本发明属于靶向材料的制备领域，具体涉及一种用于吸附降解残留油的复合微生物导弹载体材料及其制备方法。
背景技术：
近些年来，海上石油开采、船舶运油导致的溢油事故越发频繁，使得溢油污染成为世界性的灾难，溢油事故往往会给海洋环境带来难以修复的生态灾难，给各国带来巨大的经济损失。所以，研究高效清除溢油油污的方法，恢复受污染的生态环境，是各海洋国家、政府和科研部门极为关注的责任。
目前，清理溢油污染的主流方法是物理法和化学法，二者可以快速的清理大部分溢油，但对于机械无法清除的海面薄油膜、乳化油和沙滩的残油，以及化学药品被禁止使用的近海岸，安全可靠的生物法就体现了无可替代的重要作用。事实上，按照现有事故性溢油量计算，进行污染海域的生物修复需要5000吨以上的海洋烷烃降解菌，单纯的依靠自然降解过程时间漫长，环境受害广且深。所以，人为培养微生物强化降解，受到很多科研部门的关注。虽然生物法处理溢油具有安全、环保、可靠等优点，但目前在实际应用方面仍然存在许多问题亟待解决。施用游离降解菌与本土微生物存在拮抗作用，而且还存在菌体易流失、对环境条件变化敏感等缺点。石油降解菌株的固定化技术能够初步解决这一问题，在克服游离态菌株与本土微生物的拮抗作用具有一定的效果，但仍然存在载体材料吸油率低、机械强度弱、可降解性差等缺点，限制了生物法处理溢油的大规模推广。
选择适宜的固定化微生物载体是实现产业化的关键，而载体的好坏又取决于材料的吸附率、机械强度、寿命和包埋微生物细胞的活性。理想的载体材料具有吸油率高、可生物降解、廉价、丰富的孔隙等特点。载体材料也应具有悬浮性，悬浮性的载体材料有利于微生物在油水界面繁殖，使微生物更容易与溢油接触。许多载体材料已报道用于修复溢油，然而，寻找吸油率高又具有漂浮性的材料并非易事。活性碳是应用最广泛的固定化载体，如公开号cn103923905a、cn103923904a、cn103923903a制备的稻草秸秆基、玉米芯基、花生壳基活性碳载体，制得的修复剂具有漂浮性，但对溢油的吸附率低；公开号cn103194437a使用聚乙烯醇-硼酸二次交联完成细菌固定化用于污水处理，包埋载体有机械强度高、价格低廉等优点，但产品不具有漂浮性，不能用于处理海面的油膜。公开号cn103951039a发明的聚氨酯载体的硝化细菌固定化生物活性填料具有漂浮性，但聚氨酯泡沫不易降解、易造成二次污染。
以生物导弹药物的思路，可以定向制造，就是根据需要制备降解不同油品成分的吸附材料。基于这些特点，我们制成“微生物导弹”运送微生物至悬浮油滴处，从而达到吸附降解的效果。具有靶向性的特异性生物分子或基团亲和配位原理合成的功能高分子载体、亲油性强的材料与油滴之间通过靶向基团相互吸引，可以成为清除溢油残油污染的理想载体。制备这种具有高吸附性能的载体可以对其表面进行化学修饰从而赋予其表面多种活性功能功能团(如-oh，-cooh，-cho，-nh2，-sh等)。生物导弹载体在生物医学、固定化微生物等许多领域显示出强大的生命力。如公开号cn101045067a“纳米生物导弹”对癌细胞识别的特异性高，通过爆炸的物理作用彻底杀死癌细胞。公开号cn104689339a“一种直接导入式多用途生物导弹”，使用分子偶联剂将制导装置、导入装置以及杀伤装置应用化学偶联法偶合，用于治疗疾病有显著效果。公开号cn1526450a“镭核素体内放射抗癌生物导弹”使用矿石提纯来制取镭核素，通过化合反应配以生化药物载体。
技术实现要素：
本发明的首要目的是：提供一种可降解的多孔纳米材料，与油脂具有良好的亲和力，具有追踪污油的能力。
本发明的另一个目的在于：提出一种可用于降解海上溢油残留的残油的复合微生物靶向材料，不仅可以解决施用游离降解菌与本土微生物存在拮抗作用，还具有追踪油污的能力。
本发明的再一个目的在于：提供制备所述的复合微生物靶向材料的方法。
为达到上述目的，本发明采用的技术解决方案是：
