本发明涉及一种荧光素酶报告基因法羊干扰素τ生物学活性检测方法，属于干扰素活性检测技术领域。
背景技术：
干扰素τ广泛应用于抗病毒感染和免疫功能障碍方面的疾病治疗，其作为一种细胞因子通过与靶细胞表明的特定受体结合引起细胞内系列信号转导途径的激活，表现出抗病毒作用或免疫调节作用。目前干扰素τ在细胞内起作用的信号转导途径已经研究的比较透彻，主要是通过激活jak-stat信号级联来实现的。干扰素τ与受体结合激活受体相关jak1和tyk2，使stat1和stat2络氨酸磷酸化，磷酸化的stat1和stat2形成二聚体并转移入核，装配干扰素调节因子9(irf9)形成3聚体的干扰素刺激因子3(isgf3)。isgf3与其同源dna序列(干扰素刺激反应原件，isres)结合，直接激活干扰素刺激基因(isgs)转录，使宿主细胞进入抗病毒状态。isg抑制病毒的途径主要有，抑制病毒的转录、翻译和核酸复制；降解病毒核酸；改变宿主细胞脂代谢。因此，只要检测到isgs的启动子活性增加就可以直接反应干扰素τ的生物学活性。
mx蛋白(mxprorein)是主要的isgs，干扰素τ可以经jak-stat信号转导途径激活mx启动子(mxpromoter，pmx)，促进mx的表达，mx能够抑制负链rna病毒复制。在羊中存在mx1和mx2两种蛋白，其中mx1起主要作用。pmx有较好的专一性，它不能被白细胞介素(interleukin)、肿瘤坏死因子(tumornecrosisfactor，tnf)等其它细胞因子启动。
目前检测干扰素生物学活性主要有3种方法，病毒复制抑制、噬斑减少分析和细胞病变抑制。但这3种方法都容易产生较大误差，重复性不好，精确度低。作为改进，随后用表达gfp的重组vsv病毒替代野生型vsv病毒，可以通过荧光蛋白的表达来反映病毒感染复制的数量程度，进而判定ifn对病毒复制的抑制程度，敏感性和重复性显著改善，但仍然存在检测过程耗时过长、不便于大通量样品检测、敏感性不够理想及活病毒生物安全隐患等诸多不足。
技术实现要素：
鉴于上述现有技术存在的缺陷，本发明的目的是提供一种利用荧光素酶报告基因(luc)检测羊干扰素τ生物学活性的方法，能够简化检测过程，不需要重复进行病毒培养或质粒转染的繁琐操作，提高准确性和重复性，避免了可能存在的生物安全危害。
本发明的目的通过以下技术方案得以实现：
一种荧光素酶报告基因法羊干扰素τ生物学活性检测方法，其包括以下步骤：
采用pcr扩增获取羊mx1蛋白的pmx1的基因片段；
将pcr扩增获得的羊mx1蛋白的pmx1的基因片段插入pgl3-basic载体luc基因的5'端，再采用pcr扩增得到pmx1-luc融合基因片段；
用pmx1-luc融合基因片段替代pegfp-n1载体中的pcmv和egfp的基因片段，构建pmx1-luc质粒；
用pmx1-luc质粒转染细胞，并通过新霉素筛选出稳定转染细胞株；
对筛选出的稳定转染细胞株进行克隆化培养；
以梯度稀释的羊干扰素τ标准品制备标准曲线，确定干扰素效价与荧光值之间的数学逻辑关系；
将待检羊干扰素τ样品加入克隆化培养后的细胞中，然后检测荧光强度，结合标准曲线评价待检羊干扰素τ样品的效价。
上述的荧光素酶报告基因法羊干扰素τ生物学活性检测方法中，将待检羊干扰素τ样品加入克隆化培养后的细胞中，需要孵育一定的时间，一般6小时左右。
本发明中，pmx1是指羊mx1基因启动子区域，pcmv是指pegfp-n1质粒的cmv启动子区域。
上述的荧光素酶报告基因法羊干扰素τ生物学活性检测方法中，优选的：
pmx1的基因片段序列为序列1所示；
pmx1-luc融合基因片段序列为序列2所示。
上述的荧光素酶报告基因法羊干扰素τ生物学活性检测方法中，优选的，采用pcr扩增获取羊mx1蛋白的pmx1的基因片段的步骤包括：
