人体血液具有与细胞无关并在血流中自由循环的核酸(NA)。这些NA似乎是细胞死亡(衰减)的结果，其与所有器官内的新细胞连续替换旧细胞相关。在健康人的血浆中，自由循环DNA(cfDNA，无细胞DNA)的浓度约为6ng/ml。一些疾病伴随着细胞死亡的增加，并因此伴随着患者血浆中的cfDNA浓度的增加。这些疾病的例子主要是肿瘤疾病以及一些肝脏疾病，特别是肝病[O.V.Zairayants等，病理解剖学，第1章，细胞和组织损伤和死亡.2012年，960页]。恶性肿瘤生长通常伴随着细胞死亡的增加。恶性细胞主要通过坏死而死亡，在较小程度上通过细胞凋亡而死亡；细胞碎片进入血管。这就是为什么与健康个体相比，大多数肿瘤患者的血浆中的cfDNA浓度增加。已经证实肿瘤患者的cfDNA来源于恶性细胞[HuangZ.H.等.乳腺癌患者在诊断及随访期间血浆循环DNA的定量分析“QuantitativeanalysisofplasmacirculatingDNAatdiagnosisandduringfollow-upofbreastcancerpatients”.癌症通讯(CancerLett).2006,243：64-70]。此外，这种cfDNA可以在某些条件下诱导细胞的致癌性转化[Garcia-OlmoD.C.等.在结肠直肠癌患者的血浆中循环的无细胞核酸诱导易感的培养细胞的致癌性转化“Cell-freenucleicacidscirculatingintheplasmaofcolorectalcancerpatientsinducetheoncogenictransformationofsusceptibleculturedcells”.癌症研究.2010,70：560-567]。癌细胞的能量代谢不同于健康细胞。在癌细胞中观察到无氧糖酵解增加以及线粒体DNA(mtDNA)的拷贝数随着不同癌症类型发生变化(8)。在前列腺癌和卵巢癌、子宫内膜癌、甲状腺癌、某些类型的白血病、结肠癌、脑癌、颈癌和其他形式的癌症情况下发现mtDNA拷贝数增加。相反，在胃癌、肝癌、乳腺癌和其他形式的癌症情况下发现mtDNA拷贝数减少。许多因素如年龄、氧化应激、组织特异性和肿瘤生长程度都会影响mtDNA拷贝数[MengS.等.人类癌症中线粒体DNA拷贝数的改变“MitochondrialDNAcopynumberalterationinhumancancers”.NAJMedSci.2013,6(1)：22-25.DOI：10.7156/najms.2013.0601022]。基于mtDNA结构的分析，Mitomics公司[www.mitomicsinc.com]所用的肿瘤疾病诊断方法和用于方法实施的试剂盒，其包括缺失的突变是已知的。Mitomics公司最成熟的测试是前列腺癌(前列腺核心Mitomics测试，PCMT)的测试。检测灵敏度为85％，特异性为92％。该方法的缺点如下：侵入性，分析使用前列腺活检材料，这是一个痛苦的过程。为了获得上述灵敏度和特异性参数，需要重复的活组织检查。该公司继续致力于使用该方法诊断其他形式的癌症。在文献中有许多关于总cfDNA、个体基因、血浆和血清中mtDNA的分析的工作[MehraN.等人.循环线粒体核酸对晚期前列腺癌患者的存活具有预后价值“Circulatingmitochondrialnucleicacidshaveprognosticvalueforsurvivalinpatientswithadvancedprostatecancer”.临床癌症研究.2007,13：421-426；XiaP.等人.(2009年)。