首先，本发明的第一方面提供一种可降解的多孔纳米材料，它是经过改性的脂肪族聚酯多孔纳米颗粒，其内层为极性基团，最外层表面为非极性亲脂基团；所述的多孔纳米颗粒的孔洞呈三维网络状结构。
本发明优选的多孔纳米材料中，所述的脂肪族聚酯可以选自聚乳酸、聚羟基乙酸或聚己内酯或其共聚物中的任意一种；最优选聚乳酸。
本发明优选的多孔纳米材料中，所述内层的极性基团可以是羟基、羧基、氨基或羰基中的任意一种；最优选羟基。
本发明优选的多孔纳米材料中，所述最外层表面的非极性亲脂基团可以选自烃基，包括甲基、脂烃基、芳烃基、卤素或酯基等中的任意一种；最优选甲基。
本发明优选的多孔纳米材料，所述的改性包括：先将脂肪族聚酯多孔纳米颗粒经表面改性交联极性官能团，再在交联有极性官能团的多孔纳米颗粒表面进一步交联非极性亲脂基团。由此形成了外层为非极性亲脂基团、内层为极性基团的脂肪族聚酯多孔纳米颗粒。
本发明的多孔纳米材料整体上是脂肪族聚酯多孔纳米颗粒，其内外层分别具备了不同性质的官能团；其中，脂肪族聚酯本身具有良好的可降解性，使得本发明的多孔纳米材料也天然地具有优异的可降解性；此外，其外层亲脂基团具有良好的油脂亲和力，加之脂肪族聚酯本身所具有的亲脂性，使得本发明的多孔纳米材料整体亲油性达到了比较理想的水平，对于油脂类物质具有良好的追踪效果。
本发明最优选的所述可降解的多孔纳米材料，它是经过改性的聚乳酸多孔纳米颗粒，其内层为富含羟基的极性基团层，外层为富含甲基的聚硅氧烷层，所述的外层与内层之间通过醚键连接；所述的多孔纳米颗粒的孔洞呈三维网络状结构，平均孔径为20-150μm，孔隙率超过80％。
在此基础上，本发明的第二方面进一步提供一种可吸附、降解油脂的复合微生物靶向材料，它以本发明所述的可降解多孔纳米材料为载体，所述的载体上固定有复合嗜油菌。
本发明的复合微生物靶向材料中，所述的复合嗜油菌是现有技术中多种可有效降解石油等油脂的菌株的组合；优选的复合嗜油菌选自柴油食烷菌、泊库岛食烷菌、蜡样芽孢杆菌、地衣芽孢杆菌或鼠李糖乳杆菌中的任意两种以上菌株的组合；最优选的复合嗜油菌是由柴油食烷菌、泊库岛食烷菌、蜡样芽孢杆菌、地衣芽孢杆菌和鼠李糖乳杆菌共同组成的菌株组合。
本发明所述的复合微生物靶向材料中，所述的复合嗜油菌可以视为用于降解污油的多菌种共生的微生态系统，将该微生态系统利用现有的微生物固定化技术固定于本发明所述的具有追踪油污能力的多孔纳米材料载体之上，形成复合微生物靶向材料，鉴于其出色的污油靶向性能，本发明人形象地称之为“复合微生物导弹”。本发明的“复合微生物导弹”可以广泛应用于各种水体、沙滩、砂石地等不同环境。与现有技术中的常规微生物修复剂不同，本发明的复合微生物靶向材料具有更强的污油的亲和力，散落在残留于海水表面的薄油膜上则牢牢地亲和油膜，散落于海水中则漂于水面找寻油滴和乳化油，落于沙滩上，则在雨水、海潮、海风的推动下去亲和留在沙滩和多孔砂石中的残油，不仅解决了菌株易流失的问题，还具有了追踪污油的能力。
本发明的第三方面提供制备所述的复合微生物靶向材料的方法，包括以下步骤：
1)制备脂肪族聚酯多孔纳米颗粒，使所述颗粒中孔洞呈三维网络状结构；
2)将步骤1)得到的脂肪族聚酯多孔纳米颗粒通过表面改性交联极性基团；
3)对两种以上的嗜油菌进行共同培养得到复合嗜油菌，将复合嗜油菌固定在步骤2)表面改性后的脂肪族聚酯多孔纳米颗粒上；
4)将步骤3)固定了复合嗜油菌的脂肪族聚酯多孔纳米颗粒表面进一步交联亲脂基团，得到本发明所述的复合微生物靶向材料。
本发明所述的方法中，步骤1)所述的制备脂肪族聚酯多孔纳米颗粒的方法可以是现有的各种方法；优选的方法为：脂肪族聚酯与致孔剂熔解后按(25～40):(60～80)的质量比混合制成混合物纳米颗粒，然后去除所述致孔剂；该方法得到的颗粒平均孔径在20-150μm，孔隙率超过80％。
本发明优选的方法中，步骤1)制备得到的脂肪族聚酯多孔纳米颗粒进一步经粗化处理，以使多孔纳米颗粒表面得到微观粗糙的结构，表面粗化程度是决定多孔纳米颗粒交联极性基团结合力好坏的关键；本发明最优选的粗化方法是将步骤1)制得的所述多孔纳米颗粒放入1％～5％的h2o2溶液中处理30min；由此可获得与极性基团交联的最佳结合力。
