本发明属于酶工程领域，具体涉及一种酶法制备乙酰辅酶a的方法，特别涉及一种极耐热性丙酮酸铁氧化还原蛋白酶(pfor)合成乙酰辅酶a的方法。
背景技术：
乙酰辅酶a是能源物质代谢的重要中间代谢产物，在许多代谢过程中起着关键的作用。乙酰辅酶a是糖类、氨基酸和脂肪酸等多种有机物代谢的中间产物。乙酰辅酶a广泛参与糖、蛋白质、脂肪和核酸等物质的代谢过程，包括分解代谢与合成代谢。
乙酰辅酶a被广泛应用到生物医学研究中，比如用于代谢疾病的药物研发，以脂类和聚酮化合物为基础的抗癌药物的研发。在脂肪酸、胆固醇、酮体为基础药物合成中，乙酰辅酶a作为一种前体分子起着重要的作用。这些药物和一些重要的类脂合成中，最关注的一个问题是前体分子的价格。上述分子物质的合成中，乙酰辅酶a的需求量巨大。目前乙酰辅酶a的合成方法主要有化学合成方法和酶法合成方法。化学方法合成乙酰辅酶a的缺点是使用有机溶剂，不环保，而且反应不专一性；而酶法合成乙酰乙酰a是目前发展的趋势，相比化学法，酶法合成乙酰辅酶a更加环保，反应条件更温和，反应专一性高。目前酶法合成乙酰辅酶a采用的酶是乙酰辅酶a合成酶(acs)，但是该酶需要用到昂贵的辅因子atp，限制了该酶的应用范围；同时现有的乙酰辅酶a合成酶(acs)稳定性差，容易失活，造成酶的成本偏高，因此，常常需要将乙酰辅酶a合成酶(acs)进行固定化，这增加了反应步骤。此外，常温菌柠檬酸菌(citrobactersp.s-77)来源的丙酮酸铁氧化还原蛋白酶可以使用tpp代替昂贵的atp为辅因子，合成乙酰辅酶a，但是该酶热稳定性差，容易失活，需要对酶进行固定化，增加了合成乙酰辅酶a的操作步骤，而且该酶经过固定化后，其催化活性下降了64％，只有原来酶活性的36％，这增加了酶使用的成本。因此有必要探索新型的、环保的、低成本的、操作简单的可以规模化生产乙酰辅酶a的合成方法。
技术实现要素：
本发明的目的在于克服现有技术中存在的缺陷，如化学合成法使用有机溶剂，不环保，而且反应不专一性，乙酰辅酶a合成酶热稳定性差，容易失活，固定化后催化活性下降，增加酶使用成本等，本发明提供了一种酶法制备乙酰辅酶a的方法，利用丙酮酸铁氧化还原蛋白酶(pfor)、底物丙酮酸钠，coa，辅因子tpp和mgcl2,甲基紫精，dtt，在无氧密闭反应瓶中进行反应得到乙酰辅酶a。
所述丙酮酸铁氧化还原蛋白酶是指将极端嗜热菌新阿波罗菌中的丙酮酸铁氧化还原蛋白酶基因克隆到大肠杆菌表达载体中，进行重组表达并纯化获得的重组酶丙酮酸铁氧化还原蛋白酶。
具体的，本发明按以下步骤进行：
(1)制备重组酶丙酮酸铁氧化还原蛋白酶：
用引物5’-tgtaaggaggtgcaatcgatg-3’和5’-cccaagctttcatctgatcggtttgtcttttg-3’，从新阿波罗菌(thermotoganeapolitanadsm4359)基因组中扩增丙酮酸铁氧化还原蛋白酶基因(genbank:nc_011978.1)，克隆到表达载体pet-20b(+)(novagen,darmstadtgermany)，构建成重组质粒pet-pfor，导入e.colibl21(de3)中进行表达，并纯化出重组酶丙酮酸铁氧化还原蛋白酶；
(2)合成乙酰辅酶a：
配制一定ph值的反应液，将反应液加入到密封瓶中，通入气体一段时间后，在上述反应液中加入重组酶pfor，将得到的混合反应液，置于70-90℃条件下反应，得到含有乙酰辅酶a的混合液。
步骤(2)中，反应液的ph值为7.5-8.5；反应液的组成为丙酮酸钠、硫胺素焦磷酸(tpp)、辅酶a(coa)、mgcl2、甲基紫精、二硫苏糖醇(dtt)、三羟基氨甲烷盐酸盐(tris-hcl)缓冲液；
步骤(2)中，反应液中，丙酮酸钠、coa的浓度比为0.2-2:1，tpp、coa、mgcl2的浓度比为1:1:1，mgcl2、甲基紫精、dtt的浓度比为1:5:1，dtt：tris-hcl缓冲液的浓度比1:20；
步骤(2)中，通入气体的时间为5-10min；所述气体为氩气或氮气；
步骤(2)中，重组酶pfor的浓度为0.02μg/μl-0.14μg/μl；