通过多重实时PCR同时定量评估无循环细胞的线粒体和核DNA“Simultaneousquantitativeassessmentofcirculatingcell-freemitochondrialandnuclearDNAbymultiplexreal-timePCR”.Gen.Mol.Biology，32,1,20-24；http://core-genomics.blogspot.ru/2014/12/extracting-cell-free-dna-from-plasma.html；PLoSOne.(2014年3月3日；9(3)：e87838.doi：10.1371/journal.pone.0087838.eCollection2014]。在XiaP.等人的工作分析了健康供体的基因组DNA和mtDNA。上述和类似工作的主要缺点在于从血浆中提取DNA。自从核酸提取的生物化学方法出现以来，研究人员知道DNA部分的丢失和基因定量的变化随着提取而发生。核心基因组学(CoreGenomics)公司对不同公司的试剂盒进行了比较，并确定损失高达40％[http://core-genomics.blogspot.ru/2014/12/extracting-cell-free-dna-from-plasma.html]。在没有进行初步扩增的情况下尝试评估患者的cfDNA含量[PLoSOne.(2014年3月3日；9(3)：e87838.doi：10.1371/journal.pone.0087838.eCollection2014]。但是，由于健康患者血浆中的DNA浓度在1.6-23.7ng/ml之间变化，并且该工作的数据显示，对于患者来说，在5.1-183ng/ml之间变化，因此不可能仅通过血浆中DNA或某些基因的量来诊断疾病。本发明的任务是创建用于伴随细胞死亡增加的疾病的诊断方法和用于方法执行的试剂盒，其基于血浆中游离循环核酸的定量，而无需事先提取。该任务通过创建伴随细胞死亡增加的疾病的诊断方法来解决，其包括以下内容：a)人体血浆采样；b)血浆的等温核酸扩增；c)从根据b)项制备的反应混合物中纯化核酸；d)通过实时聚合酶链式反应方法定量核酸，并测定样品中的К系数，如下：К＝C1或或或其中Ct–聚合酶链式反应阈值循环的值；e)比较К系数与参考值；f)诊断伴随细胞死亡增加的疾病，同时К系数值小于参考值。在具体的实施例中，伴随细胞死亡增加的疾病的诊断方法的特征在于，在没有从血浆中初步分离核酸的情况下进行血浆的等温核酸扩增。在具体的实施例中，伴随细胞死亡增加的疾病的诊断方法的特征在于，血浆的等温核酸扩增在含血浆的相同管中进行。在具体的实施例中，伴随细胞死亡增加的疾病的诊断方法的特征在于，血浆核酸包括基因组DNA、线粒体DNA、信使RNA、转运RNA、微小RNA和外泌体核酸。在具体的实施例中，伴随细胞死亡增加的疾病的诊断方法的特征在于，疾病是肿瘤疾病，其伴随着细胞死亡的增加。在具体的实施例中，肿瘤疾病的诊断方法的特征在于，所述肿瘤疾病选自下组：乳腺癌、结肠癌、胰腺癌、胸腺癌、前列腺癌、卵巢癌、脑胶质瘤。在具体的实施例中，伴随细胞死亡增加的疾病的诊断方法的特征在于，疾病是肝病，伴随着细胞死亡的增加。在具体的实施例中，伴随细胞死亡增加的疾病的诊断方法的特征在于，参考值被确定为通过健康群体筛查获得的К系数的平均值。在具体的实施例中，伴随细胞死亡增加的疾病的诊断方法的特征在于，疾病是乳腺癌，其伴随着细胞死亡的增加，并且参考值等于2。在具体的实施例中，伴随细胞死亡增加的疾病的诊断方法的特征在于，疾病是肝病，其伴随着细胞死亡的增加，并且参考值等于2。在具体的实施例中，伴随细胞死亡增加的疾病的诊断方法的特征在于，糖酵解酶选自下组：己糖激酶、磷酸葡萄糖异构酶、磷酸果糖激酶、果糖二磷酸醛缩酶、磷酸丙糖异构酶、磷酸甘油醛脱氢酶、磷酸甘油酸酯激酶、磷酸甘油酸变位酶、烯醇酶和丙酮酸激酶。在具体的实施例中，伴随细胞死亡增加的疾病的诊断方法的特征在于，线粒体DNA片段选自：线粒体基因组，包括转移RNA基因、12S核糖体基因、16S核糖体基因、NADH-脱氢酶亚基因、细胞色素氧化酶亚基因、ATP合成酶亚基因和细胞色素C还原酶基因。