本发明所述的方法中，步骤1)所述的脂肪族聚酯可以是现有的各种满足制备多孔纳米颗粒要求的脂肪族聚酯；可选自聚乳酸、聚羟基乙酸或聚己内酯或其共聚物中的任意一种；最优选聚乳酸。
本发明所述的方法中，步骤2)所述的通过表面改性交联极性基团，可以通过现有的多种方法交联各种有利于固定嗜油菌的极性基团；优选交联羟基、羧基、氨基或羰基中的任意一种；最优选交联羟基。
本发明更优选的方法中，步骤2)所述的表面改性方法如下：将步骤1)得到的脂肪族聚酯多孔纳米颗粒使用多羟基化合物改性，得到羟基化的脂肪族聚酯多孔纳米颗粒。
本发明所述的方法中，步骤3)所述的两种以上的嗜油菌可以选自现有的能够降解污油的任意两种以上嗜油菌；优选的方法中，嗜油菌选自：柴油食烷菌、泊库岛食烷菌、蜡样芽孢杆菌、地衣芽孢杆菌或鼠李糖乳杆菌中的任意两种以上菌株的组合；最优选的复合嗜油菌是由柴油食烷菌、泊库岛食烷菌、蜡样芽孢杆菌、地衣芽孢杆菌和鼠李糖乳杆菌共同组成的菌株组合。
本发明优选的方法中，步骤4)所述的表面交联亲脂基团是使用硅烷偶联剂水解产物与步骤3)改性后的脂肪族聚酯多孔纳米颗粒表面的极性基团反应而完成的；与此同时硅烷偶联剂水解产物相互之间也发生缩聚，产生交联作用，最后在多孔纳米颗粒表面生成聚硅氧烷层。所述的硅烷偶联剂进一步优选三甲基氯硅烷或甲基三氯硅烷(mts)。
本发明最优选的一种制备所述复合微生物靶向材料的方法，包括以下步骤：
1.聚乳酸(pla)与淀粉致孔剂按照(25～40):(60～80)质量比，进行加热熔解混合，制成pla与淀粉相混合的颗粒；
2.步骤1所得颗粒加入到淀粉酶缓冲液中，30～40℃振荡培养2～3天，得到pla多孔材料；所得pla多孔材料放入1％～5％的h2o2溶液中粗化处理30min，用去离子水洗涤至中性，得到粗化的pla多孔材料；
3.取2～10份步骤2得到的粗化后的pla多孔材料使用1～5份β-环糊精(β-cd)溶液改性，使其交联富含羟基的β-环糊精，该反应方程式如下：
4.以柴油食烷菌、泊库岛食烷菌、蜡样芽孢杆菌、地衣芽孢杆菌和鼠李糖乳杆菌组成的混合菌株作为嗜油菌，共同进行增菌培养，24℃里恒温培养1～3d，得到复合微生物液体；
5.称取步骤3得到的材料2～10份，加入步骤4得到的复合微生物液体中，震荡培养1-3d，滤去培养液，得固定化的复合微生物载体；
6.将步骤5所得复合微生物载体与0.1～5份甲基三氯硅烷在有机溶剂中浸泡3～8min，使甲基三氯硅烷的水解产物与步骤5所得复合微生物载体表面的羟基缩合反应，完成甲基在复合微生物载体表面的交联，同时甲基三氯硅烷的水解产物相互之间也发生缩聚，形成交联，在所述复合微生物载体最外表面生成富含亲脂性的甲基的聚硅氧烷层；该反应方程式如下：
与现有技术相比，本发明的制备方法以生物导弹药物的思路，在纳米材料制备方法的基础上，通过调控参数，得到可降解的多孔纳米材料，通过对纳米材料进行表面改性，使其表面带上特定官能团，再经进一步处理后接枝亲脂基团，所得“微生物导弹”的内层为极性基团，外层为非极性亲油基团，使材料具有追踪污油的能力，显现出导弹的作用。不仅可以解决施用游离降解菌与本土微生物存在拮抗作用，还具有追踪油污的能力。由于分子耦合作用，接枝后的材料作为靶向性“弹头”，对于吸附柴油等污油表现出比pla单体更高的识别与选择结合能力，且pla分子上亲油性脂肪族聚酯的存在能增强其亲油性，这就为材料自动寻找吸附残油开辟了新途径，体现出微生物导弹的功能。微生物导弹可以在风浪流的作用下自动追踪并吸附自身重量50-80倍的柴油，降解率3天达到80％以上。
具体实施方式
以下通过列举具体实施例的方式进一步说明本发明的技术方案及效果。但本发明的范围不限于所列举的具体实施例。
按重量份计，本发明各实施例用到的原料及试剂如下：
实施例1.
