一种干细胞培养液及注射液的制作方法

本发明属于生物技术领域，尤其涉及一种间充质干细胞培养液及注射液。

背景技术：

间充质干细胞（Mesenchymal stem cells）是一类具有多向分化潜能的成体干细胞，源于发育早期的中胚层，主要存在于结缔组织和器官间质中，可以从骨髓、外周血、脂肪及皮肤等多种组织中获得。间充质干细胞属于非终末分化细胞，它既有间质细胞的特征，又有内皮细胞及上皮细胞的特征；作为一类多能干细胞，它在体外特定的诱导条件下，可以向骨、软骨、肌肉、肌腱、肝、脂肪、神经、内皮及胰岛样细胞等方向增殖分化。

间充质干细胞培养过程中，会分泌干细胞因子（SCF）、表皮生长因子（EGF）、血管内皮生长因子（VEGF）、碱性成纤维细胞生长因子（bFGF）、血小板源性生长因子A（PDGF-A）、转化生长因子（TGF-β）、肝细胞生长因子（HGF）、白细胞介素（IL）、胰岛素样生长因子（IGF-Ⅱ）、巨噬细胞集落刺激因子（GSFs）、肿瘤坏死因子（TNF-α）、干扰素（IFN）、神经生长因子（NGF）、以及细胞分泌的外泌体（Exosome）、载有功能性蛋白质、mRNA 及microRNA（miRNA）等物质。包含RNA分子这种复合细胞因子在人体内能够促进细胞增殖、分化和再生，加强新陈代谢，防止细胞衰老；介导机体细胞信号传导、活化机体干细胞，促进新毛细血管形成，进行生理性修复；调节机体亚健康，提高机体免疫清除损伤、病变、衰老的细胞。有研究表明，使用干细胞分泌因子及Exosome与使用干细胞具有相同的作用。因此，在细胞治疗中不使用细胞而使用细胞分泌因子的去细胞化的概念，受到越来越多的关注和支持，干细胞分泌因子与干细胞相比，优势明显。

细胞在体外的生长依赖于培养液，而干细胞直接将细胞因子分泌到培养液中，培养液的成分直接关系到细胞因子的临床使用。现阶段动物细胞的体外培养主要依赖于胎牛血清，这样细胞在体外才能较好的增殖生长。但由于胎牛血清成分复杂，使用含血清的培养基培养细胞存在潜在的细胞毒性作用、外源病毒和致病因子污染问题，使细胞培养的标准化和终产品纯化难度加大，异种血清的残留也易导致临床上的过敏反应。因此，无血清培养基的开发和应用势在必行。所谓无血清培养基，是指不含有动物血清或其他生物提取液，但仍可以维持细胞在体外较长时间生长、繁殖的一种培养基。

世界卫生组织将机体无器质性病变，但是有一些功能改变的状态称为“第三状态”，我国称为“亚健康状态”。亚健康即指介于健康和疾病之间的一种生理功能低下的状态。临床药物大体都是用于治疗疾病的药物，没有针对亚健康群体的调节剂。针对病患，临床上常用一些营养增补剂，来调节机体代谢及免疫系统，例如：人血白蛋白，具有增加循环血容量、维持血浆胶体渗透压的作用，可作为氮源为组织提供营养，利于细胞新陈代谢，也可作为载体，输送不同的物质；水溶性维生素，具有增强免疫力，抗氧化提高新陈代谢的作用，还具有控制和预防癌症的作用；复方氨基酸，可参与蛋白质的合成和代谢，生成酶类、激素、抗体、结构蛋白，促进组织愈合，恢复正常生理功能；谷氨酰胺，是一种营养增补剂，为机体提供氮源，促进蛋白质的合成，改善机体营养代谢，调节血糖，并可增强免疫系统的功能以及抗氧化；微量元素注射液，属于肠外营养添加剂，维持机体内的生化反应正常进行；水解蛋白，可进入组织细胞，参与蛋白质合成代谢，获得正氮平衡，并生成酶类、激素、抗体、结构蛋白、促进组织生理功能恢复正常；勃脉力A液，是水、电解质的补充剂和碱化剂，可保持渗透压，保护细胞。这些临床药物已在临床使用多年，其安全性和有效性得到社会的认可。

