的grna；（2）可同时编辑多个特定的靶位点基因；（3）实验周期短，花费低，操作简单，易于推广（congl,ranfa,coxd,linsl,barrettor,habibn,hsupd,wuxb,jiangwy,marraffinila,zhangf.multiplexgenomeengineeringusingcrispr/cassystems.science,2013,339(6121):819–823；malip,yanglh,esveltkm,aachj,guellm,dicarloje,norvilleje,churchgm.rna-guidedhumangenomeengineeringviacas9.science,2013,339(6121):823–826.）。然而，由于所设计的grna序列与基因组某段dna序列可能存在较大的相似性，进而会与非靶点dna序列发生错配，引入非预期的基因突变，即脱靶效应（off-targeteffects）。脱靶效应严重制约了crispr/cas9基因编辑技术的广泛应用（tanep,liy,velasco-herreramdelc,yusak,bradleya.off-targetassessmentofcrispr-cas9guidingrnasinhumanipsandmouseescells.genesis.201553(2):225-36.）。

因此，针对gbm细胞的dhc2基因，如果按照常规步骤进行操作，工作量大、并且敲除效率极低，有必要开发能有编辑效率高、脱靶效应低的改进的基因编辑方法和试剂盒。

技术实现要素：

本发明的目的在于提供一种敲除胶质母细胞瘤dhc2基因的试剂盒，该试剂盒具备编辑效率高、特异性强、脱靶效应低的特点，能高效、稳定地敲除胶质母细胞瘤dhc2基因，从而能够准确对dhc2基因进行沉默表达，显著提高gbm细胞对治疗的反应性，改善胶质母细胞瘤（gbm）病人预后。

本发明所述的敲除胶质母细胞瘤dhc2基因的试剂盒，包括第一敲除质粒和第二敲除质粒，或者包括第一敲除质粒和第三敲除质粒，或者包括第一敲除质粒、第二敲除质粒和第三敲除质粒；所述第一敲除质粒能转录出序列为seqidno:1的第一向导rna；所述第二敲除质粒能转录出序列为seqidno:2的第二向导rna；所述第三敲除质粒能转录出序列为seqidno:3的第三向导rna。

第一向导rna（grna#1）：

5’-cgugugucaucuuccuuaaa-3’（seqidno:1）；

第二向导rna（grna#2）：

5’-gcuucuaguucacucaaaag-3’（seqidno:2）；

第三向导rna（grna#3）：

grna#3：5’-gauccuaaauaaaaacagac-3’（seqidno:3）。

根据本发明所述的试剂盒的进一步特征，所述第一敲除质粒包括第一寡聚dna，其正向链序列为seqidno:4，反向链序列为seqidno:5；所述第二敲除质粒包括第二寡聚dna，其正向链序列为seqidno:6，反向链序列为seqidno:7；所述第三敲除质粒包括第三寡聚dna，其正向链序列为seqidno:8，反向链序列为seqidno:9。

第一寡聚dna（oligodna#1）：

正向链：caccgtttaaggaagatgacacacg（seqidno:4）；

反向链：aaaccgtgtgtcatcttccttaaac（seqidno:5）；

第二寡聚dna（oligodna#2）：

正向链：caccgcttttgagtgaactagaagc（seqidno:6）；

反向链：aaacgcttctagttcactcaaaagc（seqidno:7）；

第三寡聚dna（oligodna#3）：

正向链：caccgtctgtttttatttaggatc（seqidno:8）；

反向链：aaacgatcctaaataaaaacagac（seqidno:9）。

根据本发明所述的试剂盒的进一步特征，所述第一敲除质粒是由所述第一寡聚dna插入pgk1.1质粒载体所形成的；所述第二敲除质粒是由所述第二寡聚dna插入pgk1.1质粒载体所形成的；所述第三敲除质粒是由所述第三寡聚dna插入pgk1.1质粒载体所形成的。

本发明还提供了所述的试剂盒的应用，即在敲除胶质母细胞瘤细胞以及哺乳动物细胞的dhc2等位基因的应用。

本发明的另一个目的是提供一种敲除胶质母细胞瘤细胞的dhc2等位基因的方法。

本发明所述的敲除胶质母细胞瘤细胞的dhc2等位基因的一种方法包括：提供如上所述的试剂盒；将第一敲除质粒和第二敲除质粒同时转导进入胶质母细胞瘤细胞中；同时敲除两个dhc2等位基因上3号外显子上长度为70bp或71bp的片段。

本发明所述敲除胶质母细胞瘤细胞dhc2等位基因的另一种方法包括：提供如上所述的试剂盒；将第一敲除质粒和第三敲除质粒同时转导进入胶质母细胞瘤细胞中；同时敲除两个dhc2等位基因上3号外显子上长度为133bp的片段。