制备一种可追踪、吸附并降解海面残油的“复合微生物导弹”，具体方法如下(其中所述“份”除特殊说明外均指重量份)：
1.35份聚乳酸与65份淀粉按进行加热熔解混合，得到聚乳酸与淀粉混合颗粒，标记为plas。
2.将步骤1得到的plas颗粒加入到装有淀粉酶缓冲液的三角瓶中，40℃，180r/min振荡培养，降解其中的致孔剂成分，3天致孔剂成分降解率达到100％。降解后的pla多孔材料放入2％的h2o2溶液中粗化处理30min，用去离子水洗涤至中性，得到粗化的pla多孔材料，孔洞呈三维网络状结构，平均孔径的直径为20-150μm，孔隙率超过80％。
3.取2份步骤2得到的材料使用2份β-环糊精(β-cd)溶液改性，操作条件为：在80℃恒温超声振荡条件下，将β-cd溶液逐滴加入pla溶液中，振荡4h，然后30℃恒温蒸馏水中使用透析袋透析36小时，除去溶剂与游离的β-cd，得到交联羟基的产物；
4.固定化菌体：以降解石油效果较好的混合菌株(包括柴油食烷菌、泊库岛食烷菌、蜡样芽孢杆菌、地衣芽孢杆菌、鼠李糖乳杆菌)作为嗜油菌，使用2216e海水培养基用于海生嗜油菌的增菌培养，24℃里恒温培养3d，得到复合微生物。
5.称取步骤3得到的交联羟基材料2份，加入步骤4已培养3d的复合微生物液体中，在摇床上震荡培养1d，滤去培养液，得固定化的复合微生物载体；
6.把步骤5所得2份复合微生物载体放入含有0.5％(v/v)mts的正己烷溶液中，浸泡5min，取出晾干，得到接枝0.5份甲基三氯硅烷的复合微生物载体。
由于分子耦合作用，接枝后的材料作为靶向性弹头，对于吸附柴油表现出比pla单体更高的识别与选择结合能力，且pla分子上亲油性脂肪族聚酯的存在能增强其亲油性，这就为材料自动寻找吸附残油开辟了新途径，体现出微生物导弹的功能。微生物导弹可以在风浪流的作用下自动追踪并吸附自身重量80倍的柴油，降解率3天达到85％。
实施例2.