专利CN102920735A、专利CN1966080A，均提供了一种间充质干细胞注射液，但是其注射液成分含有活细胞，降低了临床使用的安全性和可控性，并且，培养间充质干细胞时使用了胎牛血清，引入外源蛋白，使用的风险性更大；专利CN1618981A提供了一种干细胞分泌因子制备方法，其干细胞经过基因修饰后变为永生细胞，由于基因修饰存在一定的潜在风险，且干细胞分泌因子经过分离纯化，过程繁杂，干细胞分泌因子不可避免会造成损失；专利CN102008507A提供了一种脐带间充质干细胞注射液，但是其仅加入人血白蛋白和肝素钙，配方营养结构单一，对细胞活性及分泌因子含量会有一定影响，并且其注射液中含有活的干细胞，安全性也存在问题；专利CN102703385A提供了一种间充质干细胞培养液，其应用细胞培养液添加无血清添加剂、bFGF、 EGF、胎球蛋白和抗生素制成干细胞培养液，首先细胞培养液不属于临床级试剂，不能直接应用于人体，其次，培养液中加入抗生素，存在过敏的风险，最后，其营养结构单一，不能满足细胞营养，可能对细胞活性及分泌因子含量有一定影响。

不论是干细胞临床研究和治疗，还是对干细胞分泌因子的应用开发，均需要大量扩增间充质干细胞，因此，如何获得大量的间充质干细胞是研究的前提和关键。

技术实现要素：

针对上述问题，本发明提供一种干细胞培养液及注射液。该注射液直接进行静脉注射，不含活细胞。操作过程简单可靠，应用安全，能有效提高机体免疫力，恢复健康状态。

为实现上述目的，本发明提供一种干细胞培养液，其原料按体积百分比计算，由如下成分组成：复方氨基酸注射液10%、注射用水溶性维生素1%、丙氨酰谷氨酰胺0.5%、人血白蛋白10%、水解蛋白注射液10%、微量元素注射液0.5%、勃脉力A液68%。

采用所述干细胞培养液培养间充质干细胞，并收集间充质干细胞培养上清；将收集的培养上清经0.22μm滤膜过滤，收集滤液，即为间充质干细胞注射液。

所述间充质干细胞为脐带间充质干细胞、胎盘间充质干细胞、脐带血间充质干细胞、脂肪间充质干细胞、骨髓间充质干细胞或牙髓间充质干细胞等成体干细胞。

为了实现上述目的，本发明还提供一种干细胞培养液的配制方法，包括如下步骤。

步骤1、取1%的勃脉力A液，溶解注射用水溶性维生素，得混合液。

步骤2、分别将步骤1的混合液、复方氨基酸注射液、丙氨酰谷氨酰胺、人血白蛋白、水解蛋白注射液、微量元素注射液、67%的勃脉力A液，按比例混匀，即为干细胞培养液。

所述干细胞培养液pH值为6.8-7.0，渗透压为310 mOsm/kg。

为了实现上述目的，本发明还提供一种间充质干细胞注射液的制备方法，包括以下步骤。

步骤1、间充质干细胞样本采集、处理。

步骤2、干细胞的原代提取及培养：用物理剪切的方法分离间充质的组织，以组织块贴壁培养法采用无血清培养基培养间充质干细胞；离心分离单个核细胞，以贴壁培养的方式分离培养间充质干细胞。

步骤3、干细胞的传代培养：当细胞达到70%以上融合时，清洗两次后加入细胞消化液，过滤去除组织小块，离心弃上清后，获得原代间充质干细胞；原代间充质干细胞用无血清培养基重悬后，接种在培养瓶或培养皿内，待细胞融合度达到80%-90%时，收集第一代间充质干细胞，作为种子细胞或继续传代培养。