根据genebank中已公布的羊mx1蛋白的基因序列，选择5'端含有isre反应元件的启动子区域，设计pcr引物，进行pcr扩增，得到扩增产物pmx1基因片段；
将扩增产物进行双酶切，再通过切胶回收纯化获得pmx1的基因片段。
上述的荧光素酶报告基因法羊干扰素τ生物学活性检测方法中，优选的，采用pcr扩增获取羊mx1蛋白的pmx1的基因片段将扩增产物进行双酶切的步骤中选用的酶为kpni和hindiii。
上述的荧光素酶报告基因法羊干扰素τ生物学活性检测方法中，优选的，将pcr扩增获得的羊mx1蛋白的pmx1的基因片段插入pgl3-basic载体luc基因的5'端，再采用pcr扩增得到pmx1-luc融合基因片段的步骤包括：
通过t4dna连接酶将pmx1的基因片段连入pgl3-basic质粒luc基因的5'端；
转化大肠杆菌dh5τ感受态细胞，摇菌，筛选出阳性克隆后提取重组pgl3-basic质粒，通过dna测序获得重组pgl3-basic质粒的pmx1片段的dna序列，选择含正确序列的重组pgl3-basic质粒；
以含正确序列的重组pgl3-basic质粒的dna序列为模板，设计pcr引物，进行pcr扩增，得到产物；
将产物进行双酶切，再通过切胶回收纯化获得pmx1-luc融合基因片段。
上述的荧光素酶报告基因法羊干扰素τ生物学活性检测方法中，优选的，将pcr扩增获得的羊mx1蛋白的pmx1的基因片段插入pgl3-basic载体luc基因的5'端，再采用pcr扩增得到pmx1-luc融合基因片段将产物进行双酶切的步骤中选用的酶为asei和xbai。
上述的荧光素酶报告基因法羊干扰素τ生物学活性检测方法中，优选的，用pmx1-luc融合基因片段替代pegfp-n1载体中的pcmv和egfp的基因片段，构建pmx1-luc质粒的步骤包括：
去除pegfp-n1载体质粒中的pcmv和egfp的基因片段；
通过t4dna连接酶用pmx1-luc融合基因片段替换原pegfp-n1载体质粒中的pcmv和egfp的基因片段，构建pmx1-luc质粒；
转化大肠杆菌dh5τ感受态细胞，摇菌，提取质粒，通过dna测序获得质粒的pmx1-luc融合基因片段的dna序列，选择正确序列的质粒；
所述正确序列为：pmx1的基因片段序列为序列1所示，pmx1-luc融合基因片段序列为序列2所示。
上述的荧光素酶报告基因法羊干扰素τ生物学活性检测方法中，设计pcr引物的方法为常规。
上述的荧光素酶报告基因法羊干扰素τ生物学活性检测方法中，优选的，用pmx1-luc质粒转染细胞，并通过新霉素筛选出稳定转染细胞株的步骤包括：
通过转染试剂将pmx1-luc质粒转染至细胞，转染96h后，换成含2μg/ml新霉素的完全培养基持续培养14日，筛选出具有新霉素抗性的细胞，即为稳定转染细胞株。
上述的荧光素酶报告基因法羊干扰素τ生物学活性检测方法中，优选的，所述克隆化培养为将筛选出的稳定转染细胞株通过有限稀释培养法培养，从而获得单个细胞形成的克隆。
上述的荧光素酶报告基因法羊干扰素τ生物学活性检测方法中，优选的，在对筛选出的稳定转染细胞株进行克隆化培养的步骤中还包括对克隆后的细胞进行检测，通过pcr鉴定细胞基因组中是否含有pmx1-luc融合基因。
上述的荧光素酶报告基因法羊干扰素τ生物学活性检测方法中，优选的，去除pegfp-n1载体质粒中的pcmv和egfp的基因片段的方法为双酶切法。
上述的荧光素酶报告基因法羊干扰素τ生物学活性检测方法中，优选的，所述细胞为羊肾细胞。