在具体的实施例中，伴随细胞死亡增加的疾病的诊断方法的特征在于，使用DNA聚合酶phi29进行血浆的等温核酸扩增。在具体的实施例中，伴随细胞死亡增加的疾病诊断方法的特征在于，使用结合单直链DNA的蛋白质、海藻糖、随机引物、去垢剂、脱氧核苷三磷酸酯、氯化镁进行血浆的等温核酸扩增。在具体的实施例中，伴随细胞死亡增加的疾病的诊断方法的特征在于，随机引物是随机-7硫代(Random-7thio)。在具体的实施例中，伴随细胞死亡增加的疾病的诊断方法的特征在于，通过向反应混合物中加入乙二胺四乙酸酯来终止血浆的等温核酸扩增。在具体的实施例中，伴随细胞死亡增加的疾病的诊断方法的特征在于，在终止血浆的等温核酸扩增后，进行DNA提取。在具体的实施例中，伴随细胞死亡增加的疾病的诊断方法的特征在于，如下进行DNA纯化：将蛋白酶К加入到反应混合物中，将所述反应混合物在55℃孵育15分钟，用BD试剂处理反应混合物，用异丙醇沉淀DNA，并且用乙醇洗涤DNA。在具体的实施例中，伴随细胞死亡增加的疾病的诊断方法的特征在于，分离的DNA溶解在TE缓冲液中，并确定其浓度。在具体的实施例中，根据项目1，伴随细胞死亡增加的疾病的诊断方法的特征在于，编码糖酵解酶的基因是编码丙酮酸激酶的基因。在具体的实施例中，伴随细胞死亡增加的疾病的诊断方法的特征在于，使用一对寡核苷酸引物和用于检测的寡核苷酸探针来确定丙酮酸激酶基因的Ct；而且，一个寡核苷酸引物具有与SEQIDNO：1序列至少90％同源性的序列，第二寡核苷酸引物具有与SEQIDNO：2序列至少90％同源性的序列，用于检测的寡核苷酸探针具有与SEQIDNO：3序列至少90％同源性的序列。在具体的实施例中，伴随细胞死亡增加的疾病的诊断方法的特征在于，使用一对寡核苷酸引物和用于检测的寡核苷酸探针来确定丙酮酸激酶基因的Ct；而且，一个寡核苷酸引物具有SEQIDNO：1序列，第二寡核苷酸引物具有SEQIDNO：2序列，用于检测的寡核苷酸探针具有SEQIDNO：3序列。在具体的实施例中，伴随细胞死亡增加的疾病的诊断方法的特征在于，使用一对寡核苷酸引物和用于检测的寡核苷酸探针来确定NC_018923.2第12染色体片段的Ct；并且，一个寡核苷酸引物具有与SEQIDNO：4序列至少90％同源性的序列，第二寡核苷酸引物具有与SEQIDNO：5序列至少90％同源性的序列，用于检测的寡核苷酸探针具有与SEQIDNO：6序列至少90％同源性的序列。在具体的实施例中，伴随细胞死亡增加的疾病的诊断方法的特征在于，使用一对寡核苷酸引物和用于检测的寡核苷酸探针来确定NC_018923.2第12染色体片段的Ct；并且，一个寡核苷酸引物具有SEQIDNO：4序列，第二寡核苷酸引物具有SEQIDNO：5序列，用于检测的寡核苷酸探针具有SEQIDNO：6序列。在具体的实施例中，伴随细胞死亡增加的疾病的诊断方法的特征在于，使用一对寡核苷酸引物和用于检测的寡核苷酸探针，来确定M6PRBP基因的Ct；并且，一个寡核苷酸引物具有与SEQIDNO：7序列至少90％同源性的序列，第二寡核苷酸引物具有与SEQIDNO：8序列至少90％同源性的序列，用于检测的寡核苷酸探针具有与SEQIDNO：9序列至少90％同源性的序列。在具体的实施例中，伴随细胞死亡增加的疾病的诊断方法的特征在于，使用一对寡核苷酸引物和用于检测的寡核苷酸探针，来确定M6PRBP基因的Ct；并且，一个寡核苷酸引物具有SEQIDNO：7序列，第二寡核苷酸引物具有SEQIDNO：8序列，用于检测的寡核苷酸探针具有SEQIDNO：9序列。在具体的实施例中，伴随细胞死亡增加的疾病的诊断方法的特征在于，线粒体基因是COX1基因。