步骤(2)中，反应的时间为0.5min-5min；
优选的，反应温度为90℃。
与现有技术相比较，本发明的有益效果体现如下：
(1)本发明采用丙酮酸铁氧化还原蛋白酶，在无氧条件下合成乙酰辅酶a；此种酶在无氧条件下稳定性好，耐热性好，不易失活，在70-90℃可以正常催化反应，合成操作方便，省略了酶固定化等繁琐步骤，重组表达的pfor可以直接用于合成乙酰辅酶a；
(2)此种极耐热性丙酮酸铁氧化还原蛋白酶，催化反应具有很高专一性，合成的产物只有乙酰辅酶a，无副产物产生，无需进行额外繁琐的纯化工艺；乙酰辅酶a的合成速率达15.01μmol/min/mg，乙酰辅酶a的转化率为50.6％。
(3)本发明利用丙酮酸铁氧化还原蛋白酶反应合成乙酰辅酶a的时间较短，节约资源和能源，绿色环保，成本低，有望用于工业化生产。
附图说明
图1.极端嗜热菌新阿波罗菌来源的热稳定性丙酮酸铁氧化还原蛋白酶的表达和纯化的聚丙烯酰氨凝胶电泳分析图；
图2.实施例2中70℃反应后，hplc检测反应产物；
图3.实施例3中80℃反应后，hplc检测反应产物；
图4.实施例4中90℃反应后，hplc检测反应产物；
图5.实施例5中ph7.5缓冲液中反应后，hplc检测反应产物；
图6.实施例6中ph8.0缓冲液中反应后，hplc检测反应产物；
图7.实施例7中ph8.5缓冲液中反应后，hplc检测反应产物；
图8.实施例8中0.5mm丙酮酸钠反应后，hplc检测反应产物；
图9.实施例9中1.5mm丙酮酸钠反应后，hplc检测反应产物；
图10.实施例10中2.0mm丙酮酸钠反应后，hplc检测反应产物。
具体实施例
下面结合具体的实施例及附图进一步详细地描述本发明。应理解，这些实施例只是为了举例说明本发明，而非以任何方式限制本发明的范围。
在以下实施例中所使用的术语，除非有另外说明，一般具有本领域普通技术人员通常理解的含义；实施例中未详细描述的各种过程和方法是本领域中公知的常规方法，可参考《分子克隆手册》第三版上的标准方法(sambrookandrussell,2001,cshlpress,coldspringharbor,newyork)；所用特征性制剂在发明内容部分已经描述，其它常规试剂的来源、商品名以及有必要列出组成成分者，均在首次出现时标明，其后所用相同试剂如无特殊说明，均以首次标明的内容相同。
实施例1：
制备重组酶pfor：
1.采用基因组提取试剂盒(生工生物工程(上海)股份有限公司)从新阿波罗菌(thermotoganeapolitanadsm4359)提取基因组。
2.用如下引物(5’-tgtaaggaggtgcaatcgatg-3’和5’-cccaagctttcatctgatcggtttgtcttttg-3’)，从新阿波罗菌基因组中扩增丙酮酸铁氧化还原蛋白酶基因(genbank:nc_011978.1)，采用primestarhs高保真酶扩增，扩增条件为98℃，10s，57℃，15s，72℃，3min，30个循环。
3.将上述pcr产物进行xhoⅰ酶切，表达载体pet-20b(+)(novagen,darmstadtgermany)进行ecorv和xhoⅰ双酶切，然后进行连接，构建成重组质粒pet-pfor。
4.将重组质粒pet-pfor，导入e.colibl21(de3)中，通过添加iptg进行诱导表达，通过离心方法收集菌液，细胞破碎后得到的粗酶液在85℃热处理20min，离心后得到的上清液，采用阴离子交换层析方法纯化出重组酶(图1)。
5.纯化的重组酶(pfor)在1mmdtt，20mmph8.0的tris-hcl缓冲液中透析脱盐，-20℃保存。
图1为极端嗜热菌新阿波罗菌来源的热稳定性丙酮酸铁氧化还原蛋白酶的表达和纯化的聚丙烯酰氨凝胶电泳分析图，其中泳道m：蛋白分子量标准；泳道1：含pet-pfor的大肠杆菌bl21(de3)提取的粗酶液经过85℃热处理和离心后的蛋白；泳道2：经过阴离子交换层析后获得的pfor酶(包含四个亚基αβγδ)。由图1的泳道1可以得出，丙酮酸铁氧化还原蛋白酶被成功表达出来；由泳道2可以得出，上清液中的pfor酶得到了纯化。