上述的荧光素酶报告基因法羊干扰素τ生物学活性检测方法中，优选的，所述的羊干扰素τ标准品为公布号为cn106367422a的专利所揭示的一种重组羊干扰素τ生物学活性检测用标准品的制备方法制备得到的重组羊τ干扰素。
本发明还提供上述的荧光素酶报告基因法羊干扰素τ生物学活性检测方法在对天然或重组羊干扰素τ进行生物学活性检测中的应用。
上述的羊干扰素τ生物学活性检测方法基于羊mx1基因启动子构建的荧光素酶报告基因，将其转染羊肾细胞，筛选稳定转染的细胞株。当羊干扰素τ(ifn-τ)与稳定转染荧光素酶报告基因的羊肾细胞共同孵育时，羊ifn-τ能够增强mx1基因启动子活性，促进荧光素酶的表达，加入底物后检测发光值与羊ifn-τ的生物学活性呈正相关，从而实现对羊ifn-τ生物学活性的定量检测。
本发明构建了羊mx1基因启动子序列与luc的融合基因，并插入真核表达质粒，转染羊肾细胞，筛选稳定转染细胞株，用梯度稀释的重组羊干扰素τ标准品和待检样品分别与细胞共孵育后，裂解细胞后加入荧光素酶底物，检测发光值，以重组羊干扰素τ标准品制备标准曲线来检测待检样品中羊干扰素τ的生物学活性。该检测方法主要有以下特点：1.大大缩短了检测时间(由传统的3-7天缩短至6-8小时)；2.省去了重复进行病毒培养或质粒转染等较繁琐的操作，只需要培养定细胞即可，避免了可能存在的生物安全危害，提高了重复性。
本发明与已有i型干扰素生物学活性荧光素酶报告基因检测法相比，采用了羊mx1基因启动子序列及羊肾细胞羊肾，专门优化用于羊ifn-τ的生物学活性检测，且使用稳定转染细胞株省去质粒重复转染步骤，简化了检测过程，提高了准确性。与传统的i型干扰素生物学活性检测方法，如病毒复制抑制(virusyield-reductionassay，vyra)、噬斑减少分析(plaquereductionassay，pra)、细胞病变抑制(cytopathiceffectreductionassay，cpera)等方法相比只需培养细胞，并用干扰素τ处理细胞6h后加入底物检测荧光强度即可完成干扰素抗病毒活性检测，极大地简化了检测过程，提高了准确性。配合羊干扰素标准品的使用，可以实现应用研究和产业化生产中羊干扰素τ生物学活性标准化测定。
本发明的突出效果为：
本发明利用荧光素酶报告基因(luc)的荧光素酶报告基因法定量检测羊干扰素τ生物学活性，能够简化检测过程，不需要重复进行病毒培养或质粒转染的繁琐操作，只需培养特定细胞，并与羊干扰素τ共孵育6h后，检测荧光强度即可完成干扰素τ生物学活性检测，提高准确性和重复性，避免了可能存在的生物安全危害。
附图说明
图1是实施例1的pmx1-luc质粒构建示意图；
图2是实施例1的荧光素酶报告基因法标准曲线和cut-off值图；
图3是实施例2的荧光素酶报告基因法与微量细胞病变抑制检测结果的相关性比较图。
具体实施方式
为了对本发明的技术特征、目的和有益效果有更加清楚的理解，现对本发明的技术方案进行以下详细说明，但不能理解为对本发明的可实施范围的限定。下述实施例中所述实验方法，如无特殊说明，均为常规方法；所述试剂和材料，如无特殊说明，均可从商业途径获得。
本发明下述实施例中所用的材料如下：
羊肾细胞为实验室按照常规方法培养，含荧光素酶报告基因的质粒pgl3-basic购自promega公司，真核表达载体pegfp-n1购自clontech公司，各种限制性内切酶、ex-taq酶、t4dna连接酶和质粒提取试剂盒购自takara公司，转染试剂fugen6购自promega公司，dmem培养基和fbs购自invitrogen公司，各种规格细胞培养板购自corning公司；vsv病毒由中国科学院武汉病毒研究所提供，多功能酶标仪购自md公司，荧光素酶检测试剂盒购自promega公司；
