一种食品安全级菌株及其制备氨基葡萄糖的方法与流程

本发明涉及一种食品安全级菌株及其制备氨基葡萄糖的方法，属于发酵工程技术领域。

背景技术：

氨基葡萄糖(glcn)(2-氨基2-脱氧-葡萄糖，cas3416-24-8)是一种天然的氨基糖，是葡萄糖的一个羟基被氨基取代后的化合物，是合成氨基聚糖的基本物质，同时也是一种糖蛋白的成份，是人体和动物的天然成分的联合组织，此外，也是重要的很多生物反应前体物质。氨基葡萄糖硫酸盐是当今世界上认可度较高的一种有效降低骨关节炎发病率的药品、当作为膳食营养补充剂时能有效的减缓骨关节炎症。在美国被列为食品补充剂而广泛使用。氨基葡萄糖硫酸盐在eular指南中，作为至高证据等级的推荐药品。

目前氨糖生产方法主要为甲壳素水解法，该方法在原料来源、环境保护以及产品安全方面存在诸多潜在问题。此外，微生物发酵法生产氨糖也有相关报道，但依然存在产量低，菌体对氨糖不耐受的情况。因此微生物发酵法生产氨糖依然存在诸多问题，限制其在工业生产中的应用。目前已有多篇报道表明，可以利用微生物发酵法生产乙酰氨基葡萄糖，如枯草芽孢杆菌及大肠杆菌发酵生产乙酰氨基葡萄糖。在该方法中，微生物代谢合成n-乙酰氨基葡萄糖后，需采用酸水解法将n-乙酰氨基葡萄糖酸解成氨基葡萄糖，该过程需引入过量酸试剂，容易造成设备损耗，产生严重环境污染，且产率低，难用于生产实践和工业化大规模生产。目前市场上存在的脱乙酰酶，多是针对乙酰氨基葡萄的寡聚体或多聚体形式进行作用而针对乙酰氨基葡萄糖单体形式存在的脱乙酰酶鲜有报道。因此，目前市场上存在可以高效生产乙酰氨基葡萄糖的方法，而缺少一种高效的，环境友好的生产氨糖的方法。

几丁二糖脱乙酰酶(diacetylchitobiosedeacetylase)，该酶不仅对几丁二糖有活性，对氨糖单体也有很高活性，在极端嗜热古菌属中几丁质的代谢途径中有重要作用，可以催化从几丁二糖的非还原性末端先脱去乙酰基，从而生成非还原性末端部分脱乙酰化的glcn-glcnac，然后在外切氨基糖苷酶的作用下生成glcn和glcnac，随后，几丁二糖脱乙酰酶再催化glcnac脱乙酰生成glcn。几丁二糖脱乙酰酶来源于极端嗜热古菌(pyrococcushorikoshiiot3)，具有极强的耐热性和良好的热稳定性，但极端嗜热古菌的生长条件要求苛刻，培养成本昂贵，难以大规模生产，因此，生产工艺简单、绿色环保且高效的氨基葡萄糖生产方法亟待开发。

技术实现要素：

本发明旨在开发一种新的glcn的生产模式：食品安全级全细胞蛋白转化。这种生产方法操作简单，一步到位，易于控制，反应条件温和，对设备要求较低。在反应过程中无需引入有毒的化学原料，反应所需底物、培养基及产物对环境不会造成污染，相较于酸水解法生产glcn，操作简单，成本低，污染小；相较于目前市场上的酶法生产，步骤简单，无需经过酶的分离及纯化等步骤，对反应对底物的专一性高。因此，全细胞转化法生产的glcn，产物纯度高，易于分离纯化，有利于大规模的工业化应用。

本发明的第一个目的在于克服现有技术的缺陷，提供一种编码几丁二糖脱乙酰酶的基因，包括(a)或(b):

