本发明属于生物技术领域，具体涉及一种用于cry1a定性分析的pcr检测引物、检测方法和检测试剂盒。
背景技术：
cry1a基因是一类抗虫基因的总称，也是当前商业化应用的抗虫转基因作物中最常见的外源目的基因，包括cry1ab、cry1ac、cry1a.105、mcry1ac、cry1ab/ac等，cry1a基因在转基因检测工作中可作为一种具有广泛代表性的靶标。但是，由于转基因作物研发者往往会对cry1a基因进行序列改造或密码子修饰，导致不同转化体中的同一类型的cry1a基因在核苷酸序列上也有较大变异，因此，建立具有广泛适用性的cry1a基因定性pcr检测方法，对于转基因作物的筛选检测提供了一种高效的技术手段，为完善我国转基因作物检测手段具有十分重要的意义。
技术实现要素：
本发明的目的之一是提供一种cry1a基因定性pcr检测引物。
本发明的目的之二是建立一种cry1a基因定性pcr检测方法。
本发明的目的之三是一种cry1a基因定性pcr检测试剂盒。
一种cry1a基因定性pcr检测引物，所述定性检测引物为：cry1a-f，其核苷酸序列如序列seqidno.1所示；cry1a-r，其核苷酸序列如序列表seqidno.2所示。
一种抗虫基因cry1a定性pcr检测方法，按照如下步骤进行：
(1)dna模板制备：提取待检测样品的dna；
(2)试样pcr反应：以提取样品的dna为模板，利用cry1a基因定性pcr检测引物配置反应体系，并进行pcr扩增。
(3)对照pcr反应：在试样pcr反应的同时，应设置空白对照、阴性对照和阳性对照。以水作为空白对照；以非转基因玉米材料中提取的dna作为阴性对照；以转基因玉米mon810作为阳性对照。
(4)pcr产物电泳检测及凝胶成像分析。
所述cry1a基因定性pcr反应体系为：2×go
所述定性pcr反应的条件为：94℃变性5min；94℃变性30s，62℃退火30s，72℃延伸30s，进行35次循环；72℃延伸7min。
一种cry1a基因定性pcr检测试剂盒，包括：2×go
本发明的上述目的是通过以下技术方案来实现的：
(1)序列比对：通过查询网络数据库、国内外专利、科技论文等方式，收集不同转基因作物中的cry1a基因序列，利用dnaman软件进行序列比对分析，并设计引物对11种转基因材料中的cry1a基因进行扩增，并测序验证。
(2)引物设计：利用dnaman软件对测序结果进行序列比对分析，根据比对结果，将cry1a基因分为4类，针对4类序列中相对保守部分，利用primerpremier5.0软件进行引物设计。采用简并引物策略筛选出1对cry1a基因定性pcr检测引物，cry1a-f，其核苷酸序列如序列seqidno.1所示；cry1a-r，其核苷酸序列如序列表seqidno.2所示。扩增产物大小为282bp。
(3)pcr反应体系和反应程序优化：用二因子正交试验确定pcr反应体系中的引物终浓度和pcr反应程序中的退火温度。根据正交试验结果，确定最适合的pcr反应体系和反应程序。
(4)方法特异性测试：选取不同物种和相同物种不同品种的材料混合成测试样品，对方法进行特异性测试。若仅从含有cry1a抗虫基因材料中获得预期扩增产物，而从其他样品中未获得预期扩增产物，表明方法特异性符合要求。
(5)方法检出限测试：使用购买的欧盟标准物质，对含有cry1a抗虫基因的4类材料(bt11、mon810、bt176、das-81419-2)不同质量分数的样品进行测试，确定方法灵敏度。
(6)本发明进一步提供一种cry1a抗虫基因定性pcr检测试剂盒，包括：2×go
本发明的有益效果：本发明的cry1a基因定性pcr检测方法具有广泛适用性，对于对cry1a基因进行序列改造或密码子修饰的序列能够准确的进行检测，该方法对于转基因作物的筛选检测提供了一种高效的技术手段，为完善我国转基因作物检测手段具有十分重要的意义。
附图说明
图1是4类cry1a基因测序结果比对及引物结合位点图。
图2是引物筛选电泳结果：m、100bp；1、bt11；2、bt176；3、das-81419-2；4、mon810；5、阴性玉米；6、空白对照。
图3是pcr反应体系和反应程序优化电泳结果：3a、3b、3c、3d分别表示引物终浓度的4个梯度：0.1μmol/l、0.2μmol/l、0.4μmol/l、0.8μmol/l；1-2、3-4、5-6、7-8、9-10、11-12分别表示退火温度的5个梯度：58℃、60℃、62℃、64℃、66℃、68℃。
图4是方法特异性测试电泳结果：(4a)含cry1a基因材料测试结果：m、100bpdnaladder；1、bt11；2、mon89034；3、bt176；4、das-81419-2；5、c0030.3.5；6、sk12-5；7、bt506；8、mon88017；9、mon810；10、mon531；11、mon15985；12、t304-40；13、kefeng6；14、kmd；15、tt51-1；16、kefeng8；17、阴性玉米；18、空白对照。(4b)不含cry1a基因材料测试结果：m、100bpdnaladder；1、空白对照；2、阴性玉米；3、阳性对照(mon810)；4、mon863；5、mon88017；6、mir604；7、tc1507；8、mir162；9、59122；10、4114；11、mon87460；12、nk603；13、ga21；14、3272；15、t25。(4c)1、非转基因油菜混合样；2、非转基因水稻混合样；3、非转基因大豆混合样；4、非转基因玉米混合样品；5、非转基因棉花混合样品；6、阳性对照(mon810)；7、空白对照。