结合本发明人的前期研究发现，dhc2通过逆转运dna修复蛋白入核从而导致gbm对替莫唑胺的耐药；应用本发明所述的试剂盒，将dhc2基因敲除，逆转运途径将被阻断，在临床上应用将极大改善gbm对替莫唑胺临床疗效。

根据本发明所述的方法的进一步特征，所述敲除质粒是通过电转方式被转导进入胶质母细胞瘤细胞中，电转条件为1400v、30ms、1脉冲；电转后用5μg/ml嘌呤霉素筛选已转导的细胞。

本发明首次提供了针对dhc2基因进行稳定敲除的试剂盒，该试剂盒包含特有的敲除质粒，经本发明人多次实验验证，与其它敲除质粒相比较，本试剂盒所包含的敲除质粒具备脱靶率低、特异性强的特征；且经本发明人多次实验验证，根据试剂盒所提供的方法，能稳定敲除dhc2两等位基因，基因编辑效率极高。

附图说明

图1为本发明所述的敲除质粒转导入u87细胞内的转染效率（a.明场；b.荧光），电转条件为1400v（30ms，1脉冲）。

图2为本发明所使用pgk1.1质粒载体图谱。

图3为筛选6个阳性菌落的pcr检测电泳图。

具体实施方式

下面通过具体实施例并结合附图对本发明进行详细说明。仅出于说明的目的提供了以下实施例，并且这些实施例不意欲限制本发明的范围。在不背离本发明精神和实质的情况下，对本发明方法、步骤或条件所作的修改或替换，均属于本发明的范围。

实施例1：本发明所述的含有敲除质粒的试剂盒的构建

1.靶位点oligodna（寡聚dna）合成，并添加接头。

利用在线工具网站（http://crispr.mit.edu/），选取dhc2基因（geneid:79659）所有转录本公共的cds区，找出cds区所处的第3个外显子进行靶位点设计多条grna序列，用于敲除实验的筛选。

最终确定3条grna序列，依据此3条grna序列合成相应oligodna序列，并且在靶序列头部添加额外的碱基，正向序列添加cacc，反向序列添加aaac（靶序列的第一个碱基必须是g，若选取的靶序列第一个碱基不是g，可自行在靶序列前加一个g），各grna所对应合成的oligodna序列如下：

grna#1对应的oligodna#1，正向序列添加cacc，反向序列添加aaac：

正向链：caccgtttaaggaagatgacacacg（seqidno:4）；

反向链：aaaccgtgtgtcatcttccttaaac（seqidno:5）。

grna#2对应的oligodna#2，正向序列添加cacc，反向序列添加aaac：

正向链：caccgcttttgagtgaactagaagc（seqidno:6）；

反向链：aaacgcttctagttcactcaaaagc（seqidno:7）。

grna#3对应的oligodna#3，正向序列添加cacc，反向序列添加aaac：

正向链：caccgtctgtttttatttaggatc（seqidno:8）；

反向链：aaacgatcctaaataaaaacagac（seqidno:9）。

2.敲除载体构建

2.1oligodna杂交，敲除载体连接反应

将合成后的2条单链oligodna稀释成10μm，退火形成dsdna，再与线性化后的pgk1.1线性质粒（genloci；cat.no.gp0134）载体连接，可直接用t4dna连接酶连接，退火反应体系如下：

