本发明涉及细胞培养领域，具体地，涉及一种干细胞培养液的及其制备方法。
背景技术：
细胞培养技术指的是细胞在体外条件下的生长，在培养的过程中细胞不再形成组织(动物)。细胞培养技术作为一种培养细胞的技术方法在生物学领域已被深入广泛的应用于观察活细胞的形态结构和生命活动和细胞学、遗传学、免疫学、实验医学和肿瘤学等多种学科研究，无论对临床还是基础研究均具有重要意义。
神经损伤已成为现代神经系统疾病的重要致病原因之一，传统的观点认为神经细胞具有难以再生，其伤害具有永久性，恢复难度大等特点，对相关的疾病治疗存在困难。随着近年的医学发展，有研究发现干细胞具有分化成为神经细胞的潜能，这为相关疾病治疗带来了福音。但现今对于诱导干细胞定向分化的研究和技术的研究还相对较少，这对于该类疾病的研究和治疗也存在限制。
技术实现要素：
为克服现有技术的不足，本发明提供一种干细胞培养液及其制备方法，对于干细胞神经分化和定向神经分化有促进作用。
需要说明的是，本发明是基于发明人的下列发现而完成的：
氨基聚糖(gag)是由重复二糖单位构成的无分枝长链多糖。其二糖单位通常由氨基已糖(氨基葡萄糖或氨基半乳糖)和糖醛酸组成可作为一种重要媒介用于调节干细胞生物行为，对于患有关节炎，风湿性关节炎患者有帮助，对骨头的愈合也有很大帮助。常见的硫酸软骨素(cs)、硫酸皮肤素(ds)、硫酸角质素(ks)、硫酸乙酰肝素(hs)、肝素(heparin)和透明质酸(ha)等。
近年研究发现，氨基聚糖(gag)是一种重要媒介用于调节干细胞生物行为。而诱导干细胞定向分化，如向神经方向分化，对于治疗神经损疾病有重要意义。仿生学是一门研究生物体的结构与功能工作的原理的科学，并模仿生物的特殊本领。本发明根据仿生学的原理以β-环糊精为基础合成出与氨基聚糖(gag)结构相仿的物质用于促进干细胞神经分化。
为实现上述目的，本发明通过以下技术方案予以实现：
一种干细胞培养液，含有培养基、巯基乙醇、ph缓冲液和诱导剂。
优选地，所述的ph缓冲液为无菌磷酸盐缓冲液(pbs)。
更优选地，所述的无菌磷酸盐缓冲液(pbs)的ph值为：7.2～7.4。
优选地，所述的培养基含有：dmem/f2培养液，胎牛血清(fbs)，非必需氨基酸，青霉素和谷氨酰胺。
更优选地，所述的胎牛血清(fbs)的终浓度为10％。
更优选地，所述的谷氨酰胺的终浓度为2.2mm。
更优选地，所述的青霉素的终浓度为100u/ml。
更优选地，所述的非必需氨基酸的浓度为0.1mm。
优选地，所述的诱导剂为氨基聚糖(gag)结构相仿的物质。
更优选地，所述的氨基聚糖(gag)结构相仿的物质的浓度为0.9μg/ml。
更优选地，所述的氨基聚糖(gag)结构相仿的物质为一取代的磺化β-环糊精和二取代的磺化β-环糊精中的一种或其混合物。
以上所述的干细胞培养液在干细胞神经分化和定向神经分化中的应用。
与现有技术相比，本发明具有如下有益效果：
根据本发明的另一方面，本发明提供了一种促进干细胞分化的方法。该发明利用前面所述的干细胞培养液，培养所述干细胞。发明人惊奇的发现，采用该方法培养干细胞，显示该培养液与干细胞有良好的兼容性，有利于细胞活性的保持，与肝素相比，干细胞的神经分化能力更强，干细胞往神经方向分化率更高。本发明提供了一种用于干细胞培养，并能够促进干细胞向神经方向的培养液。
具体实施方式
下面详细描述本发明的实施例，所述实施例仅用于解释本发明，而不能理解为对本发明的限制。
根据本发明的一个方面，本发明提供了一种干细胞培养液。根据本发明的实施例，该细胞培养液培养的细胞种类不受特别限制，只要培养液能用于培养细胞即可。根据本发明的实施例，该培养液含有dmem/f2培养液，胎牛血清(fbs)，非必需氨基酸，青霉素、谷氨酰胺、巯基乙醇、ph缓冲液和诱导剂。发明人惊奇的发现，采用该方法培养干细胞，显示该培养液与干细胞有良好的兼容性，有利于细胞活性的保持，与肝素相比，干细胞的神经分化能力更强，干细胞往神经方向分化率更高。
