一、技术领域
本发明涉及一种caco-2和huvec细胞共培养体系的构建方法，属于生物技术领域。
二、
背景技术：
人结肠癌细胞(humancolonadenocarcinomacelllines，简称caco-2细胞)具有与小肠上皮细胞相同的微绒毛结构和紧密连接，含有与小肠刷状缘上皮相关的代谢酶系、糖类、氨基酸、p450同工酶及各种主动转运的载体，是用于研究肠道吸收转运机制的经典模型。
人脐静脉血管内皮细胞(humanumbilicalveinendothelialcells，简称huvec)是从正常人体脐带分离得到的静脉血管内皮细胞，含有大量的细胞质内含物、平滑肌肌动球蛋白、abg抗原，具有多种生理功能，能产生和分泌许多生物活性物质，在维持血管舒缩，抗凝血等方面起重要作用，是循环系统和内皮组织生理、药理研究中广泛应用的细胞模型。
生物利用度(bioavailability)广义说包括消化、吸收、代谢、分布、排泄以及发挥的生物活性(bioactivity)，而狭义的生物利用度是仅指营养物质被机体吸收进入循环的相对量和速率，应是生物吸收率(bioaccessibility)。通常人们采用caco-2肠道细胞研究药物的生物利用，然而这仅仅反映的是肠道的吸收转运机制，忽略了药物在体内代谢后真正达到的生理作用。生物利用首要的是吸收，但最关键的还是保证其在体内发挥生物活性作用。因此，需要一种既可以反映吸收又可以反映生理活性的细胞模型来研究生物利用度。
细胞共培养技术是将两种或多种的细胞共同培养于同一环境中，由于具有更好地反映体内环境的优点，这种方法被广泛应用于现代细胞研究中。细胞共培养体系主要通过两种方式建立：①接触共培养体系，即将两种细胞同时或分别接种于同一载体上，不同种类的细胞之间直接接触；②非接触共培养体系，即将两种细胞分别接种于不同的载体上，然后将这两种载体置于同一培养环境之中，使不同种类的细胞共用同一种培养体系而不直接接触。细胞共培养体系模拟细胞间相互作用，包括分泌生长因子发挥作用，可以用于诱导细胞分化、维持细胞功能和活力、调控细胞增殖、促进早期胚胎发育和提高代谢物产量。huvec/纤维母细胞共培养体系用于研究花青素对血管生成的影响，huvec/jurkat细胞共培养体系用于研究葡萄籽原花青素对t细胞与内皮细胞的粘附特性。尚未见把研究吸收的caco-2细胞模型与研究药理功能的huvec细胞模型结合起来全面反映药物生物利用度的体外细胞模型方面的报道。
三、
技术实现要素：
技术问题本发明主要是涉及一种caco-2和huvec细胞共培养体系的构建方法，该共培养体系可以提供一种反映药物生物利用度的体外细胞模型。
技术方案本发明包括了以下步骤：
1)将25～40代的caco-2细胞用dmem培养基(含10％胎牛血清、1％非必需氨基酸、1％谷氨酰胺、100u/ml青霉素、100μg/ml链霉素，ph7.4)于37℃、5％co2环境培养，将对数生长期caco-2细胞接种到transwell板上层，培养至细胞完全分化，采用电位仪监测caco-2细胞层的电阻值teer大于550ω·cm2。
2)将2～6代的huvec细胞用dmem培养基(含10％胎牛血清、100μg/ml血管内皮细胞生长因子、2％青霉素-链霉素双抗液，ph7.4)于37℃、5％co2环境培养，将对数生长期huvec细胞接种到transwell板下层，至细胞长满80～90％。
3)将分化完全的caco-2细胞transwell上层小室插入到培养好的huvec细胞transwell下层小室中，微调整dmem培养基(含10％胎牛血清、1％非必需氨基酸、1％谷氨酰胺、100μg/ml血管内皮细胞生长因子、2％青霉素-链霉素双抗液，ph7.4)，于37℃、5％co2环境非接触共同培养。
有益效果
本发明旨在构建一种caco-2/huvec细胞共培养体系，用于提供一种反映药物生物利用度的体外细胞模型。
传统的caco-2细胞模型适用于肠道吸收转运机制与代谢研究，仅反映肠道吸收代谢，不考虑体内活性。传统的huvec细胞模型适用于循环系统和内皮组织生理、药理研究，仅反映活性机理，不考虑体内消化吸收与代谢。本发明打破单一研究吸收代谢或生理活性的固有思路，把研究吸收的caco-2模型与研究药理功能的huvec细胞结合起来，采用非接触式共培养方式搭建caco-2/huvec共培养体系。通过微调整共培养所用的dmem培养基，既适于caco-2生长，又适于huvec生长。共培养体系包含两种细胞的吸收转运载体和代谢酶系、与生理活性相关因子与酶系，此外两种细胞可以通过transwell跨膜交换胞外分泌物质。caco-2模仿肠道层，huvec模拟循环系统血管层，适宜用来研究物质的肠道与循环系统的吸收转运机制、代谢情况及生理活性。该体系能够同时研究药物的吸收代谢和生理活性，更好地模拟了药物经肠道吸收代谢后在循环系统的药理作用，全面反映生物利用，提供了一种更真实反映药物生物利用度的体外细胞模型。
附图说明
图1transwell非接触式共培养示意图
四、具体实施方式
下面结合具体实施例对本发明作进一步说明：
实施例1
将25～40代的caco-2细胞用dmem培养基(含10％胎牛血清、1％非必需氨基酸、1％谷氨酰胺、100u/ml青霉素、100μg/ml链霉素，ph7.4)于37℃、5％co2环境培养，隔天换液，每3天用0.25％胰酶/0.53mmol/ledta溶液消化细胞，按1∶3的比例传代。将对数生长期细胞按1×105/ml接种到24孔transwell板上层，培养至21天，用电位仪测caco-2细胞层的电阻值teer大于550ω·cm2，细胞完全分化。将2～6代的huvec细胞用dmem培养基(含10％胎牛血清、100μg/ml血管内皮细胞生长因子、2％青霉素-链霉素双抗液，ph7.4)于37℃、5％co2环境培养，隔天换液，用0.25％胰酶/0.1％edta溶液消化细胞，按1∶3的比例传代。将对数生长期细胞按1×105/ml接种到24孔用明胶包被好的transwell板下层，至细胞长满至细胞长满80～90％。分化完全的caco-2细胞transwell上层小室插入到培养好的huvec细胞transwell下层小室中，微调整dmem培养基(含10％胎牛血清、1％非必需氨基酸、1％谷氨酰胺、100μg/ml血管内皮细胞生长因子、2％青霉素-链霉素双抗液，ph7.4)，于37℃、5％co2环境非接触共同培养，mtt法检测细胞存活率大于95％，caco-2/huvec细胞共培养体系构建完成，用于研究蓝莓花青素经肠道吸收后在血管内皮细胞中的生物利用度。