正链寡聚核苷酸（10um）10ul

负链寡聚核苷酸（10um）10ul

ddh2o16ul

退火缓冲液（10×）4ul

总体积40ul

将以上体系瞬时离心后，置于pcr仪中95℃孵育3min，孵育后自然冷却20min。取1μl杂交后的dsdna进行t4dna连接酶连接反应，反应体系如下：

pgk1.1线性质粒1ul

杂交dsdna1ul

t4dna连接酶0.5ul

10×t4dna连接酶缓冲液1ul

ddh2o6.5ul

总体积10ul

将以上体系瞬时离心后，置于pcr仪中16℃孵育30min。

如步骤4所述dna序列分别与pgk1.1线性质粒进行连接（grna#1对应于敲除质粒#1；grna#2对应于敲除质粒#2；grna#3对应于敲除质粒#3）。

2.2转化top10感受态

从-80℃冰箱中取1管top10感受态，置冰上融解。

融解后加入10μl连接产物，轻弹混匀，冰上孵育30min。

42℃水浴热击60sec，迅速拿出置冰上冷却2～3min。

向管中加入800μl无抗soc液体培养基，至摇床（37℃/160rpm）恢复培养培养45min。

4500rpm离心5min，弃去800μl上清，将沉淀悬在剩余的100μl上清中，均匀涂布于含kan抗性的的筛选平板上，倒置培养过夜。

2.3筛选阳性重组子

第二天使用上游引物vsp引物与下游负链oligo引物进行菌落pcr筛选，阳性克隆pcr正确大小应为100bp，筛选到的阳性克隆抽质粒进一步测序验证。

vsp引物：catatgcttaccgtaacttgaaag

vsp引物序列位于载体的u6启动子区域。

下游负链oligo序列即靶位点的反向互补序列，位于载体的双bbsi酶切位点。靶位点替换双bbsi酶切位点。

根据grna#1序列所构建的质粒为敲除质粒1；根据grna#2序列所构建的质粒为敲除质粒2；根据grna#3序列所构建的质粒为敲除质粒3。将测序正确的上述质粒浓缩到1μg/μl浓度以上。

3.敲除胶质母细胞瘤dhc2基因的试剂盒的构建

以上述三种敲除质粒为基础，构建出以下的敲除胶质母细胞瘤dhc2基因的试剂盒：

第一种试剂盒：包括敲除质粒1和敲除质粒2；

第二种试剂盒：包括敲除质粒1和敲除质粒3；

第三种试剂盒：包括敲除质粒1、敲除质粒2和敲除质粒3。

上述试剂盒可仅包括敲除质粒，不含有其他试剂。

实施例2：利用本发明的试剂盒稳定敲除gbm细胞系u87细胞的dhc2基因

1.u87细胞电转条件摸索

u87细胞购自美国atcc细胞库，将u87细胞制成均匀的单细胞悬液后，取一部分混匀进行台盼蓝染色计数（活细胞率＞95%方能进行电转），计算出细胞悬液浓度；取3.0×10⁶个细胞悬于无菌管中，1000rpm离心4min；取细胞沉淀，向其中加入一定量dpbs，混匀后加入pegfp-n1质粒（总量30ug，去内毒素处理），使最终总体系在330ul左右；混匀后用电转枪头分别加入3个电击杯中，使管口液面凸起，杯内无气泡形成，盖上盖进行标记后，进行电转。电转电压条件为：1200v、1300v和1400v；（30ms，1脉冲）；混匀电击后细胞取等部分细胞分别置于准备好的预热6孔板各孔中。24-48h后镜下观察，（可见及荧光视野）拍照，选择细胞活率及发绿色荧光细胞百分率相对最佳的电转条件，进行后续正式电转实验。

本实验确定最佳电转条件为：1400v；（30ms，1脉冲）。

2.u87细胞最小全致死浓度摸索（puro）

贴壁细胞：细胞悬液计数后，于24孔板每孔接种50000个细胞（每孔500ul），待细胞贴壁后向其中加入不同浓度的puro（母液浓度1mg/ml，药杀浓度梯度为：0，0.5，1，2，3，4，5ug/ml），2-3天后镜下观察细胞，选择细胞全致死的最低浓度作为后续实验的药物筛选浓度。

本实验验证的药物筛选浓度为：5μg/ml。

3.单克隆生长验证实验

有限稀释法：制成细胞悬液后进行细胞计数；取一定量细胞悬液进行稀释，使最终96孔板中每孔细胞数为1个或3个或5个；（每孔100ul）在确定稀释准确后，将稀释后的细胞于37℃、5%co2培养箱中静置培养；7-10天后镜下观察细胞是否有增殖趋势且能形成细胞簇。

本实验验证：u87细胞增殖能力良好，能够形成单克隆。

4.电转染靶细胞及单克隆的制备和生长

4.1电转染靶细胞

取状态良好的对数生长期u87细胞悬液台盼蓝计数，确定细胞数及细胞活力(细胞活力>95%)。

取5×10⁶细胞于15ml离心管中，离心弃上清（1000rpm/4min）。

将细胞沉淀悬浮于210μldpbs中，转移至1.5mlep管中，加入所构建好的敲除质粒混合液（两组：敲除质粒#1、#2各4μg；敲除质粒#1、#3各4μg）8μg，轻轻混匀。

将上述细胞质粒混合液用专用电转枪头转移至电击杯中，确定电击杯中溶液无气泡，且液面凸起后，盖上电击杯盖并至于电转仪（genloci；cat.no.gp7901），设定好电转条件后进行电转。待显示峰图正常后取出细胞液转移至六孔板培养基中（培养基需事先37℃预热且无抗生素）。