在具体的实施例中，伴随细胞死亡增加的疾病的诊断方法的特征在于，使用一对寡核苷酸引物和用于检测的寡核苷酸探针来确定COX1基因的Ct；并且，一个寡核苷酸引物具有与SEQIDNO：10序列至少90％同源性的序列，第二寡核苷酸引物具有与SEQIDNO：11序列至少90％同源性的序列，用于检测的寡核苷酸探针具有与SEQIDNO：12序列至少90％同源性的序列。在具体的实施例中，伴随细胞死亡增加的疾病的诊断方法的特征在于，使用一对寡核苷酸引物和用于检测的寡核苷酸探针来确定COX1基因的Ct；并且，一个寡核苷酸引物具有SEQIDNO：10序列，第二寡核苷酸引物具有SEQIDNO：11序列，用于检测的寡核苷酸探针具有SEQIDNO：12序列。在具体的实施例中，伴随着细胞死亡增加的疾病的诊断方法的特征在于，用于检测的寡核苷酸探针在5'末端含有荧光染料，在3'末端含有荧光熄灭剂。在具体的实施例中，伴随细胞死亡增加的疾病的诊断方法的特征在于,荧光染料选自下组：JOE、FAM、R6G、ROX、Cy5、Cy5.5、HEX。在具体的实施例中，伴随细胞死亡增加的疾病的诊断方法的特征在于，荧光熄灭剂选自下组：BHQ1、BHQ2、BHQ3、RTQ。在具体的实施例中，伴随细胞死亡增加的疾病的诊断方法的特征在于，在具体的实施例中，伴随细胞死亡增加的疾病的诊断方法的特征在于，К在具体的实施例中，伴随细胞死亡增加的疾病的诊断方法的特征在于，在具体的实施例中，伴随细胞死亡增加的疾病的诊断方法的特征在于，该任务通过创建试剂盒进行上述伴随细胞死亡增加的疾病的上述诊断方法来解决，包括至少一对寡核苷酸引物和用于检测的寡核苷酸探针，从而确定编码糖酵解酶的基因的Ct，以及一对寡核苷酸引物和用于检测的寡核苷酸探针，从而确定线粒体基因的Ct。在具体的实施例中，本发明试剂盒的特征在于，编码糖酵解酶的基因是编码丙酮酸激酶的基因，并且为了确定编码丙酮酸激酶的基因的Ct，一对寡核苷酸引物和用于检测的寡核苷酸探针分别具有与SEQIDNO：1，SEQIDNO：2和SEQIDNO：3序列至少90％同源性的序列。在具体的实施例中，本发明试剂盒的特征在于，编码糖酵解酶的基因是编码丙酮酸激酶的基因，并且为了确定编码丙酮酸激酶的基因的Ct，一对寡核苷酸引物和用于检测的寡核苷酸探针分别具有SEQIDNO：1，SEQIDNO：2和SEQIDNO：3的序列。在具体的实施例中，本发明试剂盒的特征在于，线粒体基因是COX1基因，并且为了确定COX1基因的Ct，一对寡核苷酸引物和用于检测的寡核苷酸探针分别具有与SEQIDNO：10，SEQIDNO：11和SEQIDNO：12至少90％的同源性的序列。在具体的实施例中，本发明试剂盒的特征在于，线粒体基因是COX1基因，并且为了确定COX1基因的Ct，一对寡核苷酸引物和用于检测的寡核苷酸探针分别具有SEQIDNO：10，SEQIDNO：11和SEQIDNO：12序列。在具体的实施例中，本发明试剂盒的特征在于，其额外含有一对寡核苷酸引物和用于检测的寡核苷酸探针，以便确定NC_018923.2第12染色体片段的Ct。在具体的实施例中，本发明试剂盒的特征在于，为了确定NC_018923.2第12染色体片段的Ct，一对寡核苷酸引物和用于检测的寡核苷酸探针分别具有与SEQIDNO：4，SEQIDNO.:5和SEQIDNO：6序列至少90％同源性的序列。在具体的实施例中，本发明试剂盒的特征在于，为了确定NC_018923.2第12染色体片段的Ct，一对寡核苷酸引物和用于检测的寡核苷酸探针分别具有SEQIDNO：4，SEQIDNO：5和SEQIDNO：6序列。在具体的实施例中，本发明试剂盒的特征在于，其额外含有一对寡核苷酸引物和用于检测的寡核苷酸探针，以便确定M6PRBP基因的Ct。在具体的实施例中，本发明试剂盒的特征在于，为了确定M6PRBP基因的Ct，一对寡核苷酸引物和用于检测的寡核苷酸探针分别具有与SEQIDNO：7，SEQIDNO：8和SEQIDNO：9序列至少90％同源性的序列。