步骤4、间充质干细胞的生物学及流式细胞鉴定。

步骤5、配制干细胞培养液，对间充质干细胞换液，继续培养间充质干细胞，并收集间充质干细胞培养上清。

步骤6、将步骤5中收集的干细胞培养上清经0.22μm滤膜过滤，收集滤液，即为干细胞注射液。

所述步骤1中样本处理采用酒精浸泡时间1-4min，所述酒精经0.22μm孔径滤膜过滤除菌。

所述无血清培养基是在DMEM/F12基础培养基中加入10%血清替代品，且使用前需补加L-谷氨酰胺。

所述步骤2贴壁培养中采用CO₂培养箱；所述CO₂培养箱的条件为：37℃、12%的氧气、5%二氧化碳、83%氮气的低氧条件。

所述步骤3中接种密度为5000-6000个/cm²。

所述干细胞注射液可直接应用于人体静脉注射，剂量为200m人/次。

本发明的有益效果。

本发明提供的干细胞培养液及注射液，模拟间充质干细胞体内低氧环境并使用无血清培养基培养，待细胞融合率达到70%时，换用干细胞培养液继续培养2天，收集干细胞培养上清液，上清液中含有干细胞分泌因子，经过滤后得到干细胞注射液，可直接应用于人体静脉注射。本发明使用去细胞化的干细胞分泌因子进行静脉注射，去细胞化有助于化解主管部门对植入干细胞后不受控制的危险性忧虑，并且去细胞化的上清液不会增加末梢微血管阻塞的风险，也不会致瘤；本发明的干细胞培养液，为干细胞生存环境提供基本营养，能有效促进干细胞分泌大量的细胞因子和外泌体，保持干细胞活性，并且培养液中营养增补剂配方与干细胞分泌因子配合，能有效缓解机体亚健康状态，重现机体健康；本发明提供的干细胞培养液，原料成分均属于临床级别，可直接用于人体，安全可靠。

本发明的细胞培养环境为低氧条件下培养，生理学上体内细胞生存的环境氧含量为1-13%，但大部分现有技术中的细胞体外培养是在21%氧气浓度下完成。间充质干细胞主要在体内低氧的环境中生长，低氧更符合其生理状态，富氧反而对细胞具有损伤作用。目前研究表明，低氧培养可提高间充质干细胞的增殖能力，迁移能力及黏附能力，并降低细胞衰亡率。但是低氧下会产生更多地乳酸，作为代谢副产物，过多的乳酸会对细胞产生毒性，限制细胞进一步生长，因此，本发明经过大量的实践，给出适于间质干细胞的低氧条件12%的氧气。本发明采用血清替代品替代传统间充质干细胞培养中使用的胎牛血清，在临床应用中能避免动物血清及动物来源的异种蛋白带来的潜在风险。

同时，本发明提供的间充质干细胞的培养液及注射液，适合大规模的工业化生产，有巨大的应用前景。

附图说明

图1为间充质干细胞细胞生长状态图。

图2为间充质干细胞流式细胞检测图；其中2-1.间充质干细胞CD90表达率波形图、2-2.间充质干细胞CD73表达率波形图、2-3.间充质干细胞CD105表达率波形图、2-4.间充质干细胞CD45表达率波形图、2-5. 间充质干细胞CD34表达率波形图。

具体实施方式

下面结合具体实施例对本发明做进一步说明。

实施例1。

一种脐带间充质干细胞培养液及注射液的制备方法，包括以下步骤。

步骤1、样本采集。

经产妇知情同意，采集足月健康胎儿新鲜无菌脐带组织，4℃保存，24h内处理。产妇产前七天内采集母血进行HIV检测、乙肝检测、丙肝检测、梅毒检测、谷丙转氨酶检测、巨细胞病毒检测和支原体检测，全部检测合格后，方可使用其胎儿新鲜无菌脐带组织。

清洁和消毒：在生物安全柜内取出脐带，先用0.9%的氯化钠注射液10ml进行表面清洗，之后将脐带浸入经0.22μm过滤除菌的75%酒精内2min；最后用0.9%的氯化钠注射液10ml再次清洗，去除残余酒精和血渍。

步骤2、干细胞的原代提取及培养。

（1）将脐带剪成2-3cm的小段，剔除外侧羊膜和内部血管得到华通氏胶，将所得华通氏胶剪成2mm³的组织小块，用20ml生理盐水清洗3次后，得到无血渍的华通氏胶组织小块。