实施例2：
乙酰辅酶a的合成：
配置ph8.0的反应液，其中，反应液的组成及其浓度为：1mm丙酮酸钠，1mmtpp，1mmcoa，1mmmgcl2，5mm甲基紫精，1mmdtt，20mm的tris-hcl缓冲液，将反应液加入到密封瓶中，通入氩气5min后，向上述反应液中加入0.1μg/μlpfor酶，将得到的混合反应液置于70℃水浴锅中反应2min，得到含有乙酰辅酶a的混合液；取20μl上述混合液进行hplc分析反应产物，hplc结果如图2，测得70℃反应时，乙酰辅酶a的合成速率为8.69μmol/min/mg，乙酰辅酶a的转化率为29.2％。
实施例3：
乙酰辅酶a的合成：
配置ph8.0的反应液，其中，反应液的组成及其浓度为：1mm丙酮酸钠，1mmtpp，1mmcoa，1mmmgcl2，5mm甲基紫精，1mmdtt，20mm的tris-hcl缓冲液，将反应液加入到密封瓶中，通入氮气5min后，向上述反应液中加入0.1μg/μlpfor酶，将得到的混合反应液置于80℃水浴锅中反应2min，得到含有乙酰辅酶a的混合液；取20μl上述混合液进行hplc分析反应产物，hplc结果如图3，测得80℃反应时，乙酰辅酶a的合成速率为10.28μmol/min/mg，乙酰辅酶a的转化率为34.5％。
实施例4：
乙酰辅酶a的合成：
配置ph8.0的反应液，其中，反应液的组成及其浓度为：1mm丙酮酸钠，1mmtpp，1mmcoa，1mmmgcl2，5mm甲基紫精，1mmdtt，20mm的tris-hcl缓冲液，将反应液加入到密封瓶中，通入氩气5min后，向上述反应液中加入0.1μg/μlpfor酶，将得到的混合反应液置于90℃水浴锅中反应2min，得到含有乙酰辅酶a的混合液；取20μl上述混合液进行hplc分析反应产物，hplc结果如图4，测得90℃反应时，乙酰辅酶a的合成速率为13.01μmol/min/mg，乙酰辅酶a的转化率为43.7％。结果表明随着反应温度升高到90℃，乙酰辅酶a的合成速率和转化率增加。
实施例5：
乙酰辅酶a的合成：
配置ph7.5的反应液，其中，反应液的组成及其浓度为：1mm丙酮酸钠，1mmtpp，1mmcoa，1mmmgcl2，5mm甲基紫精，1mmdtt，20mm的tris-hcl缓冲液，将反应液加入到密封瓶中，通入氩气5min后，向上述反应液中加入0.1μg/μlpfor酶，将得到的混合反应液置于90℃水浴锅中反应2min，得到含有乙酰辅酶a的混合液；取20μl上述混合液进行hplc分析反应产物，hplc结果如图5，测得在90℃，ph7.5条件下反应时，乙酰辅酶a的合成速率为11.54μmol/min/mg，乙酰辅酶a的转化率为38.8％。
实施例6：
乙酰辅酶a的合成：
配置ph8.0的反应液，其中，反应液的组成及其浓度为：1mm丙酮酸钠，1mmtpp，1mmcoa，1mmmgcl2，5mm甲基紫精，1mmdtt，20mm的tris-hcl缓冲液，将反应液加入到密封瓶中，通入氩气5min后，向上述反应液中加入0.1μg/μlpfor酶，将得到的混合反应液置于90℃水浴锅中反应2min，得到含有乙酰辅酶a的混合液；取20μl上述混合液进行hplc分析反应产物，hplc结果如图6，测得在90℃，ph8.0条件下反应时，乙酰辅酶a的合成速率为12.76μmol/min/mg，乙酰辅酶a的转化率为42.9％。
实施例7：
乙酰辅酶a的合成：
配置ph8.5的反应液，其中，反应液的组成及其浓度为：1mm丙酮酸钠，1mmtpp，1mmcoa，1mmmgcl2，5mm甲基紫精，1mmdtt，20mm的tris-hcl缓冲液，将反应液加入到密封瓶中，通入氩气5min后，向上述反应液中加入0.1μg/μlpfor酶，将得到的混合反应液置于90℃水浴锅中反应2min，得到含有乙酰辅酶a的混合液；取20μl上述混合液进行hplc分析反应产物，hplc结果如图7，测得在90℃，ph8.5条件下反应时，乙酰辅酶a的合成速率为9.96μmol/min/mg，乙酰辅酶a的转化率为33.5％。结果表明ph对合成乙酰辅酶a存在较大的影响，重组酶pfor的最适反应ph是8.0，在ph8.0条件下，乙酰辅酶a的合成速率最高。
