本发明涉及干细胞培养
技术领域：
，尤其涉及一种细胞培养液及其应用和诱导骨骼肌干细胞向神经样细胞分化的方法。
背景技术：
：中枢神经系统,损伤后神经功能的恢复非常困难，主要原因是脑内神经元的再生能力极差。目前研究证明脑内虽然有神经干细胞存在，且能分化成神经元和神经胶质细胞，但是由于神经干细胞存在的部位很局限，数量也非常少，故将其用于神经元损伤修复还是非常困难的。随着干细胞领域的研究不断深入，发现其他部位的干细胞也可以分化成神经细胞。将胚胎神经细胞或脐血干细胞移植到受损伤的鼠脑内，可以适度改善其神经功能，但是由于伦理道德，免疫排斥等因素限制了这些干细胞在临床上的广泛应用。骨髓间充质干细胞可在自体获得且能在体外稳定扩增，并在体外能诱导分化成神经细胞，有望成为神经系统疾病移植治疗的种子细胞。但是目前诱导分化而来的神经样细胞还不能有效稳定地表达神经细胞特性，此类神经样细胞是否具备真正神经元的功能，仍然存在争议，且从正常人体内抽取骨髓，也会给供者造成一定程度的身体伤害。骨骼肌肌源性干细胞(muscle-derivedstemcells，MDSCs)是成年动物或人肌肉组织中特有的干细做为中胚层起源的一种成体间充质干细胞，具有自我更新能力和多项分化的潜能，并且，肌肉来源的细胞，取材方便、肌肉组织中细胞含量大、增值速度快。研究表明，MDSCs可在体外分化为血细胞、骨细胞、内皮细胞等系的细胞，有研究发现，通过体外诱导的方法也能将MDSCs诱导分化为神经细胞和神经胶质细胞。骨骼肌干细胞这种功能特性极大地吸引了来自基础医学和临床医学的研究者，给基础科学的研究者们提供了一种研究发展生物学的模式，骨骼肌干细胞所具有的修复、替代和再生能力也为临床医学提供了一个发展新疗法的机会。但是，目前的培养方法中，骨骼肌干细胞向神经样细胞的转化效率仍非常低，亟待研究开发新的促进骨骼肌干细胞向神经样细胞分化的方法。技术实现要素：有鉴于此，本发明要解决的技术问题在于提供一种细胞培养液及其应用和诱导骨骼肌干细胞向神经样细胞分化的方法本发明提供的细胞培养液能够促进骨骼肌干细胞向神经样细胞分化，其分化周期短，分化效率高。本发明提供的细胞培养液，包括基础培养液、FBS、B27、BDNF、bFGF和NGF。胎牛血清(fetalcalfserum，FBS)是血清中的一种，能够提供维持细胞指数生长的激素，基础培养基中没有或量很少的营养物，以及主要的低分子营养物。B27是一种细胞培养添加剂，用于海马神经元和其他中枢神经系统(CNS)神经元的生长和保持其短期或长期活性。脑源性神经营养因子(brainderivedneurophicfactor,BDNF)是在脑内合成的一种蛋白质，它广泛分布于中枢神经系统内，在中枢神经系统发育过程中，对神经元的存活、分化、生长发育起重要作用,并能防止神经元受损伤死亡、改善神经元的病理状态、促进受损伤神经元再生及分化等生物效应，而且也是成熟的中枢及周围神经系统的神经元维持生存及正常生理功能所必需。碱性成纤维细胞生长因子(fibroblastgrowthfactor-basic，bFGF)其主要生物学作用有：作为血管生长因子；促进创伤愈合与组织修复；促进组织再生；参与神经再生等。神经生长因子(Nervegrowthfactor,NGF)神经生长因子可以调节周围和中枢神经元的生长发育，维持神经元的存活。本发明利用FBS、B27、BDNF、bFGF和NGF诱导骨骼肌干细胞分化为神经样细胞。诱导获得的细胞不仅具有了神经细胞的典型形态，并表达神经元标志物：神经巢蛋白(Nestin)、神经元特异性烯醇化酶(neuronspecificenolase，NSE)、神经胶质细胞标志物胶质纤维酸性蛋白(glialfibrilamentacidicprotein，GFAP)；表明骨骼肌干细胞保留了跨胚层分化为非间充质细胞的能力，可跨胚层分化为神经元样细胞。