实施例1：
本实施例中，采用分别添加诱导剂一取代的磺化β-cd、二取代的磺化β-cd以及一取代的磺化β-cd和二取代的磺化β-cd混合物的的细胞培养液3种；与分别添加β-cd的细胞培养液和添加肝素的细胞培养液以及不添加其它物质的细胞培养液3种作为对照，对体外诱导扩增的干细胞进行培养，以便观察诱导剂对干细胞培养的影响。具体如下：
1、采用不含诱导剂的细胞培养液培养干细胞
1.1细胞的复苏和培养
(1)细胞复苏
将胚胎成纤维细胞的细胞悬浮滴加到温度为35℃添加了100u/ml的青霉素和100μg/ml链霉素的1640培养基(以下称为改良的1640培养基)中进行混合，随后离心取沉淀，并往里加入培养液吹打，使其形成悬浮液，并将其移到新培养瓶中，同时将培养瓶放置在温度35℃的培养箱5％co2浓度环境中，并往瓶中加入5ml改良的1640培养基和0.6ml的胎牛血清溶液进行培养，需每隔2天换一次培养液。
(2)细胞传代
细胞生长覆盖瓶底达到80％以上时，可进行细胞传代。首先，倒掉旧培养液，其次再用无菌磷酸盐缓冲液冲洗细胞；随后，倒掉无菌磷酸盐缓冲液，之后，再往加入1ml0.3％蛋白酶溶液，直至细胞溶解；之后，再往里加入3ml改良的1640培养基，并吹打细胞使其分散，离心取沉淀，再加入新的培养液，并将其移到新培养瓶中，同时将培养瓶放置在温度35℃的培养箱5％co2浓度环境中，并往瓶中加入5ml改良的1640培养基和0.6ml的胎牛血清溶液进行培养，需每隔2天换一次培养液。
(3)制备胚胎成纤维细胞滋养层
先用丝裂霉素c(1g/ml)对滋养层细胞进行处理，待其传代至第四代时，往培养瓶中加入低浓度的(10μg/ml)丝裂霉素c，将该溶液在35℃中培养3小时。随后，吸出培养液，再用10ml丝裂霉素c对其进行处理，并用无菌磷酸盐缓冲液(pbs)对其进行清洗。再往培养瓶中加入1ml0.3％蛋白酶，至细胞脱壁。再加入3～5ml改良的1640培养基，离心取沉淀，再加入新的改良的1640培养基进行培养。
(4)干细胞复苏和培养
在干细胞培养前，至少需要提前两天将培养瓶瓶底用明胶溶液包被，明胶溶液包被1天后再将滋养层细胞培养在培养瓶底部，具体操作如下；往培养瓶中加入2ml0.1％明胶包被溶液，置于细胞培养箱一天，弃掉培养瓶中液体后再对成纤维细胞滋养层细胞进行复苏，用改良的1640培养基培养一天以上，铺有滋养层的培养瓶需要在5天内使用。随后，将铺有滋养层细胞的培养瓶中的液体弃掉，再将干细胞复苏到培养瓶中，采用1640培养基培养，每天换液一次，每3天传代一次。传代细胞均培养在铺有成纤维细胞滋养层细胞的培养瓶。
(5)β-cd和肝素对干细胞增殖的影响
先将干细胞与成纤维细胞滋养层细胞分离。然后，采用干细胞培养基对分离后的干细胞进行培养，并在培养基中分别加入0.9μg/ml的β-环糊精和肝素。β-cd和肝素样品事先均用少量无菌磷酸盐缓冲液(pbs)配制为50μg/ml的母液，并在添加到干细胞培养基前用无菌滤器过滤除菌。细胞每天换液一次。在干细胞分别培养1天、3天及5天后，通过3-(4，5-二甲基噻唑-2)-2，5-二苯基四氮唑溴盐(mtt)实验测试其增殖效率。
进行细胞分化培养之前，先除去成纤维细胞滋养层细胞，并用蛋白酶对传代的干细胞进行脱壁，往里加适量改良的1640培养基，先摇匀，随后离心取沉淀，再加入适量改良的1640培养基。并检查细胞存活率，达到90％以上才可以使用。
随后，往将分离好的干细胞里添加未添加任何物质的干细胞培养基和分别含有β-cd和肝素的干细胞培养基，每天换液，培养14天，随后通过实时荧光定量pcr反应对细胞神经分化情况进行分析。
本方法通过实时荧光定量pcr反应对干细胞βⅲ－tubulin基因进行分析，对比不同添加物对于干细胞神经分化的影响。
1.2.提取rna
(1)、首先，吸取掉细胞培养液，然后以每1mltrizol液加入0.2ml的比例加入氯仿，并将其转入到离心管中，随后，盖紧离心管，用手剧烈摇荡离心管15秒，静置5min，随后进行离心1000rpm，5min。