(a)含有如seqidno.1所示的核苷酸序列；

(b)与seqidno.1所示的核苷酸序列同源性≥85％的dna分子。

本发明的第二个目的是提供携带所述基因的载体或细胞。

本发明的第三个目的是提供一种能够以n-乙酰氨基葡萄糖为底物转化生产氨基葡萄糖的食品安全菌。

在本发明的一种实施方式中，所述食品安全菌是表达编码所述几丁二糖脱乙酰酶基因的重组枯草芽孢杆菌。

在本发明的一种实施方式中，所述重组枯草芽孢杆菌以b.subtiliswb600为宿主，以pp43nmk为表达载体。

本发明的第四个目的是提供所述重组枯草芽孢杆菌的构建方法，是将seqidno.1所示基因与载体连接，转化至枯草芽孢杆菌细胞中。

在本发明的一种实施方式中，所述载体是pp43nmk，所述枯草芽孢杆菌细胞是b.subtiliswb600。

本发明的第五个目的是提供一种生产氨基葡萄糖的方法，是以几丁二糖脱乙酰酶或表达几丁二糖脱乙酰酶的细胞进行催化；所述几丁二糖脱乙酰酶由含seqidno.1所示核苷酸序列的dna分子编码；所述表达几丁二糖脱乙酰酶的细胞是表达含seqidno.1所示核苷酸序列的dna分子的细胞。

在本发明的一种实施方式中，所述方法应用所述重组枯草芽孢杆菌进行全细胞转化。

在本发明的一种实施方式中，所述方法以30-80g/l的n-乙酰氨基葡萄糖为底物，于30-90℃，ph4.5-9.0的条件下，转化0.5-10h。

在本发明的一种实施方式中，所述方法是以30～50g/ln-乙酰氨基葡萄糖为底物。

在本发明的一种实施方式中，所述方法是在30～50℃进行进行转化反应。

在本发明的一种实施方式中，所述方法是在0.5～4h内进行转化。

在本发明的一种实施方式中，所述细胞的终浓度为13.3～24g/l。

本发明还提供所述重组枯草芽孢杆菌在制备食品、药品、保健品中的应用。

本发明还提供含有所述重组枯草芽孢杆菌活性成分的食品。

本发明的有益效果：

本发明成功实现了pyrococcushorikoshiiot3来源的几丁二糖脱乙酰酶在枯草芽孢杆菌中的异源表达，并以此重组细胞实现了一步转化n-乙酰氨基葡萄糖生产氨基葡萄糖。与现有技术相比，本发明的全细胞转化n-乙酰氨基葡萄糖生产氨基葡萄糖的方法，操作简单，一步到位，易于控制，反应条件温和，对设备要求较低，产物得率高，而生产周期短，在3h内可生产37.53g/l的glcn。本发明技术方案缩短了生产周期，降低了生产成本，在反应过程中无需引入有毒的化学原料，反应所需底物、培养基及产物对环境不会造成污染。工艺流程简单，无需经过酶的分离及纯化等下游工艺步骤。所采用的催化菌株为枯草芽孢杆菌，属于食品安全级菌株，对人体无毒害，无副作用。全细胞转化法生产的glcn，克服现有技术的缺陷，采用生物法代替化学酸解法，打破目前工业上生产glcn的技术瓶颈，生产成本低，工艺流程简单，易于控制，方便推广，使glcn的大规模工艺生产成为可能。采用本发明的方法可以使转化率在25g/lglcnac的底物中最高达96.65％。以50/lglcnac为底物，glcn产量最高可达37.53g/l。

附图说明

图1重组质粒的构建图；

图2全细胞转化优化结果图：a，ph值对全细胞转化的影响；b，.细胞添加量对全细胞转化的影响；c，底物乙酰氨基葡萄糖对全细胞转化的影响；d，温度对全细胞转化的影响；

图3反应时间对全细胞转化的影响；

图4为不同底物glcnac浓度下的氨基葡萄糖生成速率。

具体实施方式

菌株和载体：

质粒的复制采用大肠杆菌(escherichiacolijm109)为宿主菌，脱乙酰酶的表达及菌株发酵采用枯草芽孢杆菌(b.subtiliswb600)。实验使用的质粒pp43nmk由本实验室保藏。

