诊断伴随过度细胞死亡的疾病的方法以及用于其实施的试剂盒与流程

技术特征：

1.一种伴随细胞死亡增加的疾病的诊断方法，其特征在于，所述方法包括以下步骤：

a)人血浆采样；

b)血浆的等温核酸扩增；

c)从根据步骤b)制备的反应混合物中纯化核酸；

d)通过实时聚合酶链式反应方法进行核酸定量，并测定样品中的系数К，如下所示：

К＝C1或或或

其中

–聚合酶链式反应阈值循环的值；

e)К系数与参考值的比较；

f)К系数值小于参考值，诊断伴随细胞死亡增加的疾病。

2.如权利要求1所述的伴随细胞死亡增加的疾病的诊断方法，其特征在于，从血浆中没有初步分离核酸的情况下进行血浆的等温核酸扩增。

3.如权利要求1所述的伴随细胞死亡增加的疾病的诊断方法，其特征在于，血浆的等温核酸扩增在装有血浆的相同的管中进行。

4.如权利要求1所述的伴随细胞死亡增加的疾病的诊断方法，其特征在于，血浆核酸包括基因组DNA、线粒体DNA、信使RNA、转运RNA、微小RNA、外泌体核酸。

5.如权利要求1所述的伴随细胞死亡增加的疾病的诊断方法，其特征在于，所述伴随细胞死亡增加的疾病是肿瘤疾病。

6.如权利要求5所述的伴随细胞死亡增加的疾病的诊断方法，其特征在于，所述肿瘤疾病选自下组：乳腺癌、结肠癌、胰腺癌、胸腺癌、前列腺癌、卵巢癌、脑胶质瘤。

7.如权利要求1所述的伴随细胞死亡增加的疾病的诊断方法，其特征在于，所述伴随细胞死亡增加的疾病是肝病。

8.如权利要求1所述的伴随细胞死亡增加的疾病的诊断方法，其特征在于，所述参考值被确定为通过健康群体筛查获得的К系数的平均值。

9.如权利要求1所述的伴随细胞死亡增加的疾病的诊断方法，其特征在于，所述伴随细胞死亡增加的疾病是乳腺癌，并且所述参考值等于2。

10.如权利要求1所述的伴随细胞死亡增加的疾病的诊断方法，其特征在于，所述伴随细胞死亡增加的疾病是肝病，并且所述参考值等于2。

11.如权利要求1所述的伴随细胞死亡增加的疾病的诊断方法，其特征在于，所述糖酵解酶选自下组：己糖激酶、磷酸葡萄糖异构酶、磷酸果糖激酶、果糖二磷酸醛缩酶、磷酸丙糖异构酶、磷酸甘油醛脱氢酶、磷酸甘油酸酯激酶、磷酸甘油酸变位酶、烯醇酶和丙酮酸激酶。

12.如权利要求所述的伴随细胞死亡增加的疾病的诊断方法，其特征在于，所述线粒体DNA片段选自线粒体基因组，包括转运RNA基因、12S核糖体基因、16S核糖体基因、NADH-脱氢酶亚基因、细胞色素氧化酶亚基因、ATP合成酶亚基因和细胞色素C还原酶基因。

13.如权利要求1所述的伴随细胞死亡增加的疾病的诊断方法，其特征在于，使用DNA聚合酶phi29进行血浆的等温核酸扩增。

14.如权利要求13所述的伴随细胞死亡增加的疾病的诊断方法，其特征在于，使用结合单直链DNA的蛋白质、海藻糖、随机引物、去垢剂、脱氧核苷三磷酸酯、氯化镁进行血浆的等温核酸扩增。

15.如权利要求14所述的伴随细胞死亡增加的疾病的诊断方法，其特征在于，所述随机引物是随机-7硫代。

16.如权利要求1所述的伴随细胞死亡增加的疾病的诊断方法，其特征在于，通过向反应混合物中加入乙二胺四乙酸酯来终止血浆的等温核酸扩增。

17.如权利要求16所述的伴随细胞死亡增加的疾病的诊断方法，其特征在于，在终止血浆的等温核酸扩增后，进行DNA提取。

18.如权利要求17所述的伴随细胞死亡增加的疾病的诊断方法，其特征在于，所述DNA纯化如下进行：将蛋白酶К加入到所述反应混合物中，将所述反应混合物在55℃孵育15分钟，用试剂处理反应混合物，用异丙醇沉淀DNA，并且用乙醇洗涤DNA。