羊干扰素τ标准品(10万iu/ml)为公布号为cn106367422a的专利所揭示的一种重组羊干扰素τ生物学活性检测用标准品的制备方法制备得到的重组羊τ干扰素(选择其实施例1的方式)。
实施例1
本实施例提供一种荧光素酶报告基因法羊干扰素τ生物学活性检测方法，其是对重组羊干扰素τ的生物学活性进行定量检测的一种应用，本实施例的检测方法也可以对应地用于天然羊干扰素τ的活性检测，其包括如下步骤：
根据genebank中已公布的羊mx1蛋白的基因序列，选择5'端含有isre反应元件的启动子区域(干扰素反应元件见粗体字部分)，设计pcr引物)，在上游引物中引入kpni酶切位点，下游引物引入hindiii酶切位点(下划线部分为上下游引物位置)，通过酚-氯仿-异戊醇法从羊肾细胞中提取dna作为模板，使用上述pcr引物和ex-taq酶进行pcr扩增，得到扩增产物。
将扩增产物经ecori和xhoi双酶切后再通过切胶回收纯化，获得pmx1的基因片段，pmx1的基因片段序列为序列1所示；
通过t4dna连接酶将pmx1的基因片段连入pgl3-basic质粒luc基因的5'端；
转化大肠杆菌dh5τ感受态细胞，摇菌，筛选出阳性克隆后提取重组pgl3-basic质粒，通过dna测序获得重组pgl3-basic质粒的pmx1片段的dna序列，选择含正确序列的重组pgl3-basic质粒；
以含正确序列的重组pgl3-basic质粒的dna序列为模板，设计pcr引物
(上游引物：5’-attaatcggggtacccgactgagcaactgaact-3’，
下游引物：5’-tctagattacacggcgatctttccgcccttc-3’，在上游引物中引入asei酶切位点，下游引物引入xbai酶切位点)，用上述引物和ex-taq酶进行pcr扩增，得到产物；
将产物经asei和xbai双酶切后，再通过切胶回收纯化获得pmx1-luc融合基因片段，pmx1-luc融合基因片段序列为序列2所示；
采用asei和xbai双酶切法去除pegfp-n1载体质粒中的pcmv和egfp的基因片段；
通过t4dna连接酶用pmx1-luc融合基因片段替换原pegfp-n1载体质粒中的pcmv和egfp的基因片段，构建pmx1-luc质粒；
转化大肠杆菌dh5τ感受态细胞，摇菌，筛选出阳性克隆后提取质粒，通过dna测序获得pmx1-luc质粒的dna序列，选择正确序列的质粒；
所述正确序列为：pmx1的基因片段序列为序列1所示，pmx1-luc基因序列为序列2所示。
整个构建pmx1-luc质粒的构建示意图如图1所示。
用pmx1-luc质粒转染细胞，并通过新霉素筛选出稳定转染细胞株样品：采用去内毒素质粒提取试剂盒提取pmx1-luc质粒，取1μg质粒置于1.5ml无菌ep管中用optimem培养基补足体积至500μl，轻柔混匀，室温孵育5min；取1.5ml灭菌ep管，加入5μlfugen6溶于500μl无血清opti-mem培养基中，轻柔混匀，室温孵育5min；将质粒溶液和转染试剂溶液轻柔混匀，室温孵育20min；用无血清opti-mem培养基传代培养羊肾细胞至6孔板中，每孔5×105个细胞；向每孔加入质粒-转染试剂复合物，于37℃含5％co2培养箱中培养过夜；次日，移除培养基，代之以dmem(含丙酮酸钠和非必须氨基酸)完全培养基继续培养96h；之后改用含2μg/ml新霉素的完全培养基筛选培养14日，每2日更换一次新鲜的培养基；期间视细胞生长情况决定是否传代；在新霉素作用14日后存活的细胞即为稳定转染细胞；将筛选获得有新霉素抗性的细胞用含0.25μg/ml嘌呤霉素的完全培养基稀释至浓度为10个/ml，以0.1ml/孔加入96孔板中，于37℃含5％co2培养箱中培养；每日观察，挑选有单个克隆的孔，培养至细胞覆盖孔表面积1/3时，将细胞转移至6孔板中扩大培养，冻存保种，命名为羊肾-pmx1-luc。