制备一种可追踪、吸附并降解海面油污的“复合微生物导弹”，具体方法如下(其中所述“份”除特殊说明外均指重量份)：
1.25份聚乳酸与80份淀粉进行加热熔解混合，得到聚乳酸与淀粉混合颗粒，标记为plas。
2.将步骤1得到的plas颗粒加入到装有淀粉酶缓冲液的三角瓶中，30℃，180r/min振荡培养，降解其中的致孔剂成分，3天致孔剂成分降解率达到100％。降解后的pla多孔材料放入4％的h2o2溶液中粗化处理30min，用去离子水洗涤至中性，得到粗化的pla多孔材料，孔洞呈三维网络状结构，平均孔径的直径为20-150μm，孔隙率超过80％。
3.取10份步骤2得到的材料使用5份β-环糊精(β-cd)溶液改性，操作条件为：在80℃恒温超声振荡条件下，将β-cd溶液逐滴加入pla溶液中，振荡4h，然后30℃恒温蒸馏水中使用透析袋透析36小时，除去溶剂与游离的β-cd，得到交联羟基的产物。
4.固定化菌体：以降解石油效果较好的混合菌株(包括柴油食烷菌、泊库岛食烷菌、蜡样芽孢杆菌、地衣芽孢杆菌、鼠李糖乳杆菌)作为嗜油菌，使用2216e细菌培养基用于海生嗜油菌的增菌培养，24℃里恒温培养2d，得到复合微生物。
5.称取步骤3得到的材料8份，加入已培养2d的复合微生物液体中，在摇床上震荡培养2d，滤去培养液，得固定化的复合微生物载体；
6.把步骤5所得8份复合微生物载体放入含有0.5％(v/v)mts的正己烷溶液中，浸泡5min，取出晾干，得到接枝2.5份甲基三氯硅烷的复合微生物载体。
由于分子耦合作用，接枝后的材料作为靶向性弹头，对于吸附柴油表现出比pla单体更高的识别与选择结合能力，且pla分子上亲油性脂肪族聚酯的存在能增强其亲油性，这就为材料自动寻找吸附残油开辟了新途径，体现出微生物导弹的功能。微生物导弹可以在风浪流的作用下自动追踪并吸附自身重量80倍的柴油，降解率3天达到85％。
实施例3.
制备一种可追踪、吸附并降解海面油污的“复合微生物导弹”，具体方法如下(其中所述“份”除特殊说明外均指重量份)：
1.40份聚乳酸与60份淀粉进行加热熔解混合，得到聚乳酸与淀粉混合颗粒，标记为plas。
2.将步骤1的plas颗粒加入到装有淀粉酶缓冲液的三角瓶中，40℃，180r/min振荡培养，降解其中的致孔剂成分，2天致孔剂成分降解率达到100％。降解后的pla多孔材料放入1％的h2o2溶液中粗化处理30min，用去离子水洗涤至中性，得到粗化的pla多孔材料，孔洞呈三维网络状结构，平均孔径的直径为20-150μm，孔隙率超过80％。
3.取2份步骤2得到的材料使用1份β-环糊精(β-cd)溶液改性，操作条件为：在80℃恒温超声振荡条件下，将β-cd溶液逐滴加入pla溶液中，振荡4h，然后30℃恒温蒸馏水中使用透析袋透析36小时，除去溶剂与游离的β-cd，得到交联羟基的产物；
4.固定化菌体：以降解石油效果较好的混合菌株(包括柴油食烷菌、泊库岛食烷菌、蜡样芽孢杆菌、地衣芽孢杆菌、鼠李糖乳杆菌)作为嗜油菌，使用2216e细菌培养基用于海生嗜油菌的增菌培养，24℃里恒温培养3d，得到复合微生物。
5.称取步骤3得到的材料2份，加入已培养3d的复合微生物液体中，在摇床上震荡培养3d，滤去培养液，得固定化的复合微生物载体。
6.把步骤5所得2份复合微生物载体放入含有0.5％(v/v)mts的正己烷溶液中，浸泡5min，取出晾干，得到接枝1份甲基三氯硅烷的复合微生物载体。
由于分子耦合作用，接枝后的材料作为靶向性弹头，对于吸附柴油表现出比pla单体更高的识别与选择结合能力，且pla分子上亲油性脂肪族聚酯的存在能增强其亲油性，这就为材料自动寻找吸附残油开辟了新途径，体现出微生物导弹的功能。微生物导弹可以在风浪流的作用下自动追踪并吸附自身重量80倍的柴油，降解率3天达到85％。
试验例.
以本发明实施例1所制备的“复合微生物导弹”为样品，通过常规试验检测并计算其对于对重油、原油和柴油的吸油能力。
吸油能力按照公式(1)、(2)计算：
式中：k为吸油率，g/g；q为保油率，％；m1为样品吸附油品之前的质量；m2为样品浸没于溶液中吸附饱和取出静置约30s后的质量；m3为样品从油中取出继续静置15min后的质量。
平行试验3次，记录实验结果，取平均值，得到m1、m2和m3，计算得到相应的吸油率k和保油率q，结果见表1。
表1实施例1制备的材料对不同油品的吸附性能测试结果
从上述结果可知，本发明的“复合微生物导弹”对重油、原油和柴油等污油的吸油率和保留率都很高，因而具备追踪、吸附和降解污油的能力。