本发明提供的培养基提高了骨骼肌干细胞向神经样细胞分化的分化率并缩短分化的时间。实验表明，以本发明提供的培养液诱导骨骼肌干细胞，24小时后即可见部分细胞贴壁并有短小突起伸出，3天后可见大部分细胞贴壁生长，形态不规则，突起不断增粗和伸长，1周后分化成形态不一的、分散成片的多突起星状细胞和神经元样细胞，突起互相交织成网状。对各组细胞的分化率进行计算，结果显示实验组细胞的分化率显著高于对照组，(p<0.05，或p<0.01)。在本发明的实施例中，FBS的体积分数为10％；B27的体积分数为5％。在本发明的实施例中，BDNF的浓度为10ng/mL～30ng/mL；bFGF的浓度为10ng/mL～30ng/mL；NGF的浓度为10ng/mL～30ng/mL。在一些实施例中，细胞培养液包括基础培养基、体积分数为10％的FBS、体积分数为5％的B27、浓度为10ng/mL的BDNF、浓度为10ng/mL的bFGF和浓度为10ng/mL的NGF。在一些实施例中，细胞培养液包括基础培养基、体积分数为10％的FBS、体积分数为5％的B27、浓度为20ng/mL的BDNF、浓度为20ng/mL的bFGF和浓度为20ng/mL的NGF。在一些实施例中，细胞培养液包括基础培养基、体积分数为10％的FBS、体积分数为5％的B27、浓度为30ng/mL的BDNF、浓度为30ng/mL的bFGF和浓度为30ng/mL的NGF。在一些具体实施例中，基础培养基为DMEM/F12。本发明所用的基础培养液可为自制也可为购买获得，本发明对此不做限定，其实施皆在本发明的保护范围之内。本发明采用的人干细胞无血清培养基为DMEM/F12无血清培养液。本发明提供的培养液中不含有抗生素，而是通过更加适宜的培养条件，促进骨骼肌干细胞向神经样细胞的分化，增强目标细胞的生长势，降低感染风险。本发明提供的细胞培养液在诱导骨骼肌干细胞向神经样细胞分化中的应用。本发明还提供了诱导骨骼肌干细胞向神经样细胞分化的方法，骨骼肌干细胞以基础培养基培养至70％～80％融合后以本发明提供的细胞培养液诱导。在本发明的实施例中，诱导的时间为7d。在本发明的实施例中，骨骼肌干细胞为3～5代的骨骼肌干细胞。一些实施例中，骨骼肌干细胞为第3代的骨骼肌干细胞。所述诱导骨骼肌干细胞向神经样细胞分化的容器为无菌六孔板，优选的，所述六孔板经多聚赖氨酸处理。本发明中，骨骼肌干细胞的分离方法包括：步骤1：将骨骼肌破碎后，经DispaseII和I型胶原酶消化后，以胰蛋白酶消化，获得细胞以培养基重悬；步骤2：差速贴壁法对步骤1中所得细胞进行分离，获得骨骼肌干细胞。在本发明中，骨骼肌为颞肌。差速贴壁具体为：将细胞悬液接种于培养瓶中，放置于37℃、体积分数为5％的CO2培养箱中培养。2h后的贴壁细胞记为PP1，其中未贴壁细胞吸出后移入新的培养瓶中进行培养，并记为PP2。24h后将PP2中未贴壁的细胞吸出后移入新的培养瓶中培养，标记为PP3。以后每24h进行差速贴壁培养，直到获得PP6，记为骨骼肌干细胞。骨骼肌干细胞培养3天后换液，以后每2-3天换液，待细胞生长融合至70％-80％后传代培养。骨骼肌干细胞(MDSCs)原代培养8-10天，待细胞长满80-90％，用吸管吸弃旧培养液，加入0.25％胰蛋白酶-EDTA，消化1-3分钟，镜下观察细胞收缩变圆时，加入含20％FBS的DMEM/F12培养液终止消化，收集细胞，1000r/min离心5min，弃上清。加入适量含20％FBS的DMEM/F12培养液，进行细胞记数，按8×104cell/mL密度接种于培养皿中进行传代培养，5％CO2培养箱37℃培养，每隔2-3天换液一次。在本发明中，诱导骨骼肌干细胞向神经样细胞分化前，骨骼肌细胞以基础培养基培养的接种密度为1×104cell/mL。基础培养基为DMEM/F12培养液。本发明提供的培养液中包括基础培养液、FBS、B27、BDNF、bFGF和NGF。