取羊干扰素τ标准品1ml，按照1:10、1:100、1:103…1:107的梯度用完全培养基稀释；
将羊肾-pmx1-luc接种至24孔细胞培养板中过夜使细胞密度达到90％，弃去培养基；向每孔加入1ml用完全培养基稀释后的重组羊干扰素τ标准品，每个稀释度3个平行孔，设置不加重组羊干扰素τ的孔作为对照，于37℃含5％co2培养箱中继续培养6h，取出培养板，按照荧光素酶检测试剂盒说明书操作检测各孔荧光强度，检测结果如图2所示，得到标准曲线，结果显示荧光强度与重组羊干扰素τ标准品的稀释度的负对数呈线性相关r2＝0.9935，检测范围为0.1-106iu/ml。
将待检羊干扰素τ样品加入克隆化培养后的细胞中共孵育，然后检测荧光强度，结合标准曲线评价得到待检羊干扰素τ样品的效价。
实施例2
本实施例提供本发明的荧光素酶报告基因法羊干扰素τ生物学活性检测方法的检测结果与微量细胞病变抑制法检测结果的对比相关性实验。
采用荧光素酶报告基因法和微量细胞病变抑制法检测同时检测20份重组羊干扰素τ标本，通过线性回归分析显示两种方法的结果是否具有相关性。
荧光素酶报告基因法检测流程如实施例1所示。
微量细胞病变抑制法按如下操作：取重组羊干扰素τ标本1ml，用完全培养基1:100稀释后再用完全培养基倍比稀释稀释；将羊肾传代培养接种至96孔细胞培养板，每孔接种100μl细胞悬液(2×105个/ml)；再加入不同稀释度的重组羊干扰素τ100μl每孔，病毒对照和细胞对照加入100μl培养基，于37℃含5％co2培养箱中继续培养16h；弃去培养基，除细胞对照孔外，每孔加入100μl合适滴度的vsv(24h能使羊肾细胞完全脱落的vsv病毒滴度)，于37℃含5％co2培养箱中继续培养24h，显微镜下观察病毒对照孔细胞破碎达100％而细胞对照正常时，即可用结晶紫染色，水洗后肉眼观察记录，细胞对照孔中细胞完整呈紫色，病毒对照无着色(100％cpe++++)表明系统成立，在其基础上观察不同孔中着色情况，记录cpe情况，通过reed-muench法计算半数细胞病变抑制的稀释倍数，从而得到干扰素的效价。两种检测方法的相关性分析结果如图3所示，结果显示r2＞0.9，表明两者有很高的相关性。该结果表明，本发明建立的荧光素酶报告基因法羊干扰素τ活性检测方法简单、快捷，检测结果可靠、稳定，可以替代微量细胞病变抑制法这种传统的检测方法应用于天然或重组羊干扰素τ活性测定。
综上所述，本发明实施例利用荧光素酶报告基因(luc)的荧光素酶报告基因法羊干扰素τ生物学活性检测方法，能够简化检测过程，不需要重复进行病毒培养或质粒转染的繁琐操作，只需培养特定细胞，并与羊干扰素τ共孵育6h后，检测荧光强度即可完成干扰素τ生物学活性检测，提高准确性和重复性，避免了可能存在的生物安全危害，更具有实用性，适合在规模化生产中应用。
以上所述，仅为本发明较佳的具体实施方式，但本发明的保护范围并不局限于此，任何熟悉本技术领域的技术人员在本发明揭露的技术范围内，根据本发明的技术方案及其发明构思加以等同替换或改变，都应涵盖在本发明的保护范围之内。
序列表
<110>芜湖英特菲尔生物制品产业研究院有限公司
<120>荧光素酶报告基因法羊干扰素τ生物学活性检测方法
<160>2
<170>siposequencelisting1.0
<210>1
<211>1083
<212>dna
<213>人工序列(artificialsequence)
<400>1
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