(2)、取上层水相于一新的离心管,按每1mltrizol液加0.5ml异丙醇的比例加入异丙醇,剧烈振摇使混匀，4℃，12000rpm离心10min。
(3)、弃去上清液,按每1mltrizol液加入至少1ml的比例加入无水乙醇,涡旋混匀，4℃×7,500rpm×5min。
(4)、重复以上步骤。
(5)、小心弃去上清液，然后室温或真空干燥5-10min,加入30μlrnasefree的水中。
(6)、电泳检测。
实时荧光定量pcr
本实验采用sybrgreenmaster混合液作为实时荧光定量pcr的反应体系，反应体系为：
荧光定量pcr的反应程序：
95℃反应25s；93℃(10s，循环45次)；65℃(35s)；熔融曲线测试：93℃(15s)；65℃(55s)；以0.3℃温度升至93℃，保持20s。
1.3.β-环糊精和肝素对干细胞活性的测试
分别将干细胞在含有0.9μg/ml的肝素和β-环糊精和不含外加添加物的干细胞培养基中，分别培养1、3和5天，随后通过对细胞数量的变化程度了解和对比上述两种物质的细胞相容性。结果显示，培养时间为1天时，上述3组的细胞变化相当，差距不大。到第3天时，上述3组的干细胞数量增长以达到第1天的5倍左右，到第5天时，干细胞数量增长为7倍左右，随着培养时间变长，细胞的增殖速度有所减缓，这可能是由于随着干细胞培养时间，营养物质不断消耗，总量减少，ph值变化等变化导致培养细胞培养环境有所变化，以及随着干细胞数量的不断增加，干细胞之间存在竞争，也导致干细胞增殖数量有所减缓。
1.4.β-环糊精和肝素对干细胞神经分化的影响
利用免疫荧光标记技术对干细胞神经分化进行分析，来对比分析含0.9μg/mlβ-环糊精、肝素和不添加外来物质对干细胞神经分化的影响。结果显示，添加肝素的干细胞培养液中的干细胞神经分化率要高于不添加其它物质的培养液，这表明肝素对于干细胞分化有促进作用，而添加β-环糊精的干细胞培养液中的干细胞神经分化率最低，表明β-环糊精对于干细胞神经分化无促进作用。
再通过实时荧光定量pcr技术对上述3种培养液的对于干细胞的神经分化调节作用，对干细胞中的相关基因测试，以不添加外物质的培养液为标准，与其它添加肝素和β-环糊精的培养液进行对比分析，相关的结果显示，其中含有肝素的培养液的干细胞神经分化调节作用最强，不添加外加化合物的神经分化调节能力为其0.7倍，添加β-环糊精为其神经能力的0.65倍，再次表明肝素对于干细胞神经分化能力有促进作用，而从上述数据显示β-环糊精对于干细胞神经分化调节并无促进作用。
2、采用添加诱导剂的细胞培养液培养干细胞
2.1干细胞的复苏和培养
(1)细胞复苏
将胚胎成纤维细胞的细胞悬浮滴加到温度为35℃添加了100u/ml的青霉素和100μg/ml链霉素的1640培养基(以下称为改良的1640培养基)中进行混合，随后离心取沉淀，并往里加入培养液吹打，使其形成悬浮液，并将其移到新培养瓶中，同时将培养瓶放置在温度35℃的培养箱5％co2浓度环境中，并往瓶中加入5ml改良的1640培养基和0.6ml的胎牛血清溶液进行培养，需每隔2天换一次培养液。
(2)细胞传代
细胞生长覆盖瓶底达到80％以上时，可进行细胞传代。首先，倒掉旧培养液，其次再用无菌磷酸盐缓冲液冲洗细胞，冲洗完毕后，倒掉无菌磷酸盐缓冲液，随后，再往加入1ml0.3％蛋白酶溶液，直至细胞溶解为止；之后，再往里加入3ml改良的1640培养基，并吹打细胞使其分散，离心取沉淀，再加入新的培养液，并将其移到新培养瓶中，同时将培养瓶放置在温度35℃的培养箱5％co2浓度环境中，并往瓶中加入5ml改良的1640培养基和0.6ml的胎牛血清溶液进行培养，需每隔2天换一次培养液。
(3)制备胚胎成纤维细胞滋养层