本发明提供的培养液能够作为骨骼肌干细胞成神经样细胞分化的诱导培养液。提高了骨骼肌干细胞向神经样细胞分化的比例并缩短分化的时间。实验表明，以本发明提供的培养液诱导骨骼肌干细胞，24小时后即可见部分细胞贴壁并有短小突起伸出，3天后可见大部分细胞贴壁生长，形态不规则，突起不断增粗和伸长，1周后分化成形态不一的、分散成片的多突起星状细胞和神经元样细胞，突起互相交织成网状。诱导7天后，对各组细胞的分化率进行计算，结果显示实验组细胞的分化率显著高于对照组，(p<0.05，或p<0.01)。附图说明图1示MDSCsP2代形态；其中，图1-a的放大倍数为40×；图1-b的放大倍数为100×。具体实施方式本发明提供了一种细胞培养液及其应用和诱导骨骼肌干细胞向心肌样细胞分化的方法，本领域技术人员可以借鉴本文内容，适当改进工艺参数实现。特别需要指出的是，所有类似的替换和改动对本领域技术人员来说是显而易见的，它们都被视为包括在本发明。本发明的方法及应用已经通过较佳实施例进行了描述，相关人员明显能在不脱离本
发明内容、精神和范围内对本文的方法和应用进行改动或适当变更与组合，来实现和应用本发明技术。下面结合实施例，进一步阐述本发明：实施例1MDSCs的分离和传代1、取材：取成人正常颞肌标本(取自于开颅手术患者)，用含双抗的PBS缓冲液冲洗后转入无菌培养皿中，用眼科剪剪成1mm3左右大小的碎块，然后移入50ml离心管中，PBS缓冲液吹打冲洗3次，静置1分钟后弃上层液及漂浮组织。2、酶解：向上述获得的肌肉碎块加入2倍的体积的混合酶，包括2.4u/mlDispaseII、1％I型胶原酶，2.5mmol/LCaCl2，混匀后置37℃恒温摇床中消化60min左右，直到试管中的肌肉碎块消化为肌糜，肉眼看不到肌块。消化结束后，1000r/min离心5min，弃上清。加入2～3倍体积的0.25％胰蛋白酶-EDTA，混匀后置37℃恒温摇床中消化15min，消化结束后，1000r/min离心5min，弃上清。加入适量PBS重悬，1000r/min离心5min，弃上清。加入约3倍肌糜体积的PBS反复吹打后经200目滤网过滤，收集的滤液1000r/min离心5min，弃上清。生长培养基(含20％FBS的DMEM/F12)重悬细胞。3、分离与纯化：采用差速贴壁分离技术对MDSCs进行分离。将细胞悬液接种于25ml培养瓶中，放置于37℃、体积分数为5％的CO2培养箱中培养。2h后的贴壁细胞记为PP1，其中未贴壁细胞吸出后移入新的培养瓶中进行培养，并记为PP2。24h后将PP2中未贴壁的细胞吸出后移入新的培养瓶中培养，标记为PP3。以后每24h进行差速贴壁培养，直到获得PP6，期间根据细胞的生长情况进行换液。PP6培养3天后换液，以后每2-3天换液，倒置显微镜下观察记录细胞生长以及形成集落后每日扩增情况，待细胞生长融合至70-80％后传代培养。4、MDSCs的传代培养：MDSCs原代培养8-10天，待细胞长满80-90％，用吸管吸弃旧培养液，加入适量0.25％胰蛋白酶-EDTA，消化1-3分钟，镜下观察细胞收缩变圆时，立即加入适量含20％FBS的DMEM/F12培养液终止消化，收集细胞，1000r/min离心5min，弃上清。加入适量含20％FBS的DMEM/F12培养液，进行细胞记数，按8×104cell/mL密度接种于培养皿中进行传代培养，5％CO2培养箱37℃培养，每隔2-3天换液一次。5、MDSCs的鉴定:1)细胞爬片制作：将无菌盖玻片放置于6孔培养板中，对数生长期细胞制备成细胞悬液，按5×104cell/mL密度接种于6孔培养板中，每孔2ml，生长培养基为含20％FBS的DMEM/F12，培养24-48小时，使细胞生长于盖玻片上。2)Desmin、Sca-1免疫细胞化学染色:将放有盖玻片6孔培养板内培养液吸出，PBS缓冲液漂洗细胞铺片5分钟，重复3次。用4％多聚甲醛固定15分钟，PBS缓冲液漂洗后甩干，中性树胶粘附于载玻片上，4℃冰箱过夜。