在具体的实施例中，本发明试剂盒的特征在于，为了确定M6PRBP基因的Ct，一对寡核苷酸引物和用于检测的寡核苷酸探针具有SEQIDNO：7，SEQIDNO：8和SEQIDNO：9序列。在具体的实施例中，本发明试剂盒的特征在于，它额外含有一对寡核苷酸引物和用于检测的寡核苷酸探针，以便确定第12染色体片段(43119006-43120809)的Ct，以及一对寡核苷酸引物和用于检测的寡核苷酸探针，以便确定M6PRBP基因的Ct。在具体的实施例中，本发明试剂盒的特征在于，其额外含有用于等温扩增的试剂。在具体的实施例中，本发明试剂盒的特征在于，用于等温扩增的试剂包括DNA聚合酶phi29、与单直链DNA结合的蛋白质、海藻糖、随机引物、去垢剂、脱氧核苷三磷酸酯、氯化镁。在具体的实施例中，本发明试剂盒的特征在于，其额外含有用于实时聚合酶链式反应的试剂。在具体的实施例中，本发明试剂盒的特征在于，用于实时聚合酶链式反应的试剂包括热稳定DNA聚合酶，用于聚合酶链式反应的缓冲液，脱氧核苷三磷酸酯。本发明的方法和试剂盒能够实现技术结果，即对伴随细胞死亡增加的疾病的诊断；并且，所述诊断是微创的，在疾病的任何阶段，包括不存在临床症状的早期阶段，都具有高灵敏度。此外，本发明的方法和试剂盒可用于以下方面：用于包括不存在临床症状的早期阶段的良性和恶性肿瘤的鉴别诊断；用于伴随细胞死亡增加的疾病的治疗的质量控制(治疗效率监测)；进行新药的临床研究；用于初步筛查患者是否患有这样的疾病，所述疾病伴随着体内细胞死亡增加和人体血浆中出现核酸。本申请中使用以下术语和定义。核酸(NA)－它们包括DNA(脱氧核糖核酸)、RNA(核糖核酸)、mRNA(信息RNA、信使RNA)、小干扰RNA(microRNA)、tRNA(转运RNA)、来自细胞器的多核苷酸；细胞核、线粒体、细胞的细胞质、外泌体、血浆或体外合成的寡核苷酸。这个术语可以指一种类型的NA和不同类型的NA的混合：并且根据上下文，该领域的专家理解该术语的含义。糖酵解－一种代谢途径，其中葡萄糖在十种酶的帮助下变成丙酮酸盐：己糖激酶、磷酸葡萄糖异构酶、磷酸果糖激酶、果糖二磷酸醛缩酶、磷酸丙糖异构酶、磷酸甘油醛脱氢酶、磷酸甘油酸激酶、磷酸甘油酸变位酶、烯醇酶和丙酮酸激酶。系数К－基因组DNA片段与线粒体DNA片段之间的Ct比例或Ct比例的平均值如下确定：К＝C1或或或其中第12染色体片段-chr12(43119006-43120809)，NC_018923.2，(SEQIDNO：13)。本发明的发明人通过实验证明，患有伴随细胞死亡增加的疾病的患者具有系数К<2.0。健康献血者的系数К≥2.0。目前，没有发现这种规律的例外情况。这就是为什么本发明的作者将该系数命名为“健康系数”(К3)。Ct－分析信号，阈值循环，是扩增循环的值，在该值之上，由于用于检测的寡核苷酸探针的分离而产生的荧光超过背景荧光的值。在这种情况下，系数К的实验室参数的参考值—在这种情况下，在大规模健康检查期间接收的系数К的实验室参数的平均值。用于方法执行的试剂盒—试剂盒可以是“完整的试剂盒”和“不完整的试剂盒”。“完整试剂盒”是执行本发明方法各阶段所需的完整试剂盒：人血浆的取样，血浆的等温核酸扩增，从反应混合物中纯化核酸，通过实时聚合酶链式反应方法定量核酸。进行该方法的每个阶段所需的试剂是本
技术领域：