图5是利用转基因玉米bt11对方法检出限进行测试电泳结果：(5a)欧盟标准物质：转基因玉米bt11(质量分数分别为4.89％、1.96％、0.98％、0.49％、0.098％、<0.012％)；1、4.89％；2、1.96％；3、0.98％；4、0.49％；5、0.098％；6、<0.012％；7、空白对照；(5b)转基因玉米bt11质量分数为0.098％的样品60次重复实验结果，1-60、098％bt11；61、阳性对照(0.98％bt11)；62、阴性玉米；63、空白对照。
图6是利用转基因玉米mon810对方法检出限进行测试电泳结果：(6a)欧盟标准物质：转基因玉米mon810(质量分数分别为9.9％、1.98％、0.49％、<0.09％)；1、9.9％；2、1.98％；3、0.49％；4、<0.09％；5、阴性玉米；6、空白对照；(6b)转基因玉米mon810质量分数为<0.09％的样品60次重复实验结果，1-60、<0.09％mon810；61、阳性对照(1.98％mon810)；62、阴性玉米；63、空白对照。
图7是利用转基因玉米bt176对方法检出限进行测试电泳结果：(7a)欧盟标准物质：转基因玉米bt176(质量分数分别为5.0％、2.0％、1.0％、0.5％、0.1％、<0.014％)，1、5％；2、2％；3、1％；4、0.5％；5、0.1％；6、<0.014％；7、空白对照；(7b)转基因玉米bt176质量分数为0.1％的样品60次重复实验结果，1-60、0.1％bt176；61、阳性对照(1.0％bt176)；62、阴性玉米；63、空白对照。
图8是利用转基因大豆das-81419-2对方法检出限进行测试电泳结果：(8a)欧盟标准物质：转基因大豆das-81419-2(质量分数分别为>98.9％、10％、0.99％、<0.7％、0.099％)；1、>98.9％；2、10％；3、0.99％；4、<0.7％；5、0.099％；6、阴性大豆；7、空白对照；(8b)转基因玉米das-81419-2质量分数为0.099％的样品60次重复实验结果，1-60、0.099％；61、阳性对照(0.99％das-81419-2)；62、阴性大豆；63、空白对照。
具体实施方式
下面结合附图，对本发明的具体实施方式进行详细描述，但应当理解本发明的保护范围并不受具体实施方式的限制。
下述实验采用如下所述的实验材料
1、植物材料
含cry1a抗虫基因的材料：bt11、mon89034、bt176、das-81419-2、c0030.3.5、sk12-5、bt506、mon88017、mon810、mon531、mon15985、t304-40、kefeng6、kmd、tt51-1、kefeng8。
不含cry1a抗虫基因的材料：mon863、mon88017、mir604、tc1507、mir162、59122、4114、mon87460、nk603、ga21、3272、t25。
非转基因材料：(1)非转基因油菜混合样：5种非转基因油菜等量混合制成1个样品；(2)非转基因水稻混合样：5种非转基因水稻等量混合制成1个样品；(3)非转基因大豆混合样：5种非转基因大豆等量混合制成1个样品；(4)非转基因玉米混合样：5种非转基因玉米等量混合制成1个样品；(5)非转基因棉花混合样：5种非转基因棉花等量混合制成1个样品；
欧盟标准物质：转基因玉米bt11(质量分数分别为4.89％、1.96％、0.98％、0.49％、0.098％、<0.012％)、转基因玉米mon810(质量分数分别为9.9％、1.98％、0.49％、<0.09％)、转基因玉米bt176(质量分数分别为5.0％、2.0％、1.0％、0.5％、0.1％、<0.014％)、转基因大豆das-81419-2(质量分数分别为>98.9％、10％、0.99％、<0.7％、0.099％)。
2、酶与试剂
promega的go
3、实验仪器
分光光度计：thermond-1000；
离心机：thermobiogugeprimor；
pcr仪：abiveriti；
凝胶成像仪：bioradt2a；
其他仪器包括水浴锅、精密天平、通风柜、生物安全柜、电泳仪等。
实施例1植物基因组dna的提取与检测
采用植物基因组dna提取试剂盒dp305(天根生化科技(北京)有限公司)进行植物材料dna提取和纯化，提取方法如下：
1)分别取200mg粉末样品；
2)加入800μl65℃预热的gp1缓冲液，迅速颠倒混匀，将离心管放在65℃水浴1h，水浴过程中颠倒离心管以混合样品数次。
3)加入等体积酚：氯仿(1:1)，充分混匀，12000rpm离心10min。
4)转移上清至一新离心管，加入等体积氯仿，充分混匀，12000rpm离心10min。