（2）将得到的无血渍的华通氏胶组织小块，用10mlⅠ型胶原酶（0.1mg/mL）消化处理10min，从组织释放出细胞外基质蛋白，即得到细胞外基质蛋白和组织小块组成的混合物。

（3）取2-3mL上述混合物，涂抹在直径为10cm的培养皿上，以恰好铺满培养皿底部且组织小块分布均匀为佳，用无菌镊子移动组织小块位置，使其均匀分布；在生物安全柜内自然晾干2min，形成胶状包被层粘附在培养皿底部，组织小块被固定在培养皿底部。

（4）向上述培养皿内加入无血清培养基10ml，放置在CO₂培养箱内37℃、12%的氧气、5%二氧化碳、83%氮气的低氧条件下培养，24h后进行一次全量换液；培养4-5天在显微镜下观察有细胞从组织小块内生长出，再培养至第8天时，进行第二次全量换液，同时收集组织小块。

所述无血清培养基是在DMEM/F12基础培养基中加入10%血清替代物（血清替代品为商业购买，PALL 公司，15950-017），不含动物源性物质，且使用前需补加L-谷氨酰胺，使其浓度为15mg/L。使用血清替代物,替代传统人脐带间充质干细胞培养中使用的胎牛血清，在临床应用中能避免动物血清及动物来源的异种蛋白带来的潜在风险。

（5）将上述（4）中收集的组织小块转移至新培养皿内，进行组织小块二次贴壁培养，培养原代间充质干细胞，根据细胞生长情况（一般细胞培养至第5-6天）进行全量换液，以补充营养物质。

在组织小块的不同培养方法中，组织小块贴壁及细胞生长情况的差异，如表1所示。其中，本实施例中组织小块粘附在培养皿底部用时，以未加培养基时，培养皿倒置，组织小块未从培养皿底部落下为标准。

表1：组织小块贴壁及细胞生长情况比较。

由表1可知：在培养皿底部涂抹胶状混合物，有利于组织小块快速贴壁，且能够明显促进细胞从组织块内生长出及在培养皿底部的生长；相同时间内，相同数量的组织小块通过本方法培养后，获取的脐带原代间充质干细胞数量比普通组织块贴壁法增加了一倍。

本发明的混合物在培养皿底部形成的包被层，一方面缩短了组织小块的贴壁时间；另一方面也使细胞更容易从组织小块内游离出（包被层为细胞生长构建了立体的三维生长环境，既促进了细胞对培养皿底部的粘附，又有利于培养液的渗透，还有利于细胞在培养皿底部的增殖和迁移），使原代细胞培养时间大幅缩短。并且与传统的酶消化法相比，本发明采用性质温和的胶原酶Ⅰ短时消化获取细胞外基质蛋白，大部分细胞始终保留在组织小块内，避免了酶对细胞膜的损伤，保证了细胞活力。

不同氧浓度下脐带间充质干细胞初次培养扩增至70%融合时，所需要的培养时间和流式检测结果，如表2所示。

表2：不同氧浓度下脐带间充质干细胞扩增时间和流式检测。

由表2可知，不同氧浓度条件下培养的脐带间充质干细胞，均符合国际细胞治疗协会关于间充质干细胞的标准：阳性表达率≥95%，阴性表达率≤2%，且不同氧浓度条件培养的细胞检测结果一致，表明低氧条件对脐带间充质干细胞的生长没有影响；但在12%氧气的低氧条件下，脐带间充质干细胞培养时间最短，但是当氧浓度超过18%时，培养时间变长，故本发明使用12%氧气的低氧条件。

步骤3、干细胞的传代培养。

（1）显微镜观察细胞达到70%以上融合时，进行传代扩增：去除无血清培养基，用0.9%的氯化钠注射液洗涤2次后，加入5ml细胞消化液（型号：ACCUTASE GMP，厂家Innovative Cell Technologies），使贴壁细胞脱离培养皿底部，过滤去除组织小块，离心1000rpm处理10min，弃上清后，获得原代脐带间充质干细胞。