的专家所熟知的。用于等温扩增的试剂包括DNA聚合酶phi29，与单直链DNA结合的蛋白质、海藻糖、随机引物、去垢剂、脱氧核苷三磷酸酯、氯化镁。用于实时聚合酶链式反应的试剂包括寡核苷酸引物，用于检测的寡核苷酸探针，热稳定DNA聚合酶，用于聚合酶链式反应的缓冲液，脱氧核苷三磷酸酯。热稳定DNA聚合酶可以是Taq-，Tth-，Tub-，Bst-，Vent-，Pfu-聚合酶或本领域已知的其他热稳定DNA聚合酶。例如，可以使用具有抑制酶活性的抗体的SynTaqDNA聚合酶。“不完全试剂盒”是不包括完整试剂盒的至少一种成分的试剂盒，但包括至少两对合适的寡核苷酸引物和两种合适的用于检测的寡核苷酸探针。随机引物－寡核苷酸引物(引物)，其核苷酸序列是随机选择的；它用于扩增具有未知核苷酸序列的核酸片段。可以使用以下同义词：分散引物、随机引物、非特异性引物。随机引物可以被修饰；例如，可以使用7个核苷酸长度的随机引物，其具有随机-7硫代合成醇(Syntol)的3'-S-S修饰。本发明人将伴随细胞死亡增加的疾病的诊断方法命名为“ARNA”(核酸比例分析)。本发明方法由六个连续阶段组成，如下：人血浆采样；血浆的等温核酸扩增；从前一阶段获得的反应混合物中纯化核酸；通过实时聚合酶链式反应方法进行核酸定量，并测定样品中的系数К；系数К与参考值的比较；如果系数К的值小于参考值，则实际上诊断为伴随细胞死亡增加的疾病。阶段1人血浆采样人血浆用于分析。可从静脉和手指中采血：只需几滴血液添加入含有防腐剂(例如，10mM浓度的EDTA(乙二胺四乙酸盐)或肝素)的试管。为了防止细胞崩解，将含有血液的试管保持在4℃直至离心，并且应在之后不超过1小时内从血液中获取血浆。在10分钟内以1,000g进行血细胞离心。仔细选取上层，不触碰到界面。所述步骤的偏差导致血浆提取过程中血细胞崩解和分析中产生错误。在分析之前，血浆保持在-20℃冷冻长达一个月，在-80℃长达一年。阶段2血浆的等温核酸扩增用噬菌体phi29的DNA聚合酶进行扩增，而不从血浆中初步分离核酸，并且在一个管中进行，这是本发明的基本特征之一。至关重要的是，在从患者采血的瞬间存在于血浆中的核酸被取出用于在管中合成而没有变形，这在核酸分离的生物化学方法下发生。已知当使用离子交换柱时，核酸片段根据G-C组成而不同地结合。这种变形发生在核酸沉淀阶段，因为核酸的短片段(15-100个核苷酸)用醇以较低的产率沉淀。来自7个核苷酸及以上的核酸片段在扩增反应中发挥引发功能。当使用1ng或更少的少量核酸时，这些参数变得必不可少。在与单直链DNA(NEB，SSB蛋白目录号МО249S)结合的蛋白质、海藻糖、对核酸外切酶有抗性的随机引物(其为经修饰的7个核苷酸长度的寡核苷酸，具有Random-7硫代合成醇的3'-S-S修饰)，去垢剂(例如，8％聚乙二醇，但也可以使用其他合适的去垢剂)，脱氧核苷三磷酸(dNTP)，氯化镁和人血浆的核酸(表1)的存在下，通过phi29的DNA聚合酶(NEB,目录号М0269L)进行核酸扩增，并在30℃下持续16小时。表1用于DNA合成的孵育混合物组合物对于核酸变性，将制备的混合物在95℃下孵育2分钟，然后将管运送到冰上，加入含有SSB蛋白的DNA聚合酶，并在30℃下继续孵育16小时。表1显示了最佳组分浓度，其足以进行高达10μg的DNA合成。phi29的DNA聚合酶、dNTP和随机引物的酶浓度的增加能够提高DNA的产量，但合成的DNA量足以用于分析，并且不需要更大量的DNA。阶段3从反应混合物中纯化核酸第三阶段为合成终止和DNA纯化。对于合成终止，加入高达10mM的EDTA，高达100μg/ml的蛋白酶К用于分解反应混合物中的所有蛋白质，并在55℃下孵育15分钟。用两体积的试剂BD(MRC,货号DN129)进行进一步纯化，用1.2体积的异丙醇沉淀，用80％乙醇再洗涤沉淀物，随后用TE缓冲液稀释并测定DNA浓度。使用具有荧光涂料Hoechst的荧光计或分光光度计在260/280nm的光学密度方面测定DNA的浓度。阶段4通过实时聚合酶链式反应(PCR)方法定量核酸并测定样品中的系数К。通过实时PCR方法(qPCR，实时PCR)定量核酸，使用在阶段3获得的DNA。根据合成醇公司的标准方案(Syntol，货号M-428)，用PCR方法进行定量。