试剂、酶及相关试剂盒：

抗生素(硫酸卡那霉素和氨苄青霉素)购自于上海生工有限公司。各种化学试剂均为分析纯，购自于上海国药集团。各种限制性内切酶和dna连接酶购自于takara公司。1kbdnaladder、质粒小量提取试剂盒购自于上海生工有限公司。胶回收试剂盒购自于fermentas公司。

本发明中所使用的生物化学技术均为本领域中的常规技术。

种子培养基(每100ml含有)：蛋白胨1g，酵母粉0.5g，nacl1g。

发酵培养基(每100ml含有)：蛋白胨4g，酵母粉2g，nacl4g。

hpcl待测样品制备：取1ml反应液，离心去除反应中沉淀，取适量上清液，用去离子水进行适当稀释后经孔径为0.22μm的滤膜过滤。滤液供高效液相色谱分析。

氨基葡萄糖的含量测定：agilent1260高效液相色谱仪(配紫外可见检测器)采用agilentods(250mm×4.6mm，5μm)色谱柱；衍生试剂为opa(邻苯二甲醛，o-phthaldialdehyde)流动相a配制方法：称取3.02g无水乙酸钠于烧杯中，加去离子水溶解并定容至1l，然后加入200μl三乙胺，用5％的醋酸将ph调到7.20±0.05；抽滤后加入5毫升四氢呋喃，混合后备用。流动相b：配制方法：称取3.02g无水乙酸钠于烧杯中；加去离子水溶解并定容至200ml；用5％醋酸将ph调到7.20±0.05；抽滤后，再向此溶液加入400ml乙腈和400ml甲醇，混合后备用。流速：1.0ml/min；进样量：20μl；柱温：40℃。梯度洗脱。紫外检测器在检测波长为338nm下进行检测。

glcnac转化率的计算：glcnac转化率(％)＝(m1-m2)/m1×100

glcn生成率的计算：glcn转化率(％)＝m3/m1×100

其中，m1为催化反应前glcnac的摩尔质量，m2为催化反应结束后剩余的glcnac的摩尔质量，m3为催化反应过程中生成的glcn的摩尔质量。

glcnac反应速率的计算：glcnac反应速率＝(c1-c2)/t

glcn反应速率的计算：glcn反应速率＝c3/t

其中，c1为催化反应前glcnac的浓度，c2为催化反应结束后glcnac的浓度，c3为催化反应过程中生成的glcn的浓度。t为反应时间。

y值的计算：y＝p/d；其中p代表glcnac的转化率，d代表glcn的生成率。

实施例1几丁二糖脱乙酰酶重组质粒构建

合成seqidno.2所示核苷酸序列，该序列编码极端嗜热古菌(pyrococcushorikoshii)中编码几丁二糖脱乙酰酶。利用双酶切连接的方法将目的基因插入表达载体pp43nmk中(酶切位点为kpni和psti)，构建重组质粒pp43nmk-dac(如图1)。

实施例2重组大肠杆菌的构建

将实施例1所得的重组质粒pp43nmk-dac转化到克隆宿主e.colijm109中，挑取在lb卡那抗性平板上生长的单菌落，进行菌落pcr验证，培养阳性克隆子抽提质粒进行双酶切验证，挑出酶切条带正确的进行测序，测序结果正确的重组质粒转化到表达宿主b.subtiliswb600中。

实施例3几丁二糖脱乙酰酶编码基因在b.subtiliswb600中的表达

将实施例2中所得到重组枯草芽孢杆菌菌株接种到含卡那抗生素的种子培养基中37℃，220rpm震荡培养过夜。按2％的接种量(v/v)转接到新鲜含卡那抗生素的发酵培养基中37℃，220rpm震荡培养24h。

实施例4

以50g/l的glcnac作为底物，以实施例3培养所得细胞为催化剂，所添加的细胞终浓度为18.6g/l，反应时间为5min，反应温度为75℃，分别在ph4.5、5.0、6.0、7.0:、8.0、9.0的缓冲体系下测定n-乙酰氨基葡萄糖的转化速率。结果如图2a所示，在ph为8.0时，n-乙酰氨基葡萄糖的转化速率最高。结果如图2a所示，在ph为6.0～9.0时，相对酶活为72.12％-100％，当ph为8.0时，酶活力为100％。