（2）获取的原代细胞用无血清培养基重悬后，接种在培养瓶或培养皿内，接种密度控制在5000-6000个/cm²，培养一段时间后，待细胞融合度达到80%-90%时，收集第一代脐带间充质干细胞，作为种子细胞或继续传代培养。

传代培养的脐带间充质干细胞，在6%-21%不同氧浓度条件下培养3天，按照ELISA试剂盒（美国，R&D公司）说明书操作，分别检测其细胞培养上清中分泌因子，如：干细胞因子（SCF）、表皮生长因子（EGF）、血管内皮生长因子（VEGF）、碱性成纤维细胞生长因子（bFGF）、白细胞介素6（IL6）、肝细胞生长因子（HGF）、肿瘤坏死因子β3（TNF-β3）的含量，具体步骤如下。

（1）取出酶标板，依照次序对应分别加入100μL的细胞因子标准品于空白孔中作为阳性对照；分别标记样品编号，加入100μL脐带间充质干细胞培养上清于空白孔中，37℃孵育90min。

（2）洗板机清洗4次，每次静置10-20s；每孔加入100μL的生物素标记抗体工作液，37℃孵育60min。

（3）洗板机清洗5次，每次静置10-20s；每孔加入100μL的酶结合物工作液，37℃孵育30min。

（4）洗板机清洗4次，每次静置10-20s；每孔加入100μL的显色剂，37℃避光孵育反应15 min。

（5）每孔加入50μL终止液，终止反应。

每份标本设3个重复孔，用全自动酶标仪测450nm处吸光度(A)值，取其平均值，根据所绘制的标准曲线计算出细胞因子含量，结果如表3所示。

表3：不同氧浓度下脐带间充质干细胞分泌因子含量测定（单位：pg/mL）。

由表3可知，对选取的7个细胞因子进行含量测定，可知在12%氧气的低氧条件下，脐带间充质干细胞分泌细胞因子含量最高，且提高了2-4倍，故本实验全程使用12%氧气的低氧条件培养细胞，可大幅提高获取细胞因子的产量。

步骤4、脐带间充质干细胞的生物学及流式细胞鉴定。

1、细胞生长及其形态学特点：采用本实施例步骤1的消化方法，将混合物涂抹在培养皿上进行贴壁培养，培养至第3-5天时经倒置显微镜观察，可发现有较多贴壁细胞生长；培养至10天时，细胞融合率达到70%，见图1；组织小块二次利用时，培养24h后即观察到有细胞进行贴壁生长，9天后细胞融合率达到70%左右。

2、流式细胞鉴定间充质干细胞表面标志。

收集第二代细胞，磷酸缓冲盐溶液洗涤2次（1000rpm离心处理5min），调整细胞浓度至5×10⁶个/ml；加入细胞表面标志物对应的抗体后孵育30min，再次洗涤重悬后，即可上机（流式细胞仪FACSCalibur，BD公司）检测。所用抗体包括下列细胞表面分子的抗体：CD90、CD105、CD73为阳性标记，CD45、CD34为阴性标记。具体结果参见表4，脐带间充质干细胞流式检测，结果见图2。

表4：脐带间充质干细胞表面标志物检测结果。

由表4可知：本实施例中组织小块所收获得的原代脐带间充质干细胞经两次传代培养后，仍符合国际细胞治疗协会关于间充质干细胞的标准：阳性表达率≥95%，阴性表达率≤2%；所获得的细胞可作为临床研究和应用的种子细胞。

步骤5、配制干细胞培养液，然后换用干细胞培养液继续培养干细胞，并收集干细胞培养上清。

1.配制干细胞培养液。

（1）取2ml的勃脉力A液，溶解注射用水溶性维生素（华瑞制药有限公司，批号：国药准字H32023002，规格0.5g/瓶）。

（2）将步骤（1）中的混合液、复方氨基酸注射液（北京费森尤斯卡比医药有限公司，批号：国药准字H19993345）、丙氨酰谷氨酰胺（华瑞制药有限公司，批号：国药准字H20058281）、人血白蛋白（华兰生物工程股份有限公司，批号：国药准字S19993024）、水解蛋白注射液（辽源市泓源制药有限公司，批号：H22026405）、微量元素注射液（华瑞制药有限公司，批号：国药准字H32023907）、勃脉力A液（上海百特医疗用品有限公司，批号：H20000475），按比例混匀，pH值为6.8-7.0，渗透压为310 mOsm/kg，即为干细胞培养液。干细胞培养液的配方比例，如表5所示。

