本发明涉及放线菌次级代谢产物制备活性化合物领域，具体涉及一种开环星孢菌素衍生物及其制备方法以及在制备抗自身免疫性疾病药物和抗肿瘤药物中的应用。
背景技术：
1977年第一个星孢菌素类staurosporine(sta)是从土壤放线菌中分离得到的吲哚咔唑类生物碱。sta为强pkc抑制剂(ic50＝2.7nm)，通过与蛋白激酶的相互作用、结合，阻碍了生理状况下atp与蛋白激酶的结合，因此具有抑制该酶活性的能力，影响细胞周期的正常过程。但由于它没有特异性，并且在针对癌细胞发挥作用时，也干扰了正常细胞的分裂，作为临床开发应用毒性太大。
于是，根据其抗癌机理，人们分离并合成了大量此类化合物，由此吸引了许多有机化学家和药物化学家们开始研究其结构以及生物学活性。口服lestaurtinib(结构式如上式(2))已经于2006年由fda批准作为治疗急性髓细胞白血病的孤儿药；结构修饰得到的星孢菌素衍生物pkc-412(结构式如上式(3))，于2017年批准用于治疗最新确诊的flt3突变(以一种fda批准的检测方法进行检测)呈阳性及适合标准诱导和巩固化疗的急性髓性白血病成年患者。
上述实例表明，星孢菌素类化合物具有广阔的成药前景；因此，寻找更多的结构新颖的星孢菌素衍生物成为一种必然的趋势。
技术实现要素：
本发明提供了开环星孢菌素衍生物及其制备方法和应用，该开环星孢菌素衍生物是由放线菌通过大米发酵及提纯后得到的天然产物，具有较好的pkcθ激酶抑制活性和抗肿瘤活性，可用于制备抗自身免疫性疾病药物和抗肿瘤药物。
具体技术方案如下：
一种开环星孢菌素衍生物，其结构式如式(i)或(ii)所示：
其中，r1＝nh2、nhch3、nhcho或nhcoch3；r2＝och3、ocho或ococh3。
作为优选，所述开环星孢菌素衍生物，为以下化合物：
进一步地，所述开环星孢菌素衍生物的制备方法，由特定放线菌发酵后产生，并通过分离纯化后获得。
具体开环星孢菌素衍生物的制备方法，包括以下步骤：
(1)将放线菌接种于高氏一号培养基中，摇床培养，获得种子液；所述放线菌为链霉菌(streptomycessp.)ciccno.10513；
(2)将所述种子液接种于大米培养基中，静置培养，经萃取过滤后，获得粗提物；
(3)所述粗提物经分离纯化获得式(i)或(ii)结构的开环星孢菌素衍生物。
本发明从链霉菌(streptomycessp.)ciccno.10513的次级代谢产物中分离得到3种结构新型的开环星孢菌素衍生物，该类开环星孢菌素衍生物的糖基部分都是开环的。
该类衍生物的成功提取为该类化合物的开发提供了新的资源。同时，放线菌在实验室环境下易于培养，可通过大规模发酵的方式富集该化合物。
作为优选，步骤(1)中，所述摇床培养的条件为：26～30℃下，150～250rpm摇床中培养4～6天；更优选，在28℃下，180rpm的摇床中培养。
链霉菌(streptomycessp.)ciccno.10513购买自位于北京市朝阳区酒仙桥中路24号院6号楼的中国工业微生物菌种保藏管理中心(cicc)。
作为优选，步骤(2)中，所述大米培养基由大米和海盐水配制而成；所述大米的质量与海盐水的体积之比为1g∶1～2ml；所述海盐水的质量浓度为25％；所述种子液的接种量为：每40g大米接种8～12ml种子液；所述静置培养的条件为：25～35℃，静置培养60～90天。
作为优选，步骤(2)中，所述萃取采用乙酸乙酯作为萃取剂，具体为：将发酵产物浸泡在乙酸乙酯中，过滤除去菌丝体，收集滤液，再经减压浓缩后得到粗提物，为油状浸膏。
作为优选，步骤(3)中，所述分离纯化的方法，包括：
(a)采用乙酸乙酯萃取所述粗提物，得到萃取液；
(b)将所述萃取液浓缩后，经凝胶柱层析纯化，并用甲醇-水体系洗脱，得到洗脱产物；
(c)采用反相高效液相色谱分离所述洗脱产物，获得开环星孢菌素衍生物。