实施例5

以50g/l的glcnac作为底物，以实施例3培养所得细胞为催化剂，反应时间为5min，反应ph为8.0，反应温度为75℃，添加的细胞终浓度分别为2.6g/l；、5.3g/l、8.1g/l、10.6g/l、13.3g/l、16.0g/l、18.6g/l、21.3g/l、24g/l)条件下测定n-乙酰氨基葡萄糖转化速率，结果如图2b所示，在细胞终浓度为18.6g/l时，n-乙酰氨基葡萄糖转化速率最高。结果如图2b所示，在细胞终浓度为13.3～24g/l时，相对酶活力为达到80.93％-100％，当细胞添加量为18.6g/l时，酶活力达到100％。

实施例6

以实施例3培养所得全细胞为催化剂，细胞终浓度为18.6g/l，反应时间为1.0h，反应ph为8.0，反应温度为60℃，底物glcnac浓度分别为10g/l、20g/l、30g/l、40g/l、50g/l、60g/l、70g/l、80g/l的条件下进行转化反应，测定氨基葡萄糖生成速率，结果如图2c所示，当glcnac浓度为30～80时，n-乙酰氨基葡萄糖的转化速率达3.07-3.76g/(l·min)，当底物浓度为50g/l时，n-乙酰氨基葡萄糖转化速率率达到最高为3.764g/l·min。

实施例7

以50g/l的glcnac作为底物，以实施例3培养所得细胞为催化剂，细胞终浓度为18.6g/l，反应时间为1h，反应ph为8.0，分别在30℃、40℃、50℃、60℃、70℃、80℃、90℃、100℃下进行全细胞转化反应，分别测定n-乙酰氨基葡萄糖转化速率及氨基葡萄糖的生成速率，结果如图2d所示，反应温度为30～100℃时，n-乙酰氨基葡萄糖转化速率达23.69-63.41g/(l·h)，氨基葡萄糖的生成速率达23.59-40.85g/(l·h)。y值为0.464-0.997。y值的大小，表征了底物在转化过程中转化为产物的比例，当底物完全转化为产物时，y值理论上等于1，因此y值越大，说明产物得率越高。而在低温条件下进行催化反应，温度低于40℃时，氨基葡萄糖生成率及n-乙酰氨基葡萄糖转化率基本一致。在反应温度为40℃时，y值为0.988，n-乙酰氨基葡萄糖转化速率为39.7g/(l·h)，氨基葡萄糖的生成速率为38.15g/(l·h)。

实施例8

以50g/l的glcnac作为底物，以培养所得细胞为催化剂，细胞终浓度为18.6g/l，反应ph为8.0，40℃条件下，转化时间分别为0.5h、1h、1.5h、2h、2.5h、3h、3.5h、4h，测定氨基葡萄糖的产量，结果如图3所示，转化时间为1～4h时，glcn产量达30.98-35.1g/l，转化1h时，glcn产量为30.98g/l；转化3h时，glcn产量为37.53g/l。结果如图3所示，转化时间为3h时glcn产量达到最高，为37.53g/l。当转化时间延长，体系中glcn的浓度有所下降。

实施例9

以实施例3培养所得全细胞为催化剂,细胞终浓度为18.6g/l，反应ph为8.0，反应温度为60℃，底物glcnac浓度分别为10g/l、15g/l、20g/l、25g/l、30g/l、35g/l、40g/l、45g/l、50g/l、55g/l的条件下进行转化反应，测定氨基葡萄糖生成速率，结果如图4所示，当glcnac浓度为10～55g/l时，转化4h，乙酰氨基葡萄的转化率达99.56％-65.84％，当底物浓度低于25g/l时，n-乙酰氨基葡萄糖转化率高于96.56％，底物浓度为25g/l时，n-乙酰氨基葡萄糖转化率达96.56％。

虽然本发明已以较佳实施例公开如上，但其并非用以限定本发明，任何熟悉此技术的人，在不脱离本发明的精神和范围内，都可做各种的改动与修饰，因此本发明的保护范围应该以权利要求书所界定的为准。

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<110>江南大学

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