使用探针TaqMan进行检测；根据生物研究技术(BiosearchTechnologies)公司的推荐选择探针，反应混合物的组成如表2所示，寡核苷酸引物和用于检测的寡核苷酸探针的序列如表3所示。专家可以清楚地了解该试剂盒。寡核苷酸引物和用于检测的寡核苷酸探针(数量和序列)是该组发明的非限制性实例。DNA量(等于50ng)对于表2中指定的试剂的比例是最佳的。反应中使用的DNA含量可以从几ng到0.5μg之间变化。表2用PCR方法定量孵育混合物的组成表3寡核苷酸引物和用于检测的寡核苷酸探针的序列*除了探针，还提供荧光染料和荧光熄灭剂qPCR方案如下：95℃/5分钟+(95℃/15s+62℃/20s+72℃/45s)×40个循环。基于所获得的Ct值，在样本中确定系数К：К＝C1或或或其中阶段5和6系数К与参考值的比较和用系数К值小于参考值来诊断伴随细胞死亡增加的疾病。诊断伴随着细胞死亡的增加的疾病－乳腺癌使用上述发明方法，分析取自健康供体和患有乳腺癌的患者的血浆样品。样本获自以布洛欣(Blokhin)(莫斯科市)命名的癌症中心。女性的年龄从29岁到79岁不等。从表4中给出的数据可以看出，本发明的方法和使用该方法的试剂盒能够可靠地区分健康供体的血浆和乳腺癌患者的血浆，而不管疾病阶段如何。该方法的灵敏度也足以识别第一阶段的疾病。患者的系数从1.2到1.6不等。在样本ВС24和ВС35中，系数等于1.9；用于分析的血液是在外科手术后从这些患者中取出。所有健康供体的系数均超过或等于2.0(К≥2.0)。该方法的准确度为±0.1。计算分析的数学误差ρ(ро)；对于大多数样品，它在1/10,000-1/1,000的间隔内变化；它证明了方法的可靠性。可以使用其他统计方法来处理所获得的数据。表4健康供体和乳腺癌患者的和ρ值对于表4中给出的所有样品，也确定了系数，如下所示：和并且，值得注意的是，规律性保持不变，如下所示：患有乳腺癌的患者的系数К总是小于2.0；健康献血者的系数К总是超过2.0或等于2.0。因此，基于所获得的数据，可说明，本发明的方法和试剂盒可在疾病发展的所有阶段识别伴随细胞死亡增加的疾病－乳腺癌，灵敏度>97％(采样27个真正阳性样本，0误差)。诊断伴随细胞死亡增加的疾病－肝病和治疗有效性监测使用上述发明方法，分析从没有任何疾病的临床症状的志愿者M-33的手指采集血浆样品。出乎意料的是，志愿者的验血结果显示如下：两次重复分析显示了相同的结果。在一家诊所，医生为这位志愿者诊断出肝脏肝病，并向他推荐了该治疗方法。在治疗开始后两个月后，血液测试显示治疗有效性和系数恢复到标准(К＝2.5)(请参见表5)。表5经治疗肝病患者系数К的变化日期К备注2014年5月23日1.32014年5月26日1.42014年5月26日1.3诊断－肝脏肝病2015年2月13日1.3治疗开始2015年4月6日1.62015年4月13日2.5该实施例证明了使用本发明的方法和试剂盒来诊断伴随着细胞死亡增加的疾病－没有临床症状的早期阶段的肝病的可能性，以及用于监测治疗有效性。序列表<110>生物标记-RU有限责任公司<120>诊断伴随过度细胞死亡的疾病的方法以及用于其实施的试剂盒<130>000000654<160>13<170>SIPOSequenceListing1.0<210>1<211>18<212>DNA<213>智人(HomoSapiens)<400>1gtcagggctgctctgggt18<210>2<211>19<212>DNA<213>智人(HomoSapiens)<400>2tcacgccttcgtggttctc19<210>3<211>22<212>DNA<213>智人(HomoSapiens)<400>3ccggaaggacacggcatcaaga22<210>4<211>22<212>DNA<213