进一步优选，步骤(a)中，用与粗提物等体积的乙酸乙酯萃取至少一次；更优选为萃取三次。
进一步优选，步骤(b)中，采用甲醇体积比为20～100％的甲醇-水体系进行梯度洗脱。
进一步优选，步骤(c)中，所述反相高效液相色谱的条件为：以十八烷基键合硅胶为填料，流动相为40～100％的甲醇/水体系，以10ml/min进行等度洗脱，洗脱时间为40min；最终收集包含开环星孢菌素衍生物的洗脱产物。
本发明分别采用前列腺癌细胞pc3和结肠癌细胞sw620，以及蛋白激酶pkcθ对经上述方法制备得到的开环星孢菌素衍生物进行活性评价，结果显示：具有式(i)或式(ii)结构的星孢菌素类化合物对前列腺癌细胞pc3、结肠癌细胞sw620和激酶pkcθ均具有较好的活性抑制作用。
上述实验说明：开环星孢菌素衍生物可用于制备抗肿瘤药物；例如：抗前列腺癌、结肠癌、急性白血病、慢性白血病、淋巴癌、乳腺癌、肺癌等癌症的药物，尤其是抗前列腺癌和结肠癌的药物。
与此同时，开环星孢菌素衍生物也可作为pkcθ激酶的活性抑制剂，以及用于制备抗器官移植引起的排斥反应的药物和治疗由pkcθ激酶引起的自身免疫性疾病的药物。该自身免疫性疾病包括：类风湿性关节炎、多发性硬化症、系统性红斑狼疮、炎性肠病等。
与现有技术相比，本发明具有如下优点：
(1)本发明提供了几种结构新颖的开环星孢菌素衍生物，该衍生物是由放线菌通过大米发酵及提纯后得到的产物，其结构为天然产物中首次发现；该开环星孢菌素衍生物对前列腺癌细胞、结肠癌细胞和激酶pkcθ均具有较好的活性抑制作用，可用于制备抗器官移植引起的排斥反应的药物、治疗各种自身免疫性疾病的药物和抗肿瘤药物。
(2)本发明公开的开环星孢菌素衍生物的制备方法，操作简单，易于扩大生产，具有较好的应用前景。
具体实施方式
菌种来源
放线菌为链霉菌(streptomycessp.)，保藏号为ciccno.10513，购买自位于北京市朝阳区酒仙桥中路24号院6号楼的中国工业微生物菌种保藏管理中心(cicc)，订购网址：http://www.china-cicc.org/。
培养基
高氏一号液体培养基：以发酵培养基1l计，可溶性淀粉20g，kno31g，
k2hpo40.5g，mgso4·7h2o0.5g，nacl0.5g，feso4·7h2o0.01g，加水至1l，调ph7.2。
高氏一号固体培养基：以发酵培养基1l计，可溶性淀粉20g，kno31g，k2hpo40.5g，mgso4·7h2o0.5g，nacl0.5g，feso4·7h2o0.01g，12g琼脂，加水至1l，调ph7.2。
大米培养基：大米和海盐水按以下质量体积比：大米40g，25％的海盐水60ml，即大米∶25％的海盐水＝40g∶60ml。
实施例1开环星孢菌素衍生物1～3的制备
1、种子液
将上述链霉菌接种于含有250ml液体培养基的500ml锥形瓶中，每瓶含250ml高氏一号液体培养基，在摇床中28℃下以180rpm振荡培养3天，获得种子液。
2、发酵
以每瓶接种10ml的量将上述种子液接种到大米发酵培养基(由以下重量组分制成：大米40g，25％的海盐水60ml)中，28℃静置培养90天后终止发酵。
3、粗提
每瓶固体发酵物用ea(乙酸乙酯)约200ml浸泡过夜，三层纱布过滤除去菌丝体，收集滤液，减压浓缩得粗提物(油状浸膏)。
4、分离纯化
将上述粗提物用等体积乙酸乙酯萃取3次，所得萃取液浓缩。将所得乙酸乙酯部分采用lh-20凝胶柱分离，洗脱方法为使用甲醇体积比为20％～100％的甲醇-水体系梯度洗脱，使用薄层色谱(tlc)分析含有新化合物的馏分，合并。
所得馏分用反相高效液相色谱分离(agilentpursuitc-18(10μm，21.2×250mm)色谱柱，检测波长318nm)，采用的流动相为体积比为40％～100％的甲醇-水体系以10ml/min等度洗脱，时间为40min，分离获得含有新化合物的馏分，旋转蒸发仪上回收溶剂，即得所述开环星孢菌素衍生物。