（3）待脐带间充质干细胞生长到70%融合时，吸弃培养上清，用生理盐水清洗细胞一次，再用步骤（2）制备的干细胞培养液清洗，之后取干细胞培养液继续培养2天。

（4）持续观察细胞状态，2天后收集细胞培养上清，经细胞消化液（型号：ACCUTASE GMP，厂家Innovative Cell Technologies）消化后收集细胞，进行细胞分析。

表5：干细胞培养液配方比例。

由表5可知：用干细胞培养液来培养脐带间充质干细胞，2天后测定细胞活率，从第二组开始，干细胞活率保持在96.4%以上，其中第二组干细胞活率最高，为97.5%，且综合考虑价值，本发明选择第二组作为干细胞培养液的优选配方，即：复方氨基酸注射液20ml、注射用水溶性维生素0.25g、丙氨酰谷氨酰胺1ml、人血白蛋白20ml、水解蛋白注射液20ml、微量元素注射液1ml、勃脉力A液136ml。

（2）应用ELISA方法，测定脐带间充质干细胞注射液分泌因子的浓度。

选择测定干细胞因子（SCF）、表皮生长因子（EGF）、血管内皮生长因子（VEGF）、碱性成纤维细胞生长因子（bFGF）、血小板源性生长因子A（PDGF-A）、白细胞介素6（IL6）、白细胞介素1（IL1）、肝细胞生长因子（HGF）、肿瘤坏死因子β3（TNF-β3）、粒细胞集落刺激因子（GM-CSF）的浓度，具体步骤如下。

（1）取出酶标板，依照次序对应分别加入50μL的细胞因子标准品于空白孔中作为阳性对照；分别标记样品编号，加入50μL步骤5制备的干细胞培养上清于空白孔中；在样品孔中加入10μL的生物素标记液；在标准品孔和样品孔中加入50μL的酶标记溶液。

（2）37℃孵育60min；洗板机清洗5次，每次静置20s；每孔加入底物A、B液各50μL；37℃避光孵育反应15 min；每孔加入50μL的H₂SO₄终止液，终止反应。

（3）每份标本设3个重复孔，用全自动酶标仪测450nm处吸光度(A)值，取其平均值，根据所绘制的标准曲线，计算出细胞因子含量，结果如表6所示。

白蛋白生理盐水和干细胞培养液，各10ml，分别培养脐带间充质干细胞2天，然后收集培养上清，其细胞因子含量比较结果如表6所示。

表6：细胞因子含量比较（单位：pg/mL）。

由表6可知：对所选取的10个细胞因子含量的测定，可知应用干细胞培养液培养的干细胞与白蛋白生理盐水培养相比，其培养上清里的细胞因子含量提高了2-4倍。因此，利用本发明所提供的干细胞培养液培养干细胞，可大幅提高获取细胞因子的产量。

步骤6、利用收集的干细胞上清，制备干细胞注射液。

（1）将收集的细胞上清经0.22μm滤膜过滤，收集滤液，即为干细胞注射液。

（2）细菌学鉴定，经革兰氏阴性及革兰氏阳性菌检测，结果均呈阴性。

（3）应用凝胶法进行内毒素检测，每1ml中含内毒素量0.2EU，符合国家药典对注射液的要求0.5EU。

使用该干细胞注射液直接应用于卵巢早衰患者的人体静脉注射，每月注射4次，剂量为200ml每人/次，连续注射2月，潮热多汗、阴道干涩、性欲下降等绝经前后症状的卵巢早衰症状得到明显改善，潮热多汗现象消失，阴道分沁物正常，性欲恢复正常。