>智人(HomoSapiens)<400>4tgccgtcaactctccagtaaac22<210>5<211>21<212>DNA<213>智人(HomoSapiens)<400>5cctgcagctggcttctcaaag21<210>6<211>22<212>DNA<213>智人(HomoSapiens)<400>6cgctctctgttgctgccaggaa22<210>7<211>20<212>DNA<213>智人(HomoSapiens)<400>7cggtcactacggactttgtc20<210>8<211>24<212>DNA<213>智人(HomoSapiens)<400>8accaaggagcttgtgtcgtctaag24<210>9<211>21<212>DNA<213>智人(HomoSapiens)<400>9tgtccttggcgctagacacca21<210>10<211>25<212>DNA<213>智人(HomoSapiens)<400>10caaaccacaaagacattggaacact25<210>11<211>20<212>DNA<213>智人(HomoSapiens)<400>11cagctcggctcgaataagga20<210>12<211>22<212>DNA<213>智人(HomoSapiens)<400>12attcggcgcatgagctggagtc22<210>13<211>1800<212>DNA<213>智人(HomoSapiens)<400>13aatgaaatgaatgacaaagtcccctaaaataactatcagggtctcctccctccacagtgg60aggagcccctctctgtctcatgcttctctgacatggtctgcacatgctgctggttgggtg120tgaagttagtatcctaggcagaagagtgaattgacaactttatatgttttcaagttgttt180aaagtataaaccactttagcgatggatcttggaatggttgaaattgtggtttgtgaaata240agcacttaatttaagattggaaatacccacaggaataactgagcctataaaatatgaaaa300ttcacatcaacctgtaatgataaacatatatgaagtacacaacctgtaaagataagagta360tatcacatcaacctgtaatgataaaagtatatgaagtacacaaaagcatgacttgagttt420acaagacttgtccagagagcacagaaaatcacgtgctactgggtaattcagacaaatagc480tttggcttgcccttaattacctaaacaattcaggactgagctgggccatttttaactgaa540tataattagggtggttccctttggttgtgtggacctgggtatataatatgttgtatttca600attcctataatttacaggcatatgagcaggctaaatattgtaaagcaggatatggttcct660ggaggatgccagcatccacccactaattgacctgctaagaaccagcagcaacatgctctc720cagttgtggtctggaggctgaattacaataaatacccacatgagtgtcttatttagattt780gtccgattaaaaaaactcatgtacaaagctgatgagacctatgttagttgcaggttaata840cttgctgatttcttgccgtcaa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