本实施例制备的开环星孢菌素衍生物1为黄色固体，高分辨质谱在hresimsm/z455.1713给出[m+h]+峰，提示分子量为454，结合1h、13c-nmr数据(表1)分子式为c26h22n4o4，不饱和度为18。鉴定化合物为7-oxo-holyrina。具体结构如下：
表1nmr数据(溶剂cd3od)
开环星孢菌素衍生物2为黄色固体，高分辨质谱在hresimsm/z505.1488给出[m+na]+峰，提示分子量为482，结合1h、13c-nmr数据(表1)分子式为c27h22n4o5，不饱和度为19。鉴定化合物为4′-n-formyl-7-oxo-holyrina。具体结构如下：
表2nmr数据(溶剂cd3od)
开环星孢菌素衍生物3为白色固体，高分辨质谱在hresimsm/z494.1696给出[m+na]+峰，提示分子量为482，结合1h、13c-nmr数据(表1)分子式为c27h25n3o5，不饱和度为18。鉴定化合物为3′-epi-5′-methoxy-k252d。具体结构如下：
表3nmr数据(溶剂dmso)
实施例2开环星孢菌素衍生物1～3(简称化合物1～3)的活性测试
1、化合物1～3的抗肿瘤活性实验
采用磺酰罗丹明b(sulforhodamineb，srb)比色法检测开环星孢菌素衍生物1～3对人前列腺癌细胞株pc3细胞和结肠癌细胞株sw620的增殖抑制作用。
取对数生长期的细胞，配置成5×104个/ml，以100μl/孔铺于96孔培养板，co2培养箱中培养24小时，取出培养板后于每孔中加入不同浓度的待测样品，每个浓度设3个复孔，加药完成后，置于co2培养箱中继续培养72小时后取出培养板，弃去培养液，每孔加入100μl4℃冰箱预冷的质量百分数10％的三氯醋酸(tca)固定，静置5分钟后，再将培养板移至4℃冰箱过夜。倒掉固定液，每孔用去离子水洗涤5遍，甩干，空气干燥。每孔加入70μlsrb溶液，室温25℃放置20分钟，去上清液，用质量百分数1％醋酸洗涤5次，空气干燥。结合的srb用100μl/孔10mmol/ltris碱液(ph＝10.5)振荡溶解。
置于酶标仪中测定各孔光吸收，测定波长为515nm。根据各孔od值计算药物对细胞增殖抑制率：抑制率＝[1－(od515给药孔/od515对照孔)]×100％，根据各浓度抑制率计算半数抑制浓度ic50。其结果如表4所示。
2、化合物1～3的激酶抑制实验
本实验采用384孔板，测定所得化合物1～3对pkcθ激酶的抑制活性，基于实时分辨荧光技术测定抑制作用。
将待测化合物配制所需浓度，由激酶缓冲液稀释，激酶、stk底物生物素、atp、终止标记物等按照试剂盒说明书配制相应浓度。酶反应阶段，加入4μl待测化合物，2μl激酶，2μlstl底物生物素，2μlatp在室温或37℃下孵育30min。检测阶段，加入5μlsa-xl665和5μlstkantibody-eu(k)，以乙二胺四乙酸(edta)为终止液，常温下孵育1h后采用hrtf测定在λ＝665和620nm下的荧光强度，根据相应信号强度比值计算得出各样品浓度下的抑制率，再根据各浓度抑制率计算对各激酶的半数抑制浓度ic50。其结果如表4所示。结果如下表4所示：
表4开环星孢菌素衍生物1～3对癌细胞和激酶的活性抑制作用(ic50/μm)
从上表4中结果可以看出，本发明提供的开环星孢菌素衍生物1～3能够较好的抑制前列腺癌细胞和结肠癌细胞生长，并且具有很好的pkcθ激酶抑制作用。
因此，开环星孢菌素衍生物1～3可用于制备抗肿瘤药物、抗器官移植引起的排斥反应的药物和治疗pkcθ激酶引起的自身免疫性疾病的药物；该自身免疫性疾病包括类风湿性关节炎、多发性硬化症、系统性红斑狼疮、炎性肠病等。