19.如权利要求18所述的伴随细胞死亡增加的疾病的诊断方法，其特征在于，提取的DNA溶解在TE缓冲液中，并确定其浓度。

20.如权利要求1所述的伴随细胞死亡增加的疾病的诊断方法，其特征在于，编码糖酵解酶的基因是编码丙酮酸激酶的基因。

21.如权利要求20所述的伴随细胞死亡增加的疾病的诊断方法，其特征在于，使用一对寡核苷酸引物和用于检测的寡核苷酸探针来确定丙酮酸激酶基因的Ct；而且，一个寡核苷酸引物具有与SEQ ID NO：1序列至少90％同源性的序列，第二寡核苷酸引物具有与SEQ ID NO：2序列至少90％同源性的序列，用于检测的寡核苷酸探针具有与SEQ ID NO：3序列至少90％同源性的序列。

22.如权利要求20所述的伴随细胞死亡增加的疾病的诊断方法，其特征在于，使用一对寡核苷酸引物和用于检测的寡核苷酸探针来确定丙酮酸激酶基因的Ct；而且，一个寡核苷酸引物具有SEQ ID NO：1序列，第二寡核苷酸引物具有SEQ ID NO：2序列，用于检测的寡核苷酸探针具有SEQ ID NO：3序列。

23.如权利要求1所述的伴随细胞死亡增加的疾病的诊断方法，其特征在于，使用一对寡核苷酸引物和用于检测的寡核苷酸探针来确定NC_018923.2第12染色体片段的Ct；并且，一个寡核苷酸引物具有与SEQ ID NO：4序列至少90％同源性的序列，第二寡核苷酸引物具有与SEQ ID NO：5序列至少90％同源性的序列，用于检测的寡核苷酸探针具有与SEQ ID NO：6序列至少90％同源性的序列。

24.如权利要求1所述的伴随细胞死亡增加的疾病的诊断方法，其特征在于，使用一对寡核苷酸引物和用于检测的寡核苷酸探针来确定NC_018923.2第12染色体片段的Ct；并且，一个寡核苷酸引物具有SEQ ID NO：4序列，第二寡核苷酸引物具有SEQ ID NO：5序列，用于检测的寡核苷酸探针具有SEQ ID NO：6序列。

25.如权利要求1所述的伴随细胞死亡增加的疾病的诊断方法，其特征在于，使用一对寡核苷酸引物和用于检测的寡核苷酸探针，来确定M6PRBP基因的Ct；并且，一个寡核苷酸引物具有与SEQ ID NO：7序列至少90％同源性的序列，第二寡核苷酸引物具有与SEQ ID NO：8序列至少90％同源性的序列，用于检测的寡核苷酸探针具有与SEQ ID NO：9序列至少90％同源性的序列。

26.如权利要求1所述的伴随细胞死亡增加的疾病的诊断方法，其特征在于，使用一对寡核苷酸引物和用于检测的寡核苷酸探针，来确定M6PRBP基因的Ct；并且，一个寡核苷酸引物具有SEQ ID NO：7序列，第二寡核苷酸引物具有SEQ ID NO：8序列，用于检测的寡核苷酸探针具有SEQ ID NO：9序列。

27.如权利要求1所述的伴随细胞死亡增加的疾病的诊断方法，其特征在于，所述线粒体基因是COX1基因。

28.如权利要求27所述的伴随细胞死亡增加的疾病的诊断方法，其特征在于，使用一对寡核苷酸引物和用于检测的寡核苷酸探针来确定COX1基因的Ct；并且，一个寡核苷酸引物具有与SEQ ID NO：10序列至少90％同源性的序列，第二寡核苷酸引物具有与SEQ ID NO：11序列至少90％同源性的序列，用于检测的寡核苷酸探针具有与SEQ ID NO：12序列至少90％同源性的序列。

29.如权利要求27所述的伴随细胞死亡增加的疾病的诊断方法，其特征在于，使用一对寡核苷酸引物和用于检测的寡核苷酸探针来确定COX1基因的Ct；并且，一个寡核苷酸引物具有SEQ ID NO：10序列，第二寡核苷酸引物具有SEQ ID NO：11序列，用于检测的寡核苷酸探针具有SEQ ID NO：12序列。

30.如权利要求21-26、28、29任一权利要求所述的伴随细胞死亡增加的疾病的诊断方法，其特征在于，用于检测的寡核苷酸探针在5'末端含有荧光染料，在3'末端含有荧光熄灭剂。