5)取上清，加入等体积gp2，充分混匀。
6)将混匀的液体转入吸附柱cb3中，12000rpm离心30s，弃掉废液(吸附柱容积700μl，可分次加入离心)。
7)向吸附柱cb3中加入500μl缓冲液gd，12000rpm离心30s，倒掉废液，将吸附柱cb3放入收集管中。
8)向吸附柱cb3中加入600μl漂洗液pw，12000rpm离心30s，倒掉废液，将吸附柱cb3放入收集管中。
9)重复步骤8。
10)将吸附柱cb3放回收集管中，12000rpm离心2min，倒掉废液。将吸附柱cb3至于室温放置数分钟，以彻底晾干吸附材料中残余的漂洗液。
11)将吸附柱cb3转入一个干净的离心管中，向吸附膜的中间部位加入60μl0.1×te缓冲液，室温放置5min，12000rpm离心2min，将溶液收集到离心管中。
采用紫外分光光度计检测dna浓度与纯度时，dna应在od260处有显著吸收峰，od260/od280比值应为1.7-1.9。
实施例2cry1a基因测序验证
序列比对：通过查询网络数据库、国内外专利、科技论文等方式，收集11种不同转基因作物中的cry1a基因序列，利用dnaman软件进行序列比对分析，并设计引物，对cry1a基因部分序列进行扩增。引物及转基因材料信息见表1。
表1引物及转基因材料信息表
对表1中11种转基因材料中的cry1a基因进行扩增，定性pcr反应体系如下：go
实施例3cry1a基因检测方法的建立
(1)序列比对及引物设计：利用dnaman软件对测序获得的序列进行比对分析，根据比对结果(图1)，将cry1a基因分为4类，分别为①bt11、kefeng6、tt51-1、mon531、mon15985、mon88017；②mon810、mon89034；③bt176、sk12-5；④das-81419-2。
针对4类序列中相对保守部分，利用primerpremier5.0软件进行引物设计。采用简并引物策略筛选出1对cry1a基因定性pcr检测引物，简并引物信息见表2，引物筛选实验结果见图2。
表2简并引物信息
(2)pcr反应体系和反应程序优化：引物终浓度设置为0.1μmol/l、0.2μmol/l、0.4μmol/l、0.8μmol/l等4个梯度处理；退火温度设置为58℃、60℃、62℃、64℃、66℃、68℃等5个梯度处理。用二因子正交试验确定pcr反应体系中的引物终浓度和pcr反应程序中的退火温度。根据正交试验结果(见图3)，确定最适合的pcr反应体系和反应程序。
(3)方法特异性测试：根据优化好的pcr反应体系和反应程序，选取特异性实验验证样品33种对方法进行特异性测试。结果显示仅从含有cry1a基因的材料中获得预期扩增产物，而从其他样品中未获得预期扩增产物，表明方法特异性符合要求，实验结果见图4。
(4)方法检出限测试：对含有cry1a抗虫基因的4类材料(bt11、mon810、bt176、das-81419-2)，使用购买的欧盟标准物质，对不同质量分数的样品进行测试，确定方法灵敏度。对可检出的最低质量分数的测试样品，提取60份基因组dna，进行检测限测试。若60份测试样品中不少于59份的测试结果为阳性，则将该样品的质量分数确定为方法的相对检测限。否则，应重新确定方法灵敏度和进行检出限测试，直至确定方法的相对检测限。实验结果见图5-8。
(6)本发明进一步提供一种cry1a抗虫基因定性pcr检测试剂盒，包括：2×go
实施例4定性pcr反应体系优化
对表1中11种转基因材料中的cry1a基因进行扩增，定性pcr反应体系如下：go
序列表
<110>中国农业科学院生物技术研究所
<120>用于cry1a定性分析的pcr检测引物、检测方法和检测试剂盒
<160>7
<170>siposequencelisting1.0
<210>1
<211>18
<212>dna
<213>人工序列(artificialsequence)
<400>1
gctsagcgagttcgtgcc18
<210>2
<211>20
<212>dna
<213>人工序列(artificialsequence)
<400>2
gcgctgttcatgtcrttgaa20
<210>3
<211>24
<212>dna
<213>人工序列(artificialsequence)
<400>3
accggytacacycccatcgacatc24
<210>4
<211>25
<212>dna
<213>人工序列(artificialsequence)
<400>4
cggatgcgatgatgttgttgaactc25
<210>5
<211>25
<212>dna
<213>人工序列(artificialsequence)
<400>5
tgttgttctgtggtgggatttcgtc25
<210>6
<211>25
<212>dna
<213>人工序列(artificialsequence)
<400>6
atggacaacaatcccaacatcaacg25
<210>7
<211>22
<212>dna
<213>人工序列(artificialsequence)
<400>7
gtcgattatcactccggcggtt22