先用丝裂霉素c(1g/ml)对滋养层细胞进行处理，待其传代至第四代时，往培养瓶中加入低浓度的(10μg/ml)丝裂霉素c，将该溶液在35℃中培养3小时。随后，吸出培养液，再用10ml丝裂霉素c对其进行处理，并用无菌磷酸盐缓冲液(pbs)对其进行清洗。再往培养瓶中加入1ml0.3％蛋白酶，至细胞脱壁。再加入3～5ml改良的1640培养基，离心取沉淀，再加入新的改良的1640培养基进行培养。
(4)干细胞复苏和培养
在干细胞培养前，至少需要提前两天将培养瓶瓶底用明胶溶液包被，明胶溶液包被1天后再将滋养层细胞培养在培养瓶底部，具体操作如下；往培养瓶中加入2ml0.1％明胶包被溶液，置于细胞培养箱一天，弃掉培养瓶中液体后再将成纤维细胞滋养层细胞复苏到培养瓶中，用改良的1640培养基培养一天以上，铺有滋养层的培养瓶需要在5天内使用。对干细胞进行复苏，将铺有滋养层细胞的培养瓶中的液体弃掉，再将干细胞复苏到培养瓶中，采用1640培养基培养，每天换液一次，每3天传代一次。传代细胞均培养在铺有成纤维细胞滋养层细胞的培养瓶。
(5)具有氨基聚糖(gag)结构相仿的物质一取代的磺化β-环糊精(一取代的磺化β-cd)或二取代的磺化β-环糊精(二取代的磺化β-cd)中的一种及其混合物(一取代的磺化β-cd：二取代的磺化β-cd为1:1)(以下简称磺化β-环糊精混合物)对干细胞增殖的影响
先将干细胞与成纤维细胞滋养层细胞分离。然后，采用干细胞培养基对分离后的干细胞进行培养，并在培养基中分别加入0.9μg/ml的一取代的磺化β-环糊精和二取代的磺化β-环糊精以及磺化β-环糊精混合物。一取代的磺化β-环糊精和二取代的磺化β-环糊精样品以及磺化β-环糊精混合物样品事先均用少量无菌磷酸盐缓冲液(pbs)配制为50μg/ml的母液，并在添加到干细胞培养基前用无菌滤器过滤除菌。细胞每天换液一次。在干细胞分别培养1天、3天及5天后，通过3-(4，5-二甲基噻唑-2)-2，5-二苯基四氮唑溴盐(mtt)实验测试其增殖效率。
进行细胞分化培养之前，先除去成纤维细胞滋养层细胞，并用蛋白酶对传代的干细胞进行脱壁，往里加适量改良的1640培养基，并摇匀，离心取沉淀，再加入适量改良的1640培养基。并检查细胞存活率，达到90％以上才可以使用。
随后，往将分离好的干细胞里添加未添加任何物质的干细胞培养基和分别含有β-cd和肝素的干细胞培养基，每天换液，培养14天，随后通过实时荧光定量pcr反应对细胞神经分化情况进行分析。
本方法通过实时荧光定量pcr反应对干细胞βⅲ－tubulin基因进行分析，对比不同添加物对于干细胞神经分化的影响。
2.2.提取rna
(1)、首先，吸取掉细胞培养液，然后以每1mltrizol液加入0.2ml的比例加入氯仿，并将其转入到离心管中，随后，盖紧离心管，用手剧烈摇荡离心管15秒，静置5min，随后进行离心1000rpm，5min。
(2)、取上层水相于一新的离心管,按每1mltrizol液加0.5ml异丙醇的比例加入异丙醇,剧烈振摇使混匀，4℃，12000rpm离心10min。
(3)、弃去上清液,按每1mltrizol液加入至少1ml的比例加入无水乙醇,涡旋混匀，4℃×7,500rpm×5min。
(4)、重复以上步骤。
(5)、小心弃去上清液，然后室温或真空干燥5-10min,加入30μlrnasefree的水中。
(6)、电泳检测。
实时荧光定量pcr
本实验采用sybrgreenmaster混合液作为实时荧光定量pcr的反应体系，反应体系为：
荧光定量pcr的反应程序：
95℃反应25s；93℃(10s，循环45次)；65℃(35s)；熔融曲线测试：93℃(15s)；65℃(55s)；以0.3℃温度升至93℃，保持20s。
2.3.具有氨基聚糖(gag)结构相仿的物质一取代的磺化β-环糊精和二取代的磺化β-环糊精以及磺化β-环糊精混合物对干细胞活性的测试