滴加3％过氧化氢孵育15分钟，消除内源性过氧化物酶的活性，PBS缓冲液漂洗5分钟，重复3次。分别滴加一抗兔抗人结蛋白(Desmin)抗体(1:200稀释)、兔抗人Sca-1抗体(1:100稀释)，37℃湿盒内孵育1小时，4℃过夜。次日取出后PBS缓冲液漂洗5分钟，滴加二抗，37℃湿盒内孵育40分钟，PBS缓冲液漂洗5分钟，重复3次，滴加新鲜配制的DAB溶液显色5-10分钟，在光镜下观察，用自来水进行冲洗终止显色。将甩干片子后，苏木素复染1分钟，分化返蓝，梯度酒精脱水，二甲苯透明，中性树胶封片。在镜下观察，胞膜和/或胞浆内出现棕黄色颗粒，说明成功分离获得MDSCs(图1为MDSCsP2代形态图)。实施例2MDSCs的分化各受试组培养液的配方如表1：表1各组分化诱导液配方组别基础培养基FBSB27BDNFbFGFNGF实验组1DMEM/F1210％5％10ng/ml10ng/ml10ng/ml实验组2DMEM/F1210％5％20ng/ml20ng/ml20ng/ml实验组3DMEM/F1210％5％30ng/ml30ng/ml30ng/ml对照组1DMEM/F1210％5％------对照组2DMEM/F1210％5％20ng/ml----对照组3DMEM/F1210％5％--20ng/ml--对照组4DMEM/F1210％5％----20ng/ml选取第3代MDSCs，按1×104cell/mL密度接种于放有多聚赖氨酸处理的无菌盖玻片的六孔板中，每孔加入2ml含10％FBS的DMEM/F12培养基。24h后更换表1中各组对应的培养液，在37℃、5％CO2、饱和湿度静置培养，每隔2～3天更换新的培养液。观察培养过程中细胞形态：24小时后即可见部分细胞贴壁并有短小突起伸出，3天后可见大部分细胞贴壁生长，形态不规则，突起不断增粗和伸长，1周后分化成形态不一的、分散成片的多突起星状细胞和神经元样细胞，突起互相交织成网状。培养7天后取出细胞爬片,按照免疫组化染色试剂盒的说明书进行Nestin、NSE、GFAP的免疫组化染色,DAB显色。将放有盖玻片6孔培养板内培养液吸出，PBS缓冲液漂洗细胞铺片5分钟，重复3次。用4％多聚甲醛固定15分钟，PBS缓冲液漂洗后甩干，中性树胶粘附于载玻片上，4℃冰箱过夜。滴加3％过氧化氢孵育15分钟，消除内源性过氧化物酶的活性，PBS缓冲液漂洗5分钟，重复3次。分别滴加适量一抗(Nestin、NSE、GFAP)，37℃湿盒内孵育1小时，4℃过夜。次日取出后PBS缓冲液漂洗5分钟，滴加二抗，37℃湿盒内孵育40分钟，PBS缓冲液漂洗5分钟，重复3次，滴加新鲜配制的DAB溶液显色5-10分钟，在光镜下观察，用自来水进行冲洗终止显色。将甩干片子后，苏木素复染1分钟，分化返蓝，梯度酒精脱水，二甲苯透明，中性树胶封片。对各组所得细胞经免疫组化检测后，对Nestin、NSE、GFAP染色的细胞按公式：诱导分化率＝染色阳性细胞数/细胞总数×100％进行计数，计算出各组的分化率进行比较。每组取样3次，分别检测后统计数据。统计结果如表2。表2各组细胞分化率(*，**表示p<0.01)表2结果显示，对照组1细胞Nestin、NSE、GFAP均未见着色，分化率为零。实验组2中细胞Nestin、NSE、GFAP着色最深，阳性表达率极显著高于各对照组，显著高于实验组1和实验组3(p<0.05)；实验组1和实验组3中细胞Nestin、NSE、GFAP着色较深，阳性表达率显著高于各对照组(p<0.05)。实验组2中细胞分化率68.93±0.56％(p<0.01)，说明本发明所用分化培养基能有效的诱导MDSCs向神经元样细胞分化。以上仅是本发明的优选实施方式，应当指出，对于本
技术领域：
的普通技术人员来说，在不脱离本发明原理的前提下，还可以做出若干改进和润饰，这些改进和润饰也应视为本发明的保护范围。当前第1页1 2 3