实施例8：
乙酰辅酶a的合成：
配置ph8.0的反应液，其中，反应液的组成及其浓度为：0.5mm丙酮酸钠，1mmtpp，1mmcoa，1mmmgcl2，5mm甲基紫精，1mmdtt，20mm的tris-hcl缓冲液，将反应液加入到密封瓶中，通入氩气5min后，向上述反应液中加入0.1μg/μlpfor酶，将得到的混合反应液置于90℃水浴锅中反应2min，得到含有乙酰辅酶a的混合液；取20μl上述混合液进行hplc分析反应产物，hplc结果如图8。在90℃，ph8.0条件下，底物丙酮酸钠和辅酶a浓度比为1:2时，乙酰辅酶a的合成速率为6.72μmol/min/mg，乙酰辅酶a的转化率为22.6％。
实施例9：
乙酰辅酶a的合成：
配置ph8.0的反应液，其中，反应液的组成及其浓度为：1.5mm丙酮酸钠，1mmtpp，1mmcoa，1mmmgcl2，5mm甲基紫精，1mmdtt，20mm的tris-hcl缓冲液，将反应液加入到密封瓶中，通入氩气5min后，向上述反应液中加入0.25μg/μlpfor酶，将得到的混合反应液置于90℃水浴锅中反应2min，得到含有乙酰辅酶a的混合液；取20μl上述混合液进行hplc分析反应产物，hplc结果如图9。在90℃，ph8.0条件下，底物丙酮酸钠和辅酶a浓度比为3:2时，乙酰辅酶a的合成速率为14.33μmol/min/mg，乙酰辅酶a的转化率为48.2％。结果表明不同浓度的底物丙酮酸钠和辅酶a的比值对合成乙酰辅酶a有较大的影响。
实施例10：
乙酰辅酶a的合成：
配置ph8.0的反应液，其中，反应液的组成及其浓度为：2.0mm丙酮酸钠，1mmtpp，1mmcoa，1mmmgcl2，5mm甲基紫精，1mmdtt，20mm的tris-hcl缓冲液，将反应液加入到密封瓶中，通入氩气5min后，向上述反应液中加入0.25μg/μlpfor酶，将得到的混合反应液置于90℃水浴锅中反应2min，得到含有乙酰辅酶a的混合液；取20μl上述混合液进行hplc分析反应产物，hplc结果如图10。在90℃，ph8.0条件下，底物丙酮酸钠和辅酶a浓度比为2:1时，乙酰辅酶a的合成速率为15.01μmol/min/mg，乙酰辅酶a的转化率为50.6％。
实施例11：
乙酰辅酶a的合成：
配置ph8.0的反应液，其中，反应液的组成及其浓度为：0.2mm丙酮酸钠，1mmtpp，1mmcoa，1mmmgcl2，5mm甲基紫精，1mmdtt，20mm的tris-hcl缓冲液，将反应液加入到密封瓶中，通入氩气7min后，向上述反应液中加入0.02μg/μlpfor酶，将得到的混合反应液置于90℃水浴锅中反应5min，得到含有乙酰辅酶a的混合液。
实施例12：
乙酰辅酶a的合成：
配置ph8.0的反应液，其中，反应液的组成及其浓度为：2.0mm丙酮酸钠，1mmtpp，1mmcoa，1mmmgcl2，5mm甲基紫精，1mmdtt，20mm的tris-hcl缓冲液，将反应液加入到密封瓶中，通入氩气10min后，向上述反应液中加入0.14μg/μlpfor酶，将得到的混合反应液置于90℃水浴锅中反应0.5min，得到含有乙酰辅酶a的混合液。
序列表
<110>江苏大学
<120>一种酶法制备乙酰辅酶a的方法
<160>2
<170>siposequencelisting1.0
<210>1
<211>21
<212>dna
<213>人工序列(artificialsequence)
<400>1
tgtaaggaggtgcaatcgatg21
<210>2
<211>32
<212>dna
<213>人工序列(artificialsequence)
<400>2
cccaagctttcatctgatcggtttgtcttttg32