4.2单克隆的制备和生长

用5μg/ml的puro对电转后的细胞进行初步的药物筛选，筛选时间为2周。2周后，采用梯度稀释法稀释细胞至10块96孔板中，37℃，5%co2培养箱中静置培养；一周后观察单克隆生长情况，约两周后将长起来的单克隆转移至48孔中扩大培养；当细胞长满48孔1/2时，即可取出一部分（10²～10⁴），使用genlocitna抽提试剂盒(genloci；cat.no.gp0155)提取细胞基因组。

5．筛选基因敲除阳性克隆

5.1单克隆基因组dna的提取

取10²～10⁴个细胞于1.5mlep管中，室温1500rpm离心5min，小心吸掉培养液。

加入150μlpbs重悬细胞，室温1500rpm离心5min，小心弃去上清。

重复步骤2一次。

向离心管中加入适量体积（推荐体积为50～200μl）预先配制的溶液a与溶液b的混合液，枪头吹打5次，冰上放置10min，使细胞充分裂解。

加入两倍体积的无水乙醇，颠倒混匀，-20℃条件下沉淀20min以上。

4℃，12000rpm，离心20min，弃上清。

加入400～500μl预冷的75%乙醇洗涤沉淀，4℃，12000rpm，离心10min，小心弃去上清，自然晾干（不超过5min为宜）。

加入适量体积（推荐体积为10-30μl）灭菌的双蒸水溶解沉淀，溶液可直接用于pcr反应，或于-20℃保存。

5.2pcr扩增目的片段

引物设计

在敲除靶位点附近设计高特异性的primers，扩增产物长度为约360bp。primers引物序列如下：

正向引物：ggaggtagtggcaggcttta；

反向引物：cctatgctcagagaaattcc。

pcr扩增获得杂交dna：

在灭菌pcr管中配制如下反应体系，使用高特异性的引物s，扩增获得野生型和突变型充分杂交的dna产物。

mtdna25ng

wtdna25ng

10xg-taq缓冲液2.5ul

mg²⁺缓冲液1.5ul

dntp（10mm每种）0.5ul

正向引物1ul

g-taqdna聚合酶0.25ul

总体积加ddh2o至25ul。

4)pcr反应程序如下：

95℃（预变性）1.5min

95℃（变性）10s

55-62℃（退火）10s

72℃（延伸）20s

35-40个循环

72℃（彻底延伸）5min

95℃（变性）3min

自然冷却至40℃以下（野生型片段与突变型片段杂交）。

5.3测序验证并挑选阳性克隆

对挑选的单克隆细胞pcr扩增的目的片段进行测序验证，测序结果显示存在相应基因片段缺失的即为阳性克隆，对阳性克隆进行扩大培养。

实施例3：敲除质粒的筛选

本试剂盒包含特有的敲除质粒，经本发明人多次实验验证，与其它敲除质粒相比较，本试剂盒所包含的敲除质粒具备脱靶率低、特异性强的特征；且经本发明人多次实验验证，根据试剂盒所提供的方法，能够稳定敲除dhc2两等位基因，基因编辑效率极高。

下表中列出了发明人曾经设计和实验的其他grna序列及对dhc2基因的编辑情况，实验效果均不理想。

表1.其他grna序列及对dhc2基因的编辑情况

综上所述，发明人在实验中意外地发现了效果令人惊喜的敲除质粒以及它们的组合，由此提出本发明所述的敲除胶质母细胞瘤dhc2基因的试剂盒。

序列表

<110>南方医科大学南方医院

<120>一种敲除胶质母细胞瘤dhc2基因的试剂盒

<160>9

<170>siposequencelisting1.0

<210>2

<211>20

<212>rna

<213>人工序列(artificialsequence)

<400>2

cgugugucaucuuccuuaaa20

<210>2

<211>20

<212>rna

<213>人工序列(artificialsequence)

<400>2

gcuucuaguucacucaaaag20

<210>3

<211>20

<212>rna

<213>人工序列(artificialsequence)

<400>3

gauccuaaauaaaaacagac20

<210>4

<211>25

<212>dna

<213>人工序列(artificialsequence)

<400>4

caccgtttaaggaagatgacacacg25

<210>5

<211>25

<212>dna

<213>人工序列(artificialsequence)

<400>5

aaaccgtgtgtcatcttccttaaac25

<210>6

<211>25

<212>dna

<213>人工序列(artificialsequence)

<400>6

caccgcttttgagtgaactagaagc25

<210>7

<211>25

<212>dna

<213>人工序列(artificialsequence)

<400>7

aaacgcttctagttcactcaaaagc25

<210>8

<211>24

<212>dna

<213>人工序列(artificialsequence)

<400>8

caccgtctgtttttatttaggatc24

<210>9

<211>24

<212>dna

<213>人工序列(artificialsequence)

<400>9

aaacgatcctaaataaaaacagac24