31.如权利要求30所述的伴随细胞死亡增加的疾病的诊断方法，其特征在于，所述荧光染料选自下组：JOE、FAM、R6G、ROX、Cy5、Cy5.5、HEX。

32.如权利要求30所述的伴随细胞死亡增加的疾病的诊断方法，其特征在于，所述荧光熄灭剂选自下组：BHQ1、BHQ2、BHQ3、RTQ。

33.如权利要求1所述的伴随细胞死亡增加的疾病的诊断方法，其特征在于，

34.如权利要求1所述的伴随细胞死亡增加的疾病的诊断方法，其特征在于，

35.如权利要求1所述的伴随细胞死亡增加的疾病的诊断方法，其特征在于，

36.如权利要求1所述的伴随细胞死亡增加的疾病的诊断方法，其特征在于，

37.一种执行权利要求1所述方法的试剂盒，其特征在于，所述试剂盒包括：

至少一对寡核苷酸引物和用于检测的寡核苷酸探针，从而确定编码糖酵解酶的基因的Ct；以及

一对寡核苷酸引物和用于检测的寡核苷酸探针，从而确定线粒体基因的Ct。

38.如权利要求37所述的试剂盒，其特征在于，所述编码糖酵解酶的基因是编码丙酮酸激酶的基因，并且为了确定编码丙酮酸激酶的基因的Ct，一对寡核苷酸引物和用于检测的寡核苷酸探针分别具有与SEQ ID NO：1、SEQ ID NO：2和SEQ ID NO：3序列至少90％同源性的序列。

39.如权利要求37所述的试剂盒，其特征在于，所述编码糖酵解酶的基因是编码丙酮酸激酶的基因，并且为了确定编码丙酮酸激酶的基因的Ct，一对寡核苷酸引物和用于检测的寡核苷酸探针分别具有SEQ ID NO：1，SEQ ID NO：2和SEQ ID NO：3的序列。

40.如权利要求37所述的试剂盒，其特征在于，所述线粒体基因是COX1基因，并且为了确定COX1基因的Ct，一对寡核苷酸引物和用于检测的寡核苷酸探针分别具有与SEQ ID NO：10，SEQ ID NO：11和SEQ ID NO：12至少90％的同源性的序列。

41.如权利要求37所述的试剂盒，其特征在于，所述线粒体基因是COX1基因，并且为了确定COX1基因的Ct，一对寡核苷酸引物和用于检测的寡核苷酸探针分别具有SEQ ID NO：10，SEQ ID NO：11和SEQ ID NO：12序列。

42.如权利要求37所述的试剂盒，其特征在于，所述试剂盒额外含有一对寡核苷酸引物和用于检测的寡核苷酸探针，以便确定NC_018923.2第12染色体片段的Ct。

43.如权利要求42所述的试剂盒，其特征在于，为了确定NC_018923.2第12染色体片段的Ct，所述一对寡核苷酸引物和用于检测的寡核苷酸探针分别具有与SEQ ID NO：4，SEQ ID NO.:5和SEQ ID NO：6序列至少90％同源性的序列。

44.如权利要求42所述的试剂盒，其特征在于，为了确定NC_018923.2第12染色体片段的Ct，所述一对寡核苷酸引物和用于检测的寡核苷酸探针分别具有SEQ ID NO：4，SEQ ID NO：5和SEQ ID NO：6序列。

45.如权利要求37所述的试剂盒，其特征在于，所述试剂盒额外含有一对寡核苷酸引物和用于检测的寡核苷酸探针，以便确定M6PRBP基因的Ct。

46.如权利要求45所述的试剂盒，其特征在于，为了确定M6PRBP基因的Ct，所述一对寡核苷酸引物和用于检测的寡核苷酸探针分别具有与SEQ ID NO：7，SEQ ID NO：8和SEQ ID NO：9序列至少90％同源性的序列。

47.如权利要求45所述的试剂盒，其特征在于，为了确定M6PRBP基因的Ct，所述一对寡核苷酸引物和用于检测的寡核苷酸探针具有SEQ ID NO：7，SEQ ID NO：8和SEQ ID NO：9序列。

48.如权利要求37所述的试剂盒，其特征在于，所述试剂盒额外含有一对寡核苷酸引物和用于检测的寡核苷酸探针，以便确定第12染色体片段(43119006-43120809)的Ct，以及一对寡核苷酸引物和用于检测的寡核苷酸探针，以便确定M6PRBP基因的Ct。

49.如权利要求37所述的试剂盒，其特征在于，所述试剂盒额外含有用于等温扩增的试剂。

50.如权利要求49所述的试剂盒，其特征在于，所述用于等温扩增的试剂包括DNA聚合酶phi29、与单直链DNA结合的蛋白质、海藻糖、随机引物、去垢剂、脱氧核苷三磷酸酯、氯化镁。

51.如权利要求37所述的试剂盒，其特征在于，所述试剂盒额外含有用于实时聚合酶链式反应的试剂。

52.如权利要求51所述的试剂盒，其特征在于，所述用于实时聚合酶链式反应的试剂包括热稳定DNA聚合酶、用于聚合酶链式反应的缓冲液、脱氧核苷三磷酸酯。