分别将干细胞在含有0.9μg/ml的一取代的磺化β-环糊精和二取代的磺化β-环糊精以及磺化β-环糊精混合物的干细胞培养液中，分别培养1、3和5天，随后通过对细胞数量的变化程度了解和对比上述两种物质的细胞相容性。结果显示，培养时间为1天时，上述3组的细胞变化相当，差距不大，同时与不添加外加物质的干细胞培养、添加肝素以及β-环糊精的干细胞的细胞数量相当；到第3天时，上述3组的干细胞数量增长，以达到第1天的4倍左右，而上述3组干细胞培养液的干细胞数量变化差别不大，同时与不添加外加物质的干细胞培养液、添加肝素以及β-环糊精的干细胞培养液的细胞数量相比，为其0.8倍左右；到第5天时，干细胞数量增长为6倍左右，而上述3组干细胞培养液的干细胞数量变化差别不大，同时与不添加外加物质的干细胞培养、添加肝素以及β-环糊精的干细胞的细胞数量为其0.85倍左右，上述结果显示一取代的磺化β-环糊精和二取代的磺化β-环糊精以及磺化β-环糊精混合物与干细胞有较好的兼容性，有利于干细胞活性的保持；并且随着培养时间变长，细胞的增殖速度有所减缓，这可能是由于随着干细胞培养时间，营养物质不断消耗，总量减少，ph值变化等变化导致培养细胞培养环境有所变化，以及随着干细胞数量的不断增加，干细胞之间存在竞争，也导致干细胞增殖数量有所减缓。
2.4.具有氨基聚糖(gag)结构相仿的物质一取代的磺化β-环糊精和二取代的磺化β-环糊精以及磺化β-环糊精混合物对干细胞神经分化的影响
利用免疫荧光标记技术对干细胞神经分化进行分析，来对比分析含0.9μg/ml一取代的磺化β-环糊精和二取代的磺化β-环糊精以及磺化β-环糊精混合物对干细胞神经分化的影响。结果显示，添加一取代的磺化β-环糊精和二取代的磺化β-环糊精以及磺化β-环糊精混合物的干细胞培养液中的干细胞神经分化率要高于上述添加肝素和不添加其它物质以及添加β-环糊精的培养液，试验结果表明一取代的磺化β-环糊精和二取代的磺化β-环糊精以及磺化β-环糊精混合物对于干细胞神经分化有更好的存进作用；相关研究已表明肝素对于干细胞分化有促进作用，而添加β-环糊精的干细胞培养液中的干细胞神经分化率最低，表明β-环糊精对于干细胞神经分化无促进作用，这显示具有氨基聚糖(gag)结构相仿的物质磺化的β-环糊精对于干细胞神经分化有促进作用。
再通过实时荧光定量pcr技术对上述3种培养液的对于干细胞的神经分化调节作用，对干细胞中的相关基因测试；在不添加外物质的干细胞和添加肝素以及β-环糊精的培养液中，其中以添加肝素的干细胞培养液的神经分化促进能力最强，这显示肝素对于干细胞的神经分化调节有促进作用，而添加β-环糊精的干细胞培养液对于干细胞神经调节没有促进作用；所以本试验以添加肝素的干细胞培养液为标准；试验结果显示，其中含有一取代的磺化β-环糊精和二取代的磺化β-环糊精以及磺化β-环糊精混合物的干细胞神经分化调节能力均优于不添加外来物质和添加肝素以及添加β-环糊精的干细胞培养液，其中添加二取代的磺化β-环糊精的干细胞培养液的干细胞神经分化调节作用最强，这可能与其磺化程度较高有关，添加二取代的磺化β-环糊精的神经分化调节能力为添加肝素的干细胞培养液1.15倍，添加磺化β-环糊精混合物为其神经能力的1.1倍，而添加一取代的磺化β-环糊精为其神经能力的1.06倍，再次表明具有氨基聚糖(gag)结构相仿的物质磺化的β-环糊精对于干细胞神经分化能力有促进作用。
添加0.9μg/mlβ-环糊精的干细胞培养液、添加0.9μg/ml肝素的干细胞培养液、无其它物质添加的干细胞培养液、添加0.9μg/ml一取代的磺化β-环糊精的干细胞培养液、添加0.9μg/ml二取代的磺化β-环糊精的干细胞培养液和添加0.9μg/ml磺化β-环糊精混合物的干细胞培养液对干细胞活性的影响和对干细胞神经分化的效率以及对干细胞的神经分化调节作用效率的影响如表1所示。
表1
最后应当说明的是，以上实施例仅用以说明本发明的技术方案，而非对本发明保护范围的限制，尽管参照较佳实施例对本发明作了详细地说明，本领域的普通技术人员应当理解，可以对本发明的技术方案进行修改或者等同替